Method Article

从小鼠面部过程和培养的腭间充质细胞中分离全细胞蛋白质裂解物以进行磷酸化蛋白分析

DOI:

10.3791/63834

⸱

April 1st, 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

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该协议提出了一种从解剖的小鼠胚胎面部过程或培养的小鼠胚胎腭间充质细胞中分离全细胞蛋白裂解物并随后进行蛋白质免疫印迹以评估磷酸化蛋白水平的方法。

Abstract

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哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态学过程，在此期间，多个细胞群协调以产生额鼻骨骼。这些形态学变化是通过各种信号传导相互作用开始和维持的，其中通常包括激酶的蛋白质磷酸化。这里，提供了两个生理相关上下文的例子，其中研究了哺乳动物颅面发育过程中蛋白质的磷酸化:小鼠面部过程，特别是E11.5上颌骨过程，以及来自E13.5次级腭架的培养小鼠胚胎腭间充质细胞。为了克服蛋白质分离过程中去磷酸化的常见障碍，讨论了对允许分离磷酸化蛋白的标准实验室方法的适应性和修饰。此外，还提供了在全细胞蛋白裂解物进行蛋白质免疫印迹后对磷酸化蛋白进行适当分析和定量的最佳实践。这些技术，特别是与药理学抑制剂和/或小鼠遗传模型相结合，可用于更深入地了解颅面发育过程中活性的各种磷酸化蛋白的动力学和作用。

Introduction

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哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态学过程，在此期间，多个细胞群协调以产生额鼻骨骼。在小鼠中，该过程始于胚胎日（E）9.5，形成额鼻突出和成对的上颌骨和下颌过程，每个过程都包含迁移后颅神经嵴细胞。外侧和内侧鼻突起源于额鼻突出，伴有鼻坑的出现，最终融合形成鼻孔。此外，内侧鼻突和上颌突融合以产生上唇。同时，腭生成始于E11.5时从上颌过程的口腔侧形成不同的生长 - 次级腭架。随着时间的推移，腭架在舌头的两侧向下生长，上升到舌头上方的相反位置，并最终在中线融合形成连续的腭，将鼻腔和口腔分开E16.51。

这些在整个颅面发育过程中的形态变化是通过各种信号传导相互作用开始和维持的，其中通常包括激酶的蛋白质磷酸化。例如，细胞膜受体，例如转化生长因子（TGF）-β受体的亚家族，包括骨形态发生蛋白受体（BMPRs）和各种受体酪氨酸激酶（RTK）家族，在颅神经嵴细胞中的配体结合和激活时自磷酸化2，3，4.此外，G蛋白偶联的跨膜受体平滑在颅神经嵴细胞和颅面外胚层中磷酸化，声波刺猬（SHH）配体与Patched1受体结合，导致睫状膜处平滑积聚和SHH途径激活5。这种配体-受体相互作用可以通过颅面环境中的自分泌、旁分泌和/或....

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Protocol

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所有涉及动物的程序均由科罗拉多大学安舒茨医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照机构指南和法规进行。雌性129S4小鼠在1.5-6月龄下饲养在21-23°C的亚热中性温度下用于胚胎收获。该协议的工作流程示意图如图 1所示。有关本方案中使用的所有材料、设备、软件、试剂和动物的详细信息，请参阅材料 表 。

1. 收获E11.5小鼠胚胎

  1. 在使用IACUC批准的CO 2流速在CO2室中定时交配期间检测到阴道栓后11.5天对怀孕的雌性小鼠实施安乐死，所需的约50%位移（3室中360室中为2.95 L / min）和暴露持续时间（见材料表）。进行宫颈脱位作为安乐死的次要方法。立即进行解剖。
  2. 将小鼠身体放在解剖板上，腹侧朝上。用70%乙醇喷洒小鼠腹部。
  3. 用直的Semken镊子捏住并抬起阴道口前方的皮肤，然后用直刀片手术剪刀以45°角切割抬起的皮肤和下层，以产生"V"形，该形状延伸到前肢和后肢之间大致一半的每个侧表面，从而打开腹腔。
  4. 使用Semken镊子，抓住其中一个子宫角，并用手术剪刀切开输卵管下方和子宫颈上方。切除子宫中膜，以便完全切除子宫角....

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Results

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当试图表征从小鼠面部过程和/或培养的腭间充质细胞中分离的蛋白质的磷酸化时，理想的结果将在蛋白质印迹后显示一个独特的，可重复的条带，该抗体在相应总蛋白带的高度或附近运行（图3).然而，如果发生蛋白质的广泛磷酸化，与总蛋白质条带相比，磷酸蛋白条带可能会有轻微的向上移动。此外，如果一个组织中存在蛋白质的多个亚型，每个亚型都被磷酸化，或者该蛋白质可变地受到额外的PTM的影响，则蛋白质印迹中可能出现具有抗磷酸化蛋白抗体的多个条带。如果没有观察到感兴趣的磷酸化蛋白的信号，尽管检测到感兴趣的总蛋白，该蛋白可能不会在所选上下文中磷酸化，或者方案可能出现了技术问题。在后一种情况下，可以使用抗磷酸丝氨酸/苏氨酸和/或抗磷酸酪氨酸抗体进行全细胞裂解物的蛋白质印迹，以表明方案是否按预期工作。由于蛋白质的磷酸化在颅面组织中含量丰富25，37，因此多个磷酸化蛋白条带的存在将表明方案的成功完成和初始筛选的准确结果。

比较野生型和突变型胚.......

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Discussion

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这里描述的方案允许研究人员以稳健和可重复的方式探测颅面发育过程中的关键磷酸化依赖性信号传导事件。该协议中有几个关键步骤可以确保正确收集数据和分析结果。无论是从小鼠面部过程和/或培养的腭间充质细胞中分离磷酸化蛋白，都必须快速有效地移动，同时在需要时将所有试剂和材料保持在冰上。冰的低温减慢了细胞中的代谢活性，从而保护磷酸化蛋白质免受磷酸酶活性38 的侵害并保持高蛋白质产量。在上颌骨解剖过程中使用三个单独的10厘米培养皿可确保所有解剖在足够预先形成的组织学PBS中进行。与此相关的是，该蛋白质分离方案的另一个基本组成部分是在所有裂解缓冲液中使用磷酸酶抑制剂。这些试剂还保护目标蛋白39，40 上的磷酸基团，并保持磷酸化蛋白的完整性，以便通过蛋白质免疫印迹进一步分析。

该协议还引入了修饰，允许对组织和培养细胞中的磷酸化蛋白进行更特异性的分析。在解剖面部过程的过程中，增加了用于上颌骨外胚层和间充质分离的可选步骤，以允许研究区室特异性.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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129S4只老鼠是西奈山伊坎医学院Philippe Soriano博士的礼物。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）/美国国立牙科和颅面研究所（NIDCR）R01 DE027689和K02 DE028572至K.A.F.，F31 DE029976至M.A.R.和F31 DE029364至B.J.C.D.的资金支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
设备
Block 用于迷你干浴Research Products International Corp400783
ChemiDoc XRS+ 成像系统，带 Image Lab 软件Bio-Rad1708265化学发光成像仪
CO2 培养箱、气套VWR10810-902
解剖板， 11 x 13 inFisher Scientific09 002 12
电泳槽， 4 凝胶， 用于带小型反式印迹模块的小型预制胶Bio-Rad1658030
杂交炉Fisher ScientificUVP95003001
微量离心机 5415 D，带 F45-24-11 转子 （Eppendorf）Sigma AldrichZ604062
小型干浴研究产品International Corp400780
轨道摇床VWR89032-092
pH 计VWR89231-662
SDS-PAGE电源 Bio-Rad1645050
矩形冰盘，最大 9 LFisher Scientific07-210-093
Stemi 508 体视显微镜，带支架 K LAB，LED 环形灯蔡司4350649020000000解剖显微镜
计时器VWR62344-641
管式左轮手枪Fisher Scientific11 676 341
涡旋混合器Fisher Scientific02 215 414
水浴VWR89501-472
蛋白质印迹盒Fisher ScientificNC9358182
材料
细胞培养皿，6 cmFisher Scientific12-565-95
细胞培养板，12 孔Fisher Scientific07-200-82
细胞提升器Fisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
锥形管，聚丙烯，50mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 细镊子精细科学工具11254-20
胚胎勺精细科学工具10370-17
微量离心管，0.5 mLVWR89000-010
微量离心管，1.5 mLVWR20170-038
巴斯德移液管，5.75"FisherScientific13-678-6A
巴斯德吸管，9 英寸VWR14672-380
培养皿，10 cmFisher Scientific08-757-100D
培养皿，35 mmFisher ScientificFB0875711YZ
袋，透明，聚乙烯衬里Fisher Scientific01-812-25B
PVDF 膜Fisher科学IPVH00010
Semken 镊子精细科学工具11008-13
小乳胶球，2 毫升VWR82024-554
手术剪刀精细科学工具14002-12
注射器过滤器，25 毫米，0.2 &μ;m 孔径Fisher Scientific09-740-108
带鲁尔头的注射器，10 mLVWRBD309604
移液管Fisher Scientific13-711-22
蛋白质印迹盒打开杆Bio-Rad4560000
Whatmann 3MM chr 色谱纸Fisher Scientific05-714-5
试剂
4-15% 预制蛋白凝胶，10 孔，30 µLBio-Rad4561083
&β;-甘油磷酸二钠盐水合物Sigma AldrichG5422-25G储备浓度 1 M
&β;-巯基乙醇Sigma AldrichM3148-100ML
牛血清白蛋白，组分 V，热休克试验Fisher ScientificBP1600-100
溴酚蓝Fisher Scientific
完全小型蛋白酶抑制剂混合物Sigma Aldrich11836153001储备液浓度 25x
DC 蛋白检测试剂盒 IIBio-Rad500-0112
DMEM，高葡萄糖Gibco11965092
E7，小鼠单克隆 β 微管蛋白一抗，浓缩物 0.1 mL发育研究杂交瘤细胞库E71：1,000
ECL 蛋白质印迹底物Fisher ScientificPI32106低皮克范围
ECL 蛋白质印迹底物Genesee Scientific20-302B低飞克范围
电泳缓冲液，5 LBio-Rad1610772原液浓度 10x
乙醇，200 标准，1 加仑Decon Laboratories， Inc.2705HCEtOH
乙二胺四乙酸，Di Na 盐二醇。（晶体粉末/电泳。Fisher ScientificBP120-500EDTA
胎牛血清，特征，美国来源，500 mLHyCloneSH30071.03
甘油（ACS 认证）Fisher ScientificG33-4
HRP 偶联二抗，山羊抗小鼠 IgGJackson 免疫研究实验室115-035-1461：20,000
HRP 偶联二抗，山羊抗兔 IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031：20,000
盐酸溶液，6N（认证）Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 非离子去污剂Fisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
异丙醇 （HPLC）Fisher ScientificA451-1
L-谷氨酰胺Gibco25030081储备液浓度 200 mM
甲醇Fisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK （Erk1/2） 一抗Cell Signaling Technology9102S1：1,000;抗 Erk1/2
PDGF-BB 重组配体，大鼠Fisher Scientific520BB050
PDGF 受体和 β 一抗Cell Signaling Technology3169S1：1,000
青霉素-链霉素Gibco15140122原液浓度 100 U/mL、100 &微量;g/mL
苯基甲磺酰氟，99%Fisher ScientificAC215740100PMSF;储备液浓度 100 mM
磷酸化 p44/42 MAPK （Erk1/2） 一抗Cell Signaling Technology9101S1：1,000，抗磷酸化 Erk1/2
磷酸化 PDGF 受体 &α; /PDGF 受体和 β; 一抗Cell Signaling Technology3170S1：1,000
氯化钾（白色晶体）Fisher ScientificBP366-500KCl
磷酸二氢钾（白色晶体）Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
SDS 溶液，10%Bio-Rad161-0416
氯化钠（结晶/生物，认证）Fisher ScientificS671-3NaCl
氟化钠（粉末/ACS 认证）Fisher ScientificS299-100NaF;等分试样，一次性使用;储备液浓度 1 M
原钒酸钠，99%Fisher ScientificAC205330500Na3VO4; 储备液浓度 100 mM
无水磷酸氢二钠（颗粒或粉末/ACS 认证）Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
组织培养 PBSFisher Scientific21-031-CV
转印缓冲液，5 LBio-Rad1610771储备液浓度 10x
Tris 碱（白色晶体或结晶粉末/分子生物学）Fisher ScientificBP152-1
胰蛋白酶BioWorld21560033
吐温 20Fisher ScientificBP337-500
蛋白质印迹分子量标记物 Bio-Rad1610374
Software
ImageJ 软件美国国立卫生
Animals
雌性 129S4 小鼠由西奈山伊坎医学院的 Philippe Soriano 博士捐赠
AC403140050研究院

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....

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