利用荧光蛋白标记物观察酵母细胞器

摘要

本文介绍了在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）活细胞成像中使用一组基于荧光蛋白的细胞器标记物的方法。

摘要

出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）是研究细胞器功能与动态的经典模式系统。在我们之前的研究中，已构建了基于荧光蛋白的主要细胞器和内膜结构的标记物，包括细胞核、内质网（ER）、高尔基体、内体、液泡、线粒体、过氧化物酶体、脂滴以及自噬体。本文所述方案详细介绍了在酵母中使用这些标记物的操作步骤，包括用于酵母转化的DNA制备、转化子的筛选与评估、荧光显微镜观察以及预期结果。本文内容面向从其他研究领域转入酵母细胞器研究的科研人员，涵盖了关键实验步骤，并提供了有关显微镜硬件配置的技术说明以及若干常见问题的注意事项。本方案为研究人员通过活细胞荧光显微镜观察酵母亚细胞结构提供了入门指导。这些工具和方法可用于鉴定蛋白质的亚细胞定位，并在时间序列成像中追踪目标细胞器。

引言

通过膜结合细胞器实现亚细胞区室化，是真核细胞组织结构中的一个普遍原则。每种细胞器都执行特定的功能。在真核生物的许多其他研究领域中一样，出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）在阐明细胞器组织与动态的基本原理方面，一直是经典的研究模型系统。例如，在蛋白质分泌途径、过氧化物酶体蛋白质导入途径以及自噬途径中的开创性发现即为典型范例^1,2,3。

在典型的营养丰富的条件下，快速生长的酵母细胞含有内质网（ER）、早期高尔基体、晚期高尔基体/早期早期内体、晚期内体、液泡和线粒体。此外还存在一些过氧化物酶体、脂滴和自噬体（数量比前两者更少，主要为Cvt小泡类型，这类结构在营养丰富的条件下存在⁴），但不如在特定培养条件（如富含脂质的培养基、饥饿培养基等）下显著。与其他常见的真核模式生物相比，酵母细胞体积较小；典型酵母细胞的直径约为5 µm，而大多数动物和植物细胞则为数十微米。因此，在通常只能容纳一个贴壁动物细胞的成像视野中，一般可观察到数十个处于不同细胞周期阶段的酵母细胞。除了尺寸差异外，酵母细胞器的形态也具有一些特殊特征。在超微结构水平上，酵母内质网由扁平囊泡和管状结构组成，与其他系统相似。在荧光显微镜下，酵母内质网表现为....

方案

1. 酵母菌株构建

1. 获取标记质粒和合适的酵母菌株。
   注意：质粒可从 Addgene 获得。本方案以 TN124（MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2）、BY4741（MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0）和 DJ03（BY4741 trp1Δ::MET15）为例。除科学问题本身的性质外，菌株选择的一个重要考虑因素是筛选标记的兼容性。此处描述的细胞器标记质粒使用 URA3 和 TRP1 作为筛选标记。因此，受体菌株的基因型必须为 ura3 和 trp1。否则，需对菌株或质粒进行相应改造。
2. 根据以下配方制备酵母培养基。
   注意：SMD（合成最低葡萄糖培养基；2% 葡萄糖，0.67% 不含氨基酸的酵母氮源基础（YNB），30 mg/L 腺嘌呤，30 mg/L 赖氨酸，30 mg/L 甲硫氨酸，20 mg/L 组氨酸，20 mg/L 尿嘧啶，50 mg/L 色氨酸，50 mg/L 亮氨酸）。SMD+CA（在 SMD 基础上添加 0.5% 酪蛋白氨基酸）。YPD（酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基；1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖）。SD-N（无氮合成葡萄糖培养基；0.17% 不含氨基酸和硫酸铵的 YNB，2% 葡萄糖）。有关培养基选择的注意事项，....

结果

细胞器的形态和动态会随着酵母细胞对外部和内部信号的响应而发生变化。此处，我们提供了酵母细胞在对数中期的细胞器代表性图像（图3A，B）。如前所述，某些细胞器具有独特的形态特征，因此无需与其他细胞器标记物进行广泛比对即可轻易识别，包括内质网（ER）、线粒体和液泡。需要注意的是，在某些实验室菌株中（包括我们此处展示的菌株），液泡的分裂-融合平衡发生偏移，导致许多对数生长期的细胞仅含有一个液泡。高尔基体、内体、脂滴和过氧化物酶体通常过于微小，普通光学显微镜难以分辨其轮廓，因此它们在显微镜下均表现为细胞质中的点状结构。确认这些结构的身份需要与其他细胞器标记物进行共定位比对，我们已在对数期细胞中针对本组标记物完成了此类验证⁷。

如引言部分所述，我们的大多数标记载体在基因组中可能发生多次整合。为避免不必要的复杂性，在通过荧光显微镜验证标记表达时，可筛选具有单拷贝整合的转化子（图2B）。携带多个拷贝.......

讨论

本文所述方案为来自其他研究领域的人员探索酵母细胞器成像提供了简单的起点。在进入具体主题之前，我们想再次强调，应避免过度使用成像软件中的自动功能。显微镜图像不仅仅是美观的图片，更是科学数据，因此其采集与解读应被相应地严肃对待。尤其重要的是，应审慎选择图像采集参数，并熟悉16位与8位图像之间的区别。

本实验方案列出了四种不同的酵母培养基：SMD、SMD+CA、YPD 和 SD-N。SMD 是“合成最低葡萄糖培养基”（synthetic minimal dextrose）的缩写。SMD 的优点是自发荧光较低，因此是荧光成像的首选培养基。SMD+CA 含有酪蛋白氨基酸（casamino acids），比 SMD 提供更丰富的营养，但其局限性在于不再完全是合成培养基。YPD 营养丰富，适合作为酵母细胞培养的通用培养基，但由于其自发荧光较高，因此在成像应用中不太理想。SD-N 是一种氮饥饿培养基，可用于诱导自噬及脂滴的增殖。SD-N 也是合成培养基，且产生低水平的自发荧光。

请注意，本实验方案中使用的SMD培养基配方所含的氨基酸和核碱基补.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺嘌呤	Sangon Biotech	A600013
酪蛋白氨基酸	Sangon Biotech	A603060
刀豆蛋白A（来自菜豆，Jack bean）	Sigma Aldrich	L7647
D-葡萄糖	Sangon Biotech	A501991
Fiji			https://fiji.sc/
玻璃底培养皿	NEST	706001	Φ35 mm
ImageJ			https://imagej.net/
倒置荧光显微镜	Olympus		IX83，配备UPLXAPO 100X油浸物镜、Lumencor Spectra X光源和Hamamatsu Orca Flash4.0 LT相机。
L-组氨酸	Sangon Biotech	A604351
L-亮氨酸	Sangon Biotech	A100811
L-赖氨酸	Sangon Biotech	A602759
L-甲硫氨酸	Sangon Biotech	A100801
L-色氨酸	Sangon Biotech	A601911
显微镜盖玻片	CITOTEST	10222222C	22 mm × 22 mm，0.16–0.19 mm
显微镜载玻片	CITOTEST	1A5101	25 mm × 75 mm，1–1.2 mm
蛋白胨	Sangon Biotech	A505247
尿嘧啶	Sangon Biotech	A610564
VisiView	Visitron System GmbH		https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
酵母提取物	Sangon Biotech	A100850
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基	Sangon Biotech	A610507
不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础培养基	Sangon Biotech	A600505