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方法文章

电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞

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DOI：

10.3791/63828

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2022年6月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了从小鼠肝脏中分离原代肝细胞，并通过电穿孔将CRISPR-Cas9以核糖核蛋白复合物和mRNA形式导入细胞，以破坏与遗传性肝代谢疾病相关的治疗靶基因的技术。所述方法在电穿孔后可实现高细胞存活率和高效的基因修饰水平。

摘要

本方案描述了一种快速高效分离原代小鼠肝细胞并随后通过电穿孔介导递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNPs）和mRNA的方法。采用三步逆行灌注法分离原代小鼠肝细胞，每只肝脏可获得高达50 × 106个细胞，细胞活力达>85%。本方案提供了肝细胞铺板、染色和培养的详细操作步骤。实验结果表明，通过绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞比例测定，电穿孔转染效率高达89%，且小鼠肝细胞保持适度的细胞活力，达>35%。

为验证该方法的实用性，将靶向羟苯基丙酮酸双加氧酶基因的 CRISPR-Cas9 体系通过电穿孔导入小鼠原代肝细胞，作为概念验证实验，旨在通过基因编辑破坏与肝源性遗传性代谢病（IMD）相关的治疗靶基因。结果显示，核糖核蛋白复合物（RNP）组的靶向编辑效率达到78%，高于mRNA组的47%。随后对肝细胞功能进行了评估 体外 使用白蛋白检测法表明，以核糖核蛋白复合物（RNPs）和mRNA形式递送CRISPR-Cas9在原代小鼠肝细胞中具有相当的细胞活力。该方案的一个有前景的应用是构建用于研究影响肝脏的人类遗传性疾病的鼠标模型。

引言

肝脏的先天性代谢缺陷病（IMD）是一类遗传性疾病，其特征是肝脏中参与代谢的关键酶缺乏，导致毒性代谢产物的积累。若不进行治疗，肝脏IMD将导致器官衰竭或过早死亡1,2。目前，肝脏IMD患者唯一的根治方法是原位肝移植，但由于供体器官来源有限以及术后免疫抑制治疗带来的并发症，该疗法的应用受到限制3,4。根据器官获取与移植网络（Organ Procurement and Transplantation Network）收集的最新数据，肝移植等待名单上的成年患者中仅有40%至46%能够获得移植器官，而12.3%的患者在等待期间死亡5。此外，所有罕见肝病中仅有5%拥有经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗方法6。显然，肝脏IMD迫切需要新的治疗手段。然而，开发新的治疗方法依赖于合适的疾病模型。

利用体外（in vitro）和体内（in vivo）系统模拟人类疾病，仍是开发有效疗法及研究肝脏先天性代谢疾病（IMDs）病理机制的障碍。获取患有罕见肝病患者的肝细胞十分困难7。动物模型对于理解疾病病理机制以及测试治疗策略至关重要。然而，一个难点在于难以利用携带致死性突变的胚胎建立模型。例如，尝试通过在Jag1基因5′端附近缺失5 kb序列的纯合子胚胎构建Alagille综合征（ALGS）小鼠模型时，导致胚胎早期死亡8。此外，通过胚胎干细胞基因编辑构建小鼠模型可能耗时且耗费资源9。最后，基因突变可能出现在靶组织以外的部位，引入混杂因素，从而妨碍对疾病本身的研究9。体细胞基因编辑可实现对肝组织更便捷的基因操作，并规避使用胚胎干细胞建模所面临的挑战。

电穿孔通过施加高电压电流使细胞膜通透化，从而将CRISPR-Cas9直接递送至细胞核，适用于多种细胞类型，包括对转染技术难以处理的细胞，如人胚胎干细胞、多能干细胞和神经元10,11,12。然而，细胞存活率低是电穿孔可能存在的缺点；优化操作流程可在实现高效递送的同时降低毒性13。最近一项研究证明，将CRISPR-Cas9组分电穿孔导入原代小鼠和人肝细胞是一种高效可行的方法14。ex vivo肝细胞电穿孔有望被用于构建人类肝脏先天性代谢疾病（IMDs）的新小鼠模型。

本方案提供了从小鼠肝脏中分离肝细胞并随后通过电穿孔导入CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物（包含Cas9蛋白与合成的单导RNA（sgRNA））或Cas9 mRNA与sgRNA组合，以实现高水平靶基因编辑的详细分步操作流程。此外，本方案还提供了在CRISPR-Cas9导入新鲜分离的小鼠肝细胞后，定量检测基因编辑效率、细胞活力及功能性的方法。

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方案

所有动物实验均按照克莱姆森大学机构动物护理和使用委员会的指南以及批准的方案进行。手术在8至10周龄的野生型C57BL/6J小鼠中实施，小鼠处于麻醉状态。

1. 动物手术

  1. 溶液与仪器的准备
    注意：灌注溶液和麻醉混合液的配方见材料表。
    1. 配制灌注溶液1（HEPES、EGTA 和 EBSS）、灌注溶液2（HEPES、EGTA、EBSS、CaCl2 和 MgSO4）以及灌注溶液3（溶液2 加 Liberase）。确保各溶液充分混匀。
    2. 将水浴锅设定为 42 °C，并在开始实验前至少预热 30 分钟，使灌注溶液1、2 和 3 均保持在水浴中。
      注意：灌注溶液1 和 2 可螯合钙离子并冲洗肝脏中的血液。灌注溶液3 含有消化酶 liberase，用于解离细胞外基质。
    3. 将 150 mL DMEM + 10% 胎牛血清（FBS）置于锥形管中，并置于冰上保存。
      注意：该培养基将在步骤 2.1 和 2.2 中分别用于从肝脏包膜中释放细胞以及洗涤分离的肝细胞。
    4. 将离心机设定为 4 °C。
    5. 将泵管两端浸入盛有 70% 乙醇的烧瓶中，循环乙醇三次，以对泵管进行灭菌。
    6. 用蒸馏水冲洗泵管并排空。
    7. 用预热的 30 mL 灌注溶液1 填充泵管，随后加入 8 mL 灌注溶液2。若泵管仍有空间，其余部分用灌注溶液3 填满。在更换不同灌注溶液时暂停泵，以避免将气泡引入管路中。
    8. 将多余的泵管置于 42 °C 水浴中，以保持灌注溶液温度。
    9. 将泵管末端置于盛有灌注溶液3 的锥形管中，并保持在水浴内。
      注意：此步骤可确保泵在灌注过程中持续吸入灌注溶液3。
  2. 动物准备
    1. 通过腹腔注射麻醉混合液对小鼠进行麻醉，剂量为 10–11.7 µL/g 体重。麻醉混合液的终浓度为 7.5 mg/mL 氯胺酮、0.25 mg/mL 乙酰丙嗪和 1.5 mg/mL 赛拉嗪。
    2. 监测小鼠呼吸，并检查其对疼痛无反应。待小鼠呼吸频率降至约 55–65 次/分钟，趾部受压无反应，尾部松弛下垂时，表明麻醉充分。此外，可通过轻触闭合眼睑内侧皮肤检查眼睑（眨眼）反射。若小鼠出现眨眼或眼肌抽动，应将整个麻醉混合液剂量增加 5–10 µL。
    3. 将小鼠仰卧位固定于操作台面，用针或胶带固定四肢（补充图 S1）。
    4. 用 70% 乙醇喷洒腹部，并用棉球擦干。
  3. 肝脏灌注
    1. 使用剪刀在腹部皮肤做 U 形侧切口，并从两侧扩大切口。
    2. 继续将皮肤切口向上延伸至肋弓。
    3. 用剪刀剪开腹膜，暴露腹腔至肋弓水平，注意避免损伤任何器官。用镊子背面或剪刀钝面将肠道移至右侧。辨认下腔静脉和门静脉（补充图 S1）。
    4. 启动泵，使预热的灌注溶液通过导管循环。
    5. 待系统中空气完全排出后停止泵，并移除导管。将连接导管的针头以 10°–20° 角插入下腔静脉。拔出针头，将导管沿静脉平行方向轻柔推入静脉内。
      ​注意：操作者应观察到导管内有回血，以确认导管正确插入静脉。
    6. 将管路连接至导管，注意不要进一步推进导管进入静脉。
    7. 以 2 mL/min 的流速启动泵。观察肝脏是否迅速变苍白，作为灌注成功的标志。
    8. 用剪刀剪开门静脉。
    9. 逐步将流速提高至 5 mL/min。
    10. 使用镊子或棉签定期在门静脉近剪开处施加压力，持续约 3 秒，以阻断回流，促进良好灌注。
    11. 当灌注溶液3 开始流动后，密切监测肝脏弹性。为判断肝脏是否软化，可用棉签或镊子轻压肝脏表面，观察是否形成压痕。注意避免过度灌注，以防细胞活力下降。
    12. 当肝脏软化（通常在约 30–50 mL 灌注溶液3 流过后）时，停止泵，移除导管，并小心分离肝脏。将肝脏放入盛有冰浴 DMEM + 10% FBS 培养基的 100 mm 培养皿中。小心切除胆囊，避免内容物溢出。轻轻晃动培养皿，以去除可能的血凝块。
    13. 将肝脏转移至另一盛有冰浴 DMEM + 10% FBS 培养基的新培养皿中。

2. 肝细胞分离

  1. 从肝包膜中释放细胞。
    1. 将培养皿置于冰上，用两把无菌镊子轻轻撕开肝脏各叶的包膜。使用细胞刮刀或镊子在培养基中轻轻搅动肝脏，以释放肝细胞。持续此操作，直至肝脏组织变得非常细小，悬液呈棕色且不透明。
    2. 从培养板中移除肝脏组织残余物，使用设置为低速的25 mL血清移液管，小心地将细胞悬液转移至预冷在冰上的50 mL锥形管中（配备有 100 μm 细胞筛
    3. 向培养皿中加入新鲜的冰冻 DMEM + 10% FBS 培养基，以冲洗并收集表面残留的细胞，并转移至 50 mL 锥形管中。重复此步骤，直至所有细胞均被收集。
  2. 洗涤并从非实质细胞中纯化肝细胞。
    1. 将收集在50 mL离心管中的细胞在50 × g 在 4 °C 低减速或不使用任何制动的情况下持续5分钟。
    2. 弃去含有碎片和非实质细胞的上清液，通过轻轻旋转离心管，用残留的上清液重悬沉淀。沉淀重悬后，加入 30 mL 新鲜的冰冻 DMEM + 10% FBS 培养基。
    3. 重复离心（步骤 2.2.1）和洗涤（步骤 2.2.3）三次。
    4. 将最终的细胞沉淀重悬于10 mL预冷的DMEM + 10% FBS培养基中。
      注意：重悬沉淀所用培养基的体积取决于沉淀的大小。如果沉淀明显小于15 mm，则使用1–5 mL预冷的DMEM + 10% FBS培养基。
  3. 细胞活力定量
    1. 在微量离心管中，加入 50 µL 0.4% 台盼蓝溶液 350 µL 肝细胞铺板培养基（PM）。然后，加入 100 µL 将细胞悬液进行最终1:5稀释，并反复吹打混匀。
    2. 使用血细胞计数板计数细胞密度和活力。计数过程中，将肝细胞悬液置于冰上，并将冰桶放在设定为30 rpm的轨道摇床上，以防止肝细胞沉淀。
    3. 如果细胞活力 <70%.
      1. 按9:1的比例将Percoll用10倍磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。
      2. 将肝细胞悬液与稀释后的Percoll按1:1比例混合。
      3. 200 × 离心 g 在 4 °C 10分钟
      4. 弃去含有死细胞的上清液。将沉淀物重悬于冰预冷的DMEM + 10% FBS培养基中。
      5. 再次计数细胞。
  4. 检测肝细胞的贴壁能力
    1. 将部分细胞以 0.5 × 10⁶ 个/mL 的密度接种于胶原蛋白 I 包被的 6 孔板中6 每毫升细胞数，使用 1.5 mL 预热的 PM。
    2. 将剩余细胞置于冰上，并在准备进行电穿孔前于摇床中保持低温。
    3. 将细胞培养板放入水套式 CO₂ 培养箱中2 37 °C 培养箱中孵育。轻轻水平地南北、东西方向移动培养板，以确保接种均匀。每隔 1.5 小时重复该操作两次。
    4. 铺板后3 h验证细胞贴壁情况。
      注意：至少应有60%的细胞贴附于培养板，作为肝细胞质量良好的指标。
    5. 接种后24小时，将培养基更换为预热的肝细胞维持培养基（MM），以维持细胞培养。
  5. 糖原染色
    1. 待细胞在6孔I型胶原包被板上贴壁后，移除培养细胞中的用过的培养基。
    2. 在冰冻乙醇中固定细胞 10–15 分钟。
    3. 用无菌水充分清洗。
    4. 在1%的水溶液高碘酸中孵育5分钟，然后用无菌水洗涤。
    5. 在100%希夫试剂中孵育30分钟。
      注意：加入细胞前，Schiff试剂不得稀释。
    6. 用清水洗涤10分钟，重复三次。
    7. 用封片剂封片。
    8. 使用明场显微镜进行成像。

3. 为 CRISPR-Cas9 基因编辑设计 sgRNA

注意：本节描述了靶向小鼠羟基苯丙酮酸双加氧酶（Hpd）基因的sgRNA设计，作为基因编辑的原理性验证，旨在破坏与肝脏先天性代谢缺陷病（IMD）相关的治疗靶基因。

  1. 使用参考软件15设计靶向Hpd的向导序列。
  2. 通过 Ensembl 基因组浏览器验证Hpd序列。
  3. 设计 gRNA 时采用以下参数：单导向序列长度为 20 个核苷酸，原间隔序列邻近基序（PAM）为 NGG（N 可为任意核苷酸）。
  4. 从Hpd的第 3 外显子中选择一个靶向区域。
  5. 从靶向区域生成包含靶向评分和脱靶评分的向导序列列表。
    注意：靶向评分表示给定设计的预测靶向编辑效率，评分越高，编辑效率越高；脱靶评分反映向导序列的特异性，评分越高，脱靶编辑的可能性越低。理想情况下，两个评分均应较高：靶向评分 >60，脱靶评分 >50。
  6. 选择靶向评分和脱靶评分最高的向导序列，并将包含该向导序列的 sgRNA 进行化学合成。

4. 电穿孔与细胞培养

  1. CRISPR-Cas9 底物、培养基、细胞和电穿孔仪器的准备
    1. 将随附的全部补充剂加入 PM 中，并在 37 °C 水浴中预热 10 分钟。
    2. 按下 power 按钮开启电穿孔设备，然后通过按下 x 按钮，再按 下箭头 按钮，直到屏幕上显示程序 T-028。
    3. 向六孔胶原蛋白 I 包被的培养板中每孔加入 1.5 mL PM，以准备用于电穿孔肝细胞的目的孔。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育，直至使用。
    4. 将随附的全部补充剂加入电穿孔缓冲液中，并在室温下孵育 10 分钟。
      注意：在试剂瓶上标注电穿孔缓冲液的有效期（自加入补充剂之日起 3 个月）。
    5. 从包装中取出电穿孔杯，并为每个样品进行标记。
    6. 在 PCR 分隔条状管中，通过将 30 µg sgRNA 与 300 pmol Cas9 蛋白混合来制备 Cas9 RNP 复合物，并在室温下孵育 10 分钟。通过将 30 µg sgRNA 与 4 µL Cas9 mRNA（1 µg/µL）混合来制备 Cas9 mRNA。将 mRNA-sgRNA 混合物置于冰上保存，直至进行电穿孔。另单独准备一支含有 1.0 µg eGFP mRNA 的试管，用于通过荧光显微镜验证电穿孔是否成功。
    7. 以 100 × g 离心力在 4 °C 下离心每电穿孔反应 1.2 × 106 个细胞，持续 2 分钟。
    8. 吸除细胞沉淀中的上清液，沿管壁每反应加入 100 µL 电穿孔溶液。用手轻轻摇动试管，使肝细胞重悬于电穿孔溶液中。
  2. 将 CRISPR-Cas9 RNP 和 mRNA 电穿孔导入肝细胞
    1. 当肝细胞在电穿孔溶液中均匀分散后，将 100 µL 细胞悬液转移至含有 Cas9 复合物的条状管中。
      注意：转移肝细胞时应使用宽口移液吸头，以保持细胞活力。
    2. 将条状管中的内容物转移至电穿孔杯中。
    3. 将核转杯插入电穿孔设备的插槽中。按下 x 按钮进行电穿孔。电穿孔完成后，等待设备屏幕上出现 OK 提示，再次按下 x 按钮并取出电穿孔杯。
    4. 将电穿孔后的电穿孔杯置于冰上孵育 15 分钟。
    5. 向电穿孔杯中加入 500 µL 预热的 PM。
    6. 将 300 µL 电穿孔反应液转移至预热培养板上的每个目的孔中。
      注意：每电穿孔反应应对应两个目的孔。一个孔用于量化基因编辑效率；另一个孔用于 MTT 和白蛋白检测。
    7. 为防止肝细胞在孔中央聚集，通过轻轻水平和垂直移动培养板（南北和东西方向），使细胞分散。确保移动过程中培养板始终与培养箱搁板保持接触。在接种电穿孔肝细胞后的 15、30、45、60 和 90 分钟重复此操作。
    8. 将培养板在 37 °C 下过夜孵育。
    9. 细胞接种 24 小时后，吸除指定用于基因编辑分析的孔中的培养基，并替换为 0.25 mg/mL 基底膜基质覆盖层。
      ​注意：若基底膜基质储存于冷冻状态，请先转移至 4 °C 冰箱中解冻。由于基底膜基质在高于 10 °C 时会凝固，因此在使用前必须始终保持其处于冰上或 4 °C 环境中。

5. 计算与 MM 混合的膜基质体积，以获得 0.25 mg/mL 的最终浓度

注意：6孔板每孔需要2 mL覆盖层。

6. 将计算好的膜基质体积加入冰冷的MM中，并通过上下吹打10次混匀

  1. 将覆盖混合液缓慢加入细胞上方，并将培养板放回 37 °C 培养箱中。
  2. 每 24 小时更换一次新鲜的维持培养基。
  3. 接种后 24 小时，收集指定用于 MTT 和白蛋白检测的孔中的条件培养基。将条件培养基储存于微量离心管中，待进行白蛋白检测时使用。MTT 检测请继续执行步骤 7.1。
    ​注意：短期储存（少于一天）时，将条件培养基置于 4 °C 保存；长期储存时，应将培养基置于 -80 °C 保存。

7. 电穿孔小鼠肝细胞中递送效率、细胞活力及靶向编辑的分析

  1. 使用 MTT 法测定细胞活力
    1. 通过向一支 5 mg 的 MTT 管中加入 1 mL PBS，制备 12 mM 的 MTT 储存液。
    2. 向各孔中加入 150 µL MTT 储存液，孵育 24 小时。
    3. 孵育结束后，向每孔加入 1.5 mL 十二烷基硫酸钠-盐酸（SDS-HCl）溶液，然后用移液器吹打混匀。
    4. 将培养板在 37 °C 下孵育 4 小时，观察培养基颜色由透明变为紫色，以指示活细胞的存在。
    5. 再次用移液器混匀每个样品，并使用酶标仪在 570 nm 处读取吸光度。
    6. 使用公式（1）计算 Cas9 处理样品的归一化活力：
      实验结果图中显示的细胞活力吸光度比值公式。 (1)
  2. 白蛋白测定法评估肝细胞功能
    1. 将 50 µL 条件培养基转移至白蛋白检测试剂盒提供的板孔中。覆盖孔板并在室温下孵育 2 小时。
    2. 用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤各孔 5 次。
    3. 将板倒置，使各孔液体排到纸巾上，并轻拍数次。
    4. 洗涤后，向每孔加入白蛋白检测试剂盒提供的 50 µL 生物素化抗体，在室温下孵育 1 小时。
    5. 重复步骤 5.2.2–5.2.3 以洗涤各孔。
    6. 向每孔加入白蛋白检测试剂盒提供的 50 µL 链霉亲和素-过氧化物酶，在室温下孵育 30 分钟。
    7. 重复步骤 5.2.2。
    8. 每孔加入白蛋白检测试剂盒提供的 50 µL 显色底物，在室温下孵育 30 分钟。轻轻敲击板以确保混合均匀。用移液器吸头去除气泡。
    9. 最后，向每孔加入 50 µL 终止液，观察颜色由黄色变为蓝色，以指示功能细胞的存在。
    10. 立即使用酶标仪在 450 nm 处读取吸光度。
  3. 估算经 eGFP mRNA 电穿孔处理孔中的递送效率
    1. 电穿孔后 24 小时，拍摄肝细胞的相差图像和绿色荧光图像。在孔内不同位置拍摄三张图像。
    2. 将细胞图像上传至 ImageJ。在 Image 选项卡下，选择 Type | 16-bit 将图像转换为灰度图像。
    3. 为突出图像中的细胞结构，在 Image 选项卡下选择 Adjust | Threshold。调节滑块以高亮显示细胞。
    4. 在 Process 选项卡下，选择 Subtract Background 以去除背景噪声。
    5. 点击 Analyze 选项卡，然后选择 Analyze particles 进行细胞计数。点击 Ok 生成计数颗粒列表。
    6. 通过将绿色荧光图像中计数的颗粒数除以对应相差图像中计数的颗粒数，计算 GFP 阳性细胞的百分比。
  4. 靶向 Cas9 活性的分析
    1. 从电穿孔后的细胞中提取基因组 DNA。
      1. 电穿孔后第 3 天，移除培养板中的培养基，加入 500 μL 0.25% 胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育 5 分钟。孵育后多次吹打，确保肝细胞从培养板上脱落。
      2. 将胰蛋白酶处理的细胞悬液转移至微量离心管中，在台式离心机中以 800 × g 在室温下离心 10 分钟。离心后检查管底是否有沉淀。
      3. 用移液器移除含胰蛋白酶的上清液，注意不要扰动沉淀。将沉淀重悬于 80 µL DNA 提取液中。若沉淀难以观察，可将管内内容物重悬于 50 µL DNA 提取液中。
      4. 涡旋振荡 30 秒以确保沉淀完全重悬。将悬液转移至 PCR 分条管中，并放入热循环仪。在 95 °C 下运行 15 分钟，68 °C 下运行 8 分钟。
    2. 通过 PCR 扩增靶向位点。
    3. 按照以下步骤使用 DNA 聚合酶扩增 Hpd 靶向区域。
      1. 准备反应体系：0.5 µL 10 mM dNTPs、0.5 µL 10 µM 正向引物、0.5 µL 10 µM 反向引物、0.125 µL Taq 聚合酶、5 µL 从肝细胞中提取的基因组 DNA，以及 18.375 µL 无核酸酶水。引物序列见 补充表 S1。
      2. 短暂涡旋并快速离心 PCR 混合液，确保溶液位于管底。
      3. 将 PCR 混合液放入热循环仪，按以下条件扩增：94 °C 变性 30 秒；30 个循环：94 °C 30 秒、57 °C 45 秒退火、68 °C 延伸 1 分钟；最后在 68 °C 延伸 5 分钟。
        注：PCR 反应的退火温度将根据引物组成而变化。建议在进行 PCR 前使用熔解温度计算器确定合适温度。
      4. 为确认正确产物大小，将 3 µL PCR 产物与 2 µL 水和 1 µL 6× 染料混合。在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，确认产物大小。
    4. 使用磁珠纯化 DNA。
      注：也可使用离心柱进行 PCR 产物纯化。以下是使用磁珠纯化 PCR 产物的步骤。
      1. 将磁珠从 4 °C 取出，使其恢复至室温。
      2. 短暂涡旋并快速离心 PCR 混合液。
      3. 加入与 PCR 混合液体积 1.8 倍的磁珠体积。用移液器吹打 10 次，确保溶液充分混匀。
      4. 在室温下孵育 10 分钟。
      5. 将 PCR-磁珠混合液转移至 PCR 板中，并置于磁力架上。
      6. 在磁力架上孵育 5 分钟。5 分钟后检查溶液是否澄清，磁珠是否已吸附至磁铁一侧，再进行下一步操作。
      7. 弃去上清液。
      8. 向孔中加入 200 µL 70% 乙醇，孵育 30 秒。
        注：70% 乙醇应在纯化前现配，以防止 DNA 损失。
      9. 弃去上清液，并重复步骤 7.4.4.8。
      10. 弃去上清液，在室温下干燥 3 分钟，以去除残留乙醇。
      11. 将板从磁力架上取下，向样品中加入 22 µL 水。上下吹打 10 次，使水与磁珠充分混合。
      12. 在室温下孵育 3 分钟。
      13. 将板重新放回磁力架，孵育 3 分钟或直至溶液澄清。
      14. 将 20 µL 样品转移至 PCR 管中，注意避免磁珠被带出。
    5. 通过 Sanger 测序对纯化的 DNA 扩增子进行测序。
    6. 将处理组和对照组（未处理）样品的 .ab1 测序文件上传至 Tracking of indels by Decomposition (TIDE)16，以定量靶位点的插入缺失（indels）。

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结果

从肝脏中分离可培养的原代肝细胞
肝脏灌注与肝细胞分离的整体流程如图所示 图1. 本实验使用野生型、8-10周龄的C57BL/6J小鼠。该操作预计可获得20-50 × 106 每只小鼠细胞数，细胞活力介于85%至95%之间。若活力低于此范围，则 <70% Percoll 处理应被用于去除死细胞。 freshly isolated hepatocytes 应接种于 I 型胶原蛋白包被或含氮组织培养板上。接种后 3–12 小时内，肝细胞应贴附于培养板，24 小时内细胞形态呈现典型的多边形或六边形外观。图2）。肝细胞是肝脏中唯一以糖原形式储存葡萄糖的细胞。为验证分离细胞的纯度，铺板后24 h采用过碘酸-雪夫试剂进行糖原染色。染色后的肝细胞胞质呈洋红色（图3).

将 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物和 mRNA 电穿孔转染...

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讨论

本方案中所述的肝细胞分离步骤具有挑战性，需要经过练习才能熟练掌握。从肝脏成功分离肝细胞有几个关键步骤。首先，正确插管下腔静脉对于实现肝脏完全灌注至关重要。灌注后若肝脏未出现褪色，提示导管位置发生移位（表1）。本实验采用下腔静脉进行逆行灌注，因其相比门静脉的顺行灌注更为简便且易于操作17,18。某些方案使用缝线固定导管19；然而，缝合会增加操作复杂性。缝合导管可能导致导管错位，并使其无法调整位置。此外，可在不取出针头的情况下直接在肝脏内完成插管，这可能进一步简化肝脏灌注过程。当针头仍在静脉内时，无需将泵连接至导管。此外，这种方法还能降低导管意外脱出和形成血栓的风险。将导管尖端以较平的角度插入静脉有助于提高插管成功率。下腔静脉具有多个分支，若导管插入位置错误，将导致灌注进入身体其他部位而非肝脏（表1）。因此，必须将导管置于避开分支的合适位置。不同小鼠之间的血管结构存在轻微差异，因此在插管前应仔细观察静脉，以确定...

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披露

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

RNC 获得了由美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIGMS）资助的南卡罗来纳组织再生与形成生物工程中心试点项目基金、美国肝病研究学会基金会以及美国基因与细胞治疗学会的资助。 & 细胞治疗，资助编号分别为 P30 GM131959、2021000920 和 2022000099。本内容仅由作者负责，不代表美国基因与细胞治疗学会的官方观点 & 细胞治疗或美国肝脏疾病研究学会基金会。示意图显示 图1 由 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>仪器设备
0.2 mL PCR 8联管 FLEX-FREE 排管，带透明平盖，自然色USA Scientific1402-4700
6孔胶原板Advanced Biomatrix5073
accuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
一体化荧光显微镜KeyenceBZ-X810
模拟旋涡混合器VWR97043-562
ART Wide BORE 过滤吸头 1,000 µL赛默飞世尔科技2079GPK
自动细胞计数仪伯乐生命科学公司TC20
蓝色石蜡解剖托盘Braintree Scientific Inc.DTW19" × 6.5" x 1/2"+F21
细胞刮刀/细胞刮棒Argos TechnologiesUX-04396-53无热原，无菌
锥形管（15 mL）Fisher Scientific339650
50 mL 一次性锥形离心管Fisher Scientific14-432-22
棉签Fisher Scientific22-363-170
弯头剪刀库博医疗62131
一次性培养皿Falcon351029100毫米，无菌
一次性培养皿VWR25373-10035毫米，无菌
Epoch 微孔板分光光度计BioTek Instruments250082
Falcon 细胞筛（70 µm)Fisher Scientific08-771-2
镊子库博医疗61864欧洲-地中海阿德森组织镊
IV导管 BD38261224 G × 0.75 英寸
静脉输液器巴克斯特2C6401
MyFuge 12 小型离心机Benchmark Scientific1220P38
针头Fisher Scientific05-561-2025 G
Nucleofector 2b 装置LonzaAAB-1001使用程序 T-028 对小鼠肝细胞进行电穿孔
蠕动泵Masterflex HV-77120-4210 至 60 转/分钟；90 至 260 伏交流电
精密泵管MasterflexHV-96410-1425 英尺，硅胶
原代培养板康宁生命科学353846含氮组织培养板
血清移液管（25 mL）Fisher Scientific12-567-604
注射器BD3294641 mL，无菌
T100热循环仪伯乐生命科学公司1861096
水浴锅ALT27577Thermo Scientific Precision 微处理器控制 280 系列，2.5 L
<强>试剂
Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3IDT1081058
Beckman Coulter AMPure XP，5 mLFisher ScientificNC9959336
CleanCap Cas9 mRNATrilink BiotechnologiesL-7606-100
CleanCap EGFP mRNATrilink BiotechnologiesL-7201-100
Corning Matrigel 基质康宁生命科学356234
DMEM赛默飞世尔科技11885076低葡萄糖，丙酮酸
70% 乙醇VWR71001-652
胎牛血清赛默飞世尔科技26140-079
肝细胞维持培养基（MM）LonzaMM250
肝细胞铺板培养基（PM）LonzaMP100
小鼠白蛋白ELISA试剂盒Fisher ScientificNC0010653
小鼠/大鼠肝细胞核转染试剂盒LonzaVPL-1004
OneTaq HotStart DNA聚合酶New England BiolabsM0481L
PBS 10x pH 7.4 赛默飞世尔科技70011-044不含钙或氯化镁
Percoll（聚乙烯吡咯烷酮溶液）Santa Cruz Biotechnologysc-500790A
高碘酸Sigma-AldrichP7875-25G
Permount 封片介质VWR100496-550
QuickExtract DNA提取溶液Lucigen CorporationQE05090
希夫’酸性品红-亚硫酸试剂Sigma-AldrichS5133
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）赛默飞世尔科技25200056酚红
Vybrant MTT 细胞活力检测试剂盒赛默飞世尔科技V13154
<强>灌注液1（pH 7.4，过滤除菌） 4℃下稳定 °2 个月，4 ℃
EBSSFisher Scientific14155063定容至 200 mL
EGTA（0.5 M）Bioworld40520008-1200 µL
HEPES（pH 7.3，1 M）赛默飞世尔科技AAJ16924AE2 mL 
<强>灌注液2（pH 7.4，滤膜除菌） 4℃下稳定 °2 个月，4 ℃
CaCl2·2H20（1.8 mM）SigmaC7902-500G360 µ1 M 储液的升数 
EBSS（无钙、无镁、无酚红）Fisher Scientific14-155-063定容至 200 mL
HEPES (1 M)赛默飞世尔科技AAJ16924AE2 mL 
MgSO4·7H20（0.8 mM）Sigma30391-25G160 µ1 M 储备液的升数
<强>灌流液 3 使用前新鲜配制
溶液250 mL
Liberase罗氏54011270010.094 Wunsch 单位/毫升
<强>小鼠麻醉混合剂 
Acepromzine0.25 mg/mL 终浓度
氯胺酮7.5 mg/mL 终浓度
赛拉嗪1.5 mg/mL 最终浓度
<强>软件<强>URL
Benchlinghttps://www.benchling.com/
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
TIDE：通过分解法追踪插入缺失突变https://tide.nki.nl/

参考文献

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019).
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117(2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584(2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2022).
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M. Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).

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肝细胞分离电穿孔递送CRISPR-Cas9基因编辑mRNA转染逆行灌注基因敲低白蛋白检测GFP荧光
电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞
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