本文所述方案提供了在用户友好的 UCSC 基因组浏览器上，利用 PhyloCSF 分析目标基因组区域是否具有编码微蛋白潜力的详细操作步骤。此外，还推荐了多种工具和资源，用于进一步研究已鉴定微蛋白的序列特征，以深入了解其可能的功能。
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本文内容
摘要
摘要
下一代测序技术（NGS）推动了基因组学领域的发展，已获得多种动物物种和模式生物的全基因组序列。然而，尽管存在大量序列信息，全面的基因注释工作仍面临挑战，尤其是对于小蛋白质而言。值得注意的是，传统的蛋白质注释方法在设计时有意排除了由长度小于300个核苷酸的短开放阅读框（sORF）编码的潜在蛋白质，以过滤掉基因组中数量呈指数级增长的虚假非编码sORF。因此，数百种被称为微蛋白（microprotein）的功能性小蛋白（长度<100个氨基酸）被错误地归类为非编码RNA或完全被忽视。
本文提供了一项详细方案，用于利用免费且公开的生物信息学工具，基于进化保守性对基因组区域进行查询，以评估其编码微蛋白的潜力。具体而言，我们逐步介绍了如何在用户友好的加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组浏览器上，使用系统发育密码子替换频率（Phylogenetic Codon Substitution Frequencies, PhyloCSF）分析序列保守性和编码潜力。此外，我们还详细说明了如何高效生成已鉴定微蛋白序列的多物种比对，以可视化氨基酸序列的保守性，并推荐了可用于分析微蛋白特征的资源，包括预测的结构域结构。这些强大的工具可用于帮助识别非经典基因组区域中潜在的微蛋白编码序列，或排除在特定非编码转录本中存在具有翻译潜力的保守编码序列的可能性。
引言
自人类基因组计划启动以来，鉴定基因组中全部编码元件一直是主要目标之一，并且仍是理解生物系统及基于遗传的疾病病因学的核心目标1,2,3,4。下一代测序（NGS）技术的进步已实现了对大量生物体（包括脊椎动物、无脊椎动物、酵母和植物）的全基因组测序5。此外，高通量转录测序方法进一步揭示了细胞转录组的复杂性，并鉴定了数千种具有蛋白质编码和非编码功能的新型RNA分子6,7。解读这一海量序列信息仍是一个持续进行的过程，全面的基因注释工作仍面临诸多挑战8。
近年来，转译谱型技术的发展，包括核糖体谱型分析9,10和多聚核糖体测序11，提供了证据表明，数百个非常规翻译事件定位于基因组中目前尚未注释的小开放阅读框（sORF），有可能产生被称为微蛋白或微肽的小分子蛋白质<....
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方案
以下方案详细说明了如何在 UCSC 基因组浏览器上加载并浏览 PhyloCSF 浏览轨道（由 Mudge 等人49生成）。有关 UCSC 基因组浏览器的一般问题，可在此处查阅详尽的《基因组浏览器用户指南》： https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html。
1. 将 PhyloCSF 轨道中心加载到 UCSC 基因组浏览器
- 打开一个互联网浏览器窗口，访问 UCSC 基因组浏览器（https://genome.ucsc.edu/）。
- 在 Our tools 标题下，选择 Track Hubs 选项。
注意：Track Hubs 选项也可在 My Data 标签页下找到。 - 在 Public Hubs 标签页中，于 Search terms
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结果
本文将以经过验证的微蛋白 mitoregulin（Mtln）为例，说明一个保守的小开放阅读框（sORF）如何产生正的 PhyloCSF 评分，并可在 UCSC 基因组浏览器上直观地展示和分析。mitoregulin 之前被注释为非编码 RNA（人类基因 ID 曾为 LINC00116，小鼠基因 ID 为 1500011K16Rik）。比较基因组学和序列保守性分析方法在其最初发现过程中发挥了关键作用40,57,58,59,60,61，凸显了这些方法的强大能力。本示例将使用小鼠 GRCm38/mm10（2011 年 12 月）基因组组装版本。可通过基因标识符（mitoregulin、Mtln）或基.......
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讨论
本文提供的实验方案详细介绍了如何在用户友好的 UCSC 基因组浏览器上，利用 PhyloCSF 对感兴趣的基因组区域进行分析，以评估其编码微蛋白的潜力。48,49,50,51如上所述，PhyloCSF 是一种强大的比较基因组学算法，通过整合系统发育模型和密码子替换频率，识别出典型蛋白质编码基因的进化特征48,49PhyloCSF 已被广泛用于鉴定先前注释为非编码的基因组区域中的功能性微蛋白38,39,40,41
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（HL-141630 和 HL-160569）以及辛辛那提儿童研究基金会（受托人奖）的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 网站 | 网站地址 | 要求 | |
| Clustal Omega 多序列比对工具 | https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ | 网络浏览器 | 用于高效比对 FASTA 序列的多序列比对程序（例如用于已鉴定微蛋白的跨物种比较） |
| COXPRESSdb | https://coxpresdb.jp | 网络浏览器 | 提供共调控基因关系以估计基因功能 |
| EMBL-EBI 生物信息学工具常见问题解答 | https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ | 网络浏览器 | EMBL-EBI 工具常见问题解答（FAQs）。包含蛋白质序列比对的颜色编码说明 |
| 欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI） 工具与数据资源 | https://www.ebi.ac.uk/services/all | 网络浏览器 | 免费提供的网站、工具及数据资源综合列表 |
| Expasy - 瑞士生物信息学资源门户 | https://www.expasy.org | 网络浏览器 | 由瑞士生物信息学研究所（SIB）维护的一套用于蛋白质序列分析的生物信息学工具与资源 |
| 美国国家生物技术信息中心（NCBI） 保守结构域搜索 | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi | 网络浏览器 | 用于识别蛋白质或编码核苷酸序列中保守结构域的搜索工具 |
| Pfam 35 | http://pfam.xfam.org | 网络浏览器 | 蛋白家族（Pfam）数据库提供了蛋白家族和结构域的比对与分类 |
| PhyloCSF 轨道中心描述 | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q edaCd4ir8aZ65ryaD&&db=mm10 &c=chr2&g=hub_109801_ PhyloCSF_smooth | 网络浏览器 | 平滑 PhyloCSF 轨道与 PhyloCSF 轨道中心的详细说明 |
| SignalP 6.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0 | 网络浏览器 | 预测信号肽的存在及其切割位点的位置 |
| TMHMM - 2.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0 | 网络浏览器 | 蛋白质中跨膜螺旋的预测 |
| UCSC基因组浏览器BLAT搜索 | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat | 网络浏览器 | 利用 DNA 或蛋白质序列信息查找基因组区域的工具 |
| UCSC基因组浏览器网关 | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway | 网络浏览器 | UCSC基因组浏览器网关的直接链接 |
| 加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器主页 | https://genome.ucsc.edu/ | 网络浏览器 | UCSC基因组浏览器主页网站 |
| UCSC基因组浏览器轨道数据中心 | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs | 网络浏览器 | 直接链接至 Track Data Hubs/公共中心数据库，用于搜索并加载 PhyloCSF 轨道 |
| UCSC基因组浏览器用户指南 | https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html | 网络浏览器 | 全面用户指南：详细介绍如何使用 UCSC 基因组浏览器 |
| WoLF PSORT | https://wolfpsort.hgc.jp | 网络浏览器 | 蛋白质亚细胞定位预测工具 |
参考文献
- Collins, F. S., Morgan, M., Patrinos, A. The human genome project: lessons from large-scale biology. Science. 300 (5617), 286-290 (2003).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- Sachidanandam, R., <....
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