电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞

摘要

本方案描述了从小鼠肝脏中分离原代肝细胞，并通过电穿孔将CRISPR-Cas9以核糖核蛋白复合物和mRNA形式导入细胞，以破坏与遗传性肝代谢疾病相关的治疗靶基因的技术。所述方法在电穿孔后可实现高细胞存活率和高效的基因修饰水平。

摘要

本方案描述了一种快速高效分离原代小鼠肝细胞并随后通过电穿孔介导递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNPs）和mRNA的方法。采用三步逆行灌注法分离原代小鼠肝细胞，每只肝脏可获得高达50 × 10⁶个细胞，细胞活力达>85%。本方案提供了肝细胞铺板、染色和培养的详细操作步骤。实验结果表明，通过绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞比例测定，电穿孔转染效率高达89%，且小鼠肝细胞保持适度的细胞活力，达>35%。

为验证该方法的实用性，将靶向羟苯基丙酮酸双加氧酶基因的 CRISPR-Cas9 体系通过电穿孔导入小鼠原代肝细胞，作为概念验证实验，旨在通过基因编辑破坏与肝源性遗传性代谢病（IMD）相关的治疗靶基因。结果显示，核糖核蛋白复合物（RNP）组的靶向编辑效率达到78%，高于mRNA组的47%。随后对肝细胞功能进行了评估 体外 使用白蛋白检测法表明，以核糖核蛋白复合物（RNPs）和mRNA形式递送CRISPR-Cas9在原代小鼠肝细胞中具有相当的细胞活力。该方案的一个有前景的应用是构建用于研究影响肝脏的人类遗传性疾病的鼠标模型。

引言

肝脏的先天性代谢缺陷病（IMD）是一类遗传性疾病，其特征是肝脏中参与代谢的关键酶缺乏，导致毒性代谢产物的积累。若不进行治疗，肝脏IMD将导致器官衰竭或过早死亡^1,2。目前，肝脏IMD患者唯一的根治方法是原位肝移植，但由于供体器官来源有限以及术后免疫抑制治疗带来的并发症，该疗法的应用受到限制^3,4。根据器官获取与移植网络（Organ Procurement and Transplantation Network）收集的最新数据，肝移植等待名单上的成年患者中仅有40%至46%能够获得移植器官，而12.3%的患者在等待期间死亡⁵。此外，所有罕见肝病中仅有5%拥有经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗方法⁶。显然，肝脏IMD迫切需要新的治疗手段。然而，开发新的治疗方法依赖于合适的疾病模型。

利用体外（in vitro）和体内（in vivo）系统模拟人类疾病，仍是开发有效疗法及研究肝脏先天性代谢疾病（IMDs）病理机制的障碍。获取患有罕见肝病患者的肝细胞十分困难⁷。动物....

方案

所有动物实验均按照克莱姆森大学机构动物护理和使用委员会的指南以及批准的方案进行。手术在8至10周龄的野生型C57BL/6J小鼠中实施，小鼠处于麻醉状态。

1. 动物手术

1. 溶液与仪器的准备
   注意：灌注溶液和麻醉混合液的配方见材料表。
   1. 配制灌注溶液1（HEPES、EGTA 和 EBSS）、灌注溶液2（HEPES、EGTA、EBSS、CaCl₂ 和 MgSO₄）以及灌注溶液3（溶液2 加 Liberase）。确保各溶液充分混匀。
   2. 将水浴锅设定为 42 °C，并在开始实验前至少预热 30 分钟，使灌注溶液1、2 和 3 均保持在水浴中。
      注意：灌注溶液1 和 2 可螯合钙离子并冲洗肝脏中的血液。灌注溶液3 含有消化酶 liberase，用于解离细胞外基质。
   3. 将 150 mL DMEM + 10% 胎牛血清（FBS）置于锥形管中，并置于冰上保存。
      注意：该培养基将在步骤 2.1 和 2.2 中分别用于从肝脏包膜中释放细胞以及洗涤分离的肝细胞。
   4. 将离心机设定为 4 °C。
   5. 将泵管两端浸入盛有 70% 乙醇的烧瓶中，循环乙醇三次，以对泵管进行灭菌。
   6. 用蒸馏水冲洗泵管并排空。
   <....

结果

从肝脏中分离可培养的原代肝细胞
肝脏灌注与肝细胞分离的整体流程如图所示 图1. 本实验使用野生型、8-10周龄的C57BL/6J小鼠。该操作预计可获得20-50 × 10⁶ 每只小鼠细胞数，细胞活力介于85%至95%之间。若活力低于此范围，则 <70% Percoll 处理应被用于去除死细胞。 freshly isolated hepatocytes 应接种于 I 型胶原蛋白包被或含氮组织培养板上。接种后 3–12 小时内，肝细胞应贴附于培养板，24 小时内细胞形态呈现典型的多边形或六边形外观。图2）。肝细胞是肝脏中唯一以糖原形式储存葡萄糖的细胞。为验证分离细胞的纯度，铺板后24 h采用过碘酸-雪夫试剂进行糖原染色。染色后的肝细胞胞质呈洋红色（图3).

将 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物和 mRNA 电穿孔转染.......

讨论

本方案中所述的肝细胞分离步骤具有挑战性，需要经过练习才能熟练掌握。从肝脏成功分离肝细胞有几个关键步骤。首先，正确插管下腔静脉对于实现肝脏完全灌注至关重要。灌注后若肝脏未出现褪色，提示导管位置发生移位（表1）。本实验采用下腔静脉进行逆行灌注，因其相比门静脉的顺行灌注更为简便且易于操作^17,18。某些方案使用缝线固定导管¹⁹；然而，缝合会增加操作复杂性。缝合导管可能导致导管错位，并使其无法调整位置。此外，可在不取出针头的情况下直接在肝脏内完成插管，这可能进一步简化肝脏灌注过程。当针头仍在静脉内时，无需将泵连接至导管。此外，这种方法还能降低导管意外脱出和形成血栓的风险。将导管尖端以较平的角度插入静脉有助于提高插管成功率。下腔静脉具有多个分支，若导管插入位置错误，将导致灌注进入身体其他部位而非肝脏（表1）。因此，必须将导管置于避开分支的合适位置。不同小鼠之间的血管结构存在轻微差异，因此在插管前应仔细观察静脉，以确定.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>仪器设备
0.2 mL PCR 8联管 FLEX-FREE 排管，带透明平盖，自然色	USA Scientific	1402-4700
6孔胶原板	Advanced Biomatrix	5073
accuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
一体化荧光显微镜	Keyence	BZ-X810
模拟旋涡混合器	VWR	97043-562
ART Wide BORE 过滤吸头 1,000 µL	赛默飞世尔科技	2079GPK
自动细胞计数仪	伯乐生命科学公司	TC20
蓝色石蜡解剖托盘	Braintree Scientific Inc.	DTW1	9" × 6.5" x 1/2"+F21
细胞刮刀/细胞刮棒	Argos Technologies	UX-04396-53	无热原，无菌
锥形管（15 mL）	Fisher Scientific	339650
50 mL 一次性锥形离心管	Fisher Scientific	14-432-22
棉签	Fisher Scientific	22-363-170
弯头剪刀	库博医疗	62131
一次性培养皿	Falcon	351029	100毫米，无菌
一次性培养皿	VWR	25373-100	35毫米，无菌
Epoch 微孔板分光光度计	BioTek Instruments	250082
Falcon 细胞筛（70 µm)	Fisher Scientific	08-771-2
镊子	库博医疗	61864	欧洲-地中海阿德森组织镊
IV导管	BD	382612	24 G × 0.75 英寸
静脉输液器	巴克斯特	2C6401
MyFuge 12 小型离心机	Benchmark Scientific	1220P38
针头	Fisher Scientific	05-561-20	25 G
Nucleofector 2b 装置	Lonza	AAB-1001	使用程序 T-028 对小鼠肝细胞进行电穿孔
蠕动泵	Masterflex	HV-77120-42	10 至 60 转/分钟；90 至 260 伏交流电
精密泵管	Masterflex	HV-96410-14	25 英尺，硅胶
原代培养板	康宁生命科学	353846	含氮组织培养板
血清移液管（25 mL）	Fisher Scientific	12-567-604
注射器	BD	329464	1 mL，无菌
T100热循环仪	伯乐生命科学公司	1861096
水浴锅	ALT	27577	Thermo Scientific Precision 微处理器控制 280 系列，2.5 L
<强>试剂
Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3	IDT	1081058
Beckman Coulter AMPure XP，5 mL	Fisher Scientific	NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7201-100
Corning Matrigel 基质	康宁生命科学	356234
DMEM	赛默飞世尔科技	11885076	低葡萄糖，丙酮酸
70% 乙醇	VWR	71001-652
胎牛血清	赛默飞世尔科技	26140-079
肝细胞维持培养基（MM）	Lonza	MM250
肝细胞铺板培养基（PM）	Lonza	MP100
小鼠白蛋白ELISA试剂盒	Fisher Scientific	NC0010653
小鼠/大鼠肝细胞核转染试剂盒	Lonza	VPL-1004
OneTaq HotStart DNA聚合酶	New England Biolabs	M0481L
PBS 10x pH 7.4	赛默飞世尔科技	70011-044	不含钙或氯化镁
Percoll（聚乙烯吡咯烷酮溶液）	Santa Cruz Biotechnology	sc-500790A
高碘酸	Sigma-Aldrich	P7875-25G
Permount 封片介质	VWR	100496-550
QuickExtract DNA提取溶液	Lucigen Corporation	QE05090
希夫’酸性品红-亚硫酸试剂	Sigma-Aldrich	S5133
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	赛默飞世尔科技	25200056	酚红
Vybrant MTT 细胞活力检测试剂盒	赛默飞世尔科技	V13154
<强>灌注液1（pH 7.4，过滤除菌）			4℃下稳定 °2 个月，4 ℃
EBSS	Fisher Scientific	14155063	定容至 200 mL
EGTA（0.5 M）	Bioworld	40520008-1	200 µL
HEPES（pH 7.3，1 M）	赛默飞世尔科技	AAJ16924AE	2 mL
<强>灌注液2（pH 7.4，滤膜除菌）			4℃下稳定 °2 个月，4 ℃
CaCl2·2H20（1.8 mM）	Sigma	C7902-500G	360 µ1 M 储液的升数
EBSS（无钙、无镁、无酚红）	Fisher Scientific	14-155-063	定容至 200 mL
HEPES (1 M)	赛默飞世尔科技	AAJ16924AE	2 mL
MgSO4·7H20（0.8 mM）	Sigma	30391-25G	160 µ1 M 储备液的升数
<强>灌流液 3			使用前新鲜配制
溶液2			50 mL
Liberase	罗氏	5401127001	0.094 Wunsch 单位/毫升
<强>小鼠麻醉混合剂
Acepromzine			0.25 mg/mL 终浓度
氯胺酮			7.5 mg/mL 终浓度
赛拉嗪			1.5 mg/mL 最终浓度
<强>软件	<强>URL
Benchling	https://www.benchling.com/
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE：通过分解法追踪插入缺失突变	https://tide.nki.nl/