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方法文章

利用荧光蛋白标记物观察酵母细胞器

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DOI：

10.3791/63846

⸱

2022年4月20日

 ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Metabolism & Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University

本文内容

摘要

本文介绍了在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）活细胞成像中使用一组基于荧光蛋白的细胞器标记物的方法。

摘要

出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）是研究细胞器功能与动态的经典模式系统。在我们之前的研究中，已构建了基于荧光蛋白的主要细胞器和内膜结构的标记物，包括细胞核、内质网（ER）、高尔基体、内体、液泡、线粒体、过氧化物酶体、脂滴以及自噬体。本文所述方案详细介绍了在酵母中使用这些标记物的操作步骤，包括用于酵母转化的DNA制备、转化子的筛选与评估、荧光显微镜观察以及预期结果。本文内容面向从其他研究领域转入酵母细胞器研究的科研人员，涵盖了关键实验步骤，并提供了有关显微镜硬件配置的技术说明以及若干常见问题的注意事项。本方案为研究人员通过活细胞荧光显微镜观察酵母亚细胞结构提供了入门指导。这些工具和方法可用于鉴定蛋白质的亚细胞定位，并在时间序列成像中追踪目标细胞器。

引言

通过膜结合细胞器实现亚细胞区室化，是真核细胞组织结构中的一个普遍原则。每种细胞器都执行特定的功能。在真核生物的许多其他研究领域中一样，出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）在阐明细胞器组织与动态的基本原理方面，一直是经典的研究模型系统。例如，在蛋白质分泌途径、过氧化物酶体蛋白质导入途径以及自噬途径中的开创性发现即为典型范例1,2,3。

在典型的营养丰富的条件下，快速生长的酵母细胞含有内质网（ER）、早期高尔基体、晚期高尔基体/早期早期内体、晚期内体、液泡和线粒体。此外还存在一些过氧化物酶体、脂滴和自噬体（数量比前两者更少，主要为Cvt小泡类型，这类结构在营养丰富的条件下存在4），但不如在特定培养条件（如富含脂质的培养基、饥饿培养基等）下显著。与其他常见的真核模式生物相比，酵母细胞体积较小；典型酵母细胞的直径约为5 µm，而大多数动物和植物细胞则为数十微米。因此，在通常只能容纳一个贴壁动物细胞的成像视野中，一般可观察到数十个处于不同细胞周期阶段的酵母细胞。除了尺寸差异外，酵母细胞器的形态也具有一些特殊特征。在超微结构水平上，酵母内质网由扁平囊泡和管状结构组成，与其他系统相似。在荧光显微镜下，酵母内质网表现为两个环状结构，其间具有一些连接结构。内环为核内质网，与核膜连续；外环为外周内质网，是由位于质膜下方的管状网络构成5。与植物细胞类似但不同于动物细胞的是，一种混合型细胞器——晚期高尔基体/早期内体——位于分泌途径与内吞途径的交汇处6,7。形态学上，酵母高尔基体分散分布于细胞质中。液泡在功能上类似于动物细胞中的溶酶体，常占据细胞质的较大区域，并频繁发生分裂与融合。除了使用荧光共定位标记外，液泡膜与核内质网可通过至少两个标准加以区分：液泡膜通常比核内质网更圆润，且在微分干涉差（DIC）图像中，液泡的凹陷形态也比细胞核更为明显。

通常，我们使用一组基于荧光蛋白的标记物来在活酵母细胞中可视化上述细胞器（表1这些细胞器标记物的保真度和功能已通过实验验证7,8这些标记载体旨在将荧光蛋白融合表达盒插入酵母基因组。如下所述，在进行酵母转化前，通过酶切消化或PCR扩增的方法制备线性DNA片段。7,8线性DNA片段整合到基因组中 通过 同源重组。本方案中所描述的质粒采用三种设计类型。第一种类型涵盖了大多数质粒，通常可获得携带多个拷贝构建体的转化子。这种情况通常不理想，因为它会在不同转化子之间引入表达水平甚至功能上的变异。单拷贝转化子需通过本方案所述的成像方法、免疫印迹或精心设计的PCR检测来鉴定。第二种类型包括GFP-Sed5、GFP-Pep12和GFP-Atg8，在单倍体酵母细胞中仅产生单拷贝整合。第一和第二种类型的质粒均在基因组中保留标记基因的内源拷贝完整。第三种质粒设计类型包括Sec7-2GFP和Vph1-2GFP，旨在实现C末端敲入，从而使融合蛋白成为相应标记基因的唯一拷贝。

本文介绍了如何使用这些细胞器标记物，提供了显微成像的示例图像，并讨论了针对初次进行酵母细胞器成像的研究人员所需的注意事项。

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方案

1. 酵母菌株构建

  1. 获取标记质粒和合适的酵母菌株。
    注意：质粒可从 Addgene 获得。本方案以 TN124（MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2）、BY4741（MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0）和 DJ03（BY4741 trp1Δ::MET15）为例。除科学问题本身的性质外，菌株选择的一个重要考虑因素是筛选标记的兼容性。此处描述的细胞器标记质粒使用 URA3 和 TRP1 作为筛选标记。因此，受体菌株的基因型必须为 ura3 和 trp1。否则，需对菌株或质粒进行相应改造。
  2. 根据以下配方制备酵母培养基。
    注意：SMD（合成最低葡萄糖培养基；2% 葡萄糖，0.67% 不含氨基酸的酵母氮源基础（YNB），30 mg/L 腺嘌呤，30 mg/L 赖氨酸，30 mg/L 甲硫氨酸，20 mg/L 组氨酸，20 mg/L 尿嘧啶，50 mg/L 色氨酸，50 mg/L 亮氨酸）。SMD+CA（在 SMD 基础上添加 0.5% 酪蛋白氨基酸）。YPD（酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基；1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖）。SD-N（无氮合成葡萄糖培养基；0.17% 不含氨基酸和硫酸铵的 YNB，2% 葡萄糖）。有关培养基选择的注意事项，请参见讨论部分。
  3. 在转化步骤之前，通过酶切消化或 PCR 扩增细胞器标记质粒，制备线性化 DNA 片段。
    注意：表 1 列出了用于从细胞器标记质粒生成线性片段的限制性内切酶位点和 PCR 引物。
  4. 在液体 YPD 培养基中培养酵母细胞，并用线性 DNA 片段转化酵母。
    注意：酵母转化可采用传统的基于 LiAc 的方法9 或其他合适的方法。建议设置适当的转化对照，特别是以无质粒或无质粒来源 DNA 的阴性对照。
  5. 在适当的筛选平板上（例如，对于 URA3 筛选，使用 SMD-Ura 培养基），于 30 °C 培养 2–3 天。
    注意：单菌落通常约需 2 天出现。
  6. 为验证荧光融合蛋白的表达及整合拷贝数，从筛选平板上挑取八个菌落，在新的筛选平板上重新划线，并于 30 °C 培养。

2. 荧光显微镜：常规操作与单时间点成像

  1. 在30 °C条件下，于SMD液体培养基中振荡培养酵母细胞过夜。
  2. 次日早晨，使用分光光度计或酶标仪测定酵母培养物在600 nm处的光密度（下文简称OD600）。
    注意：经过一定量的酵母接种操作练习后，通常可确保所有样品在此阶段的OD600低于2。若OD值过高，建议在下一步中进一步稀释，并给予酵母细胞更长的恢复时间。
  3. 使用新鲜培养基将酵母培养物稀释至约0.2 OD600。
  4. 继续培养，直至OD600达到约0.8–1.0。
    注意：酵母的倍增时间约为1.5–2小时。
  5. 将盖玻片平放在纸巾上，在其上表面滴加5 µL浓度为1 mg/mL的刀豆蛋白A，静置5分钟（图1A）10。
    注意：此预处理步骤可提前完成。
  6. 将100 µL酵母培养物转移至盖玻片上表面，静置5分钟。
  7. 将盖玻片与载玻片组合，使酵母细胞夹在两者之间；施加适当压力以固定细胞。
    注意：需经过一定练习以掌握合适的压力，使酵母细胞形成稳定且不移动的单层，同时避免细胞被压碎（图1B）。在此过程中，液体培养基会被挤出并被下方的纸巾吸收。
  8. 将样品载玻片安装至显微镜载物台上，使用微分干涉差（DIC）或相差（PC）照明方式定位并聚焦于一片酵母细胞区域。
    注意：请勿使用荧光模式定位细胞，否则可能导致信号在数据采集前发生漂白。
  9. 手动设置三组参数以采集图像z堆栈：z轴切片设置、成像通道及曝光参数。
    注意：参见补充图1中某商业软件中参数设置的图形用户界面示例。不同软件平台的界面外观可能不同，但选项内容基本一致。
    1. z轴切片：以0.5 µm为步进，采集15层切片（覆盖7 µm深度，通常足以满足普通单倍体酵母细胞的成像需求）。
    2. 成像通道：选择DIC或PC用于细胞轮廓成像，并根据需要选择适当的荧光通道。
    3. 激发光强度与曝光时间：根据样品情况设置适当的激发光强度和曝光时间。
      注意：初始设置可采用100%激发光强度和100 ms曝光时间；若在z堆栈采集过程中出现明显光漂白，或信号超出相机记录能力（即信号饱和），则应降低激发光强度；若信噪比较低，则可适当提高激发光强度。
  10. 记录成像参数，并对所有待比较样品使用完全相同的设置。
    注意：数据采集和图像可视化过程中请勿使用"自动"模式。务必在实验记录本中记录参数设置，以便在后续重复实验时精确复现相同条件。部分显微镜控制软件具备保存和重新调用参数设置的功能；即便如此，仍建议独立记录参数，以防软件配置文件被同事意外删除或修改。
  11. 以16位多通道堆栈格式保存数据。
    注意：请勿保存为8位RGB图像（或24位，若计算三通道总和）。有关8位格式的局限性，请参见图像可视化部分（第4节）。
  12. 下一次图像堆栈采集时，应移动至完全不同的区域。
    ​注意：相邻区域可能已受到光漂白和光毒性影响，由此采集的图像堆栈可能产生误导性结果。

3. 时间序列成像

注意：延时成像的步骤在两个方面与单时间点成像不同：样品制备和成像参数。

  1. 样品制备
    1. 用 1 mg/mL 刀豆球蛋白 A 涂覆一个 35 mm 玻璃底培养皿，静置 5 分钟或更长时间。
    2. 向培养皿中加入 1.5 mL 酵母液体培养物，静置 5 分钟，使酵母细胞沉降到玻璃表面。
    3. 使用移液器从培养皿边缘吸除液体培养基，然后用约 1 mL 新鲜培养基轻轻冲洗酵母沉淀区域，以去除未牢固附着的细胞。
    4. 重复冲洗 2–3 次。用移液器吸除液体后，再缓慢加入 2 mL 新鲜培养基。
  2. 成像参数
    1. Z 轴层扫：以 0.5 µm 步长采集 15 层切片。
    2. 成像通道：根据需要选择。
    3. 激发光强度和曝光时间：使用能够分辨目标亚细胞结构所需的最低值。
      注：对于延时成像，由于反复照明引起的光漂白和光毒性会限制可采集的时间点总数。因此，通常将激发光强度和曝光时间设置为较低值，以便采集更多时间点。
    4. 成像时间间隔：根据所研究的生物学过程设置合适的时间间隔。
      注：例如，在饥饿条件下自噬体的形成大约需要 5–10 分钟；为了追踪其动态变化，建议使用 1 分钟或更短的时间间隔。在营养丰富的条件下，酵母细胞周期以小时为单位进行；可采用较长的时间间隔，如 10–20 分钟。
  3. 如有合适的硬件设备，将培养皿温度维持在 30 °C。
    ​注：除整体速度较慢外，酵母细胞中的大多数生物学过程也可在室温（RT）下进行成像。

4. 图像堆栈的可视化及整合拷贝数的评估

  1. 安装 Fiji 或 ImageJ 软件用于图像可视化与分析11,12.
    注意：Fiji 是基于 ImageJ 的工具集合，适用于通用的生物图像数据可视化与处理。本方案中所列的图像处理，使用无附加插件的 ImageJ 即可完成。
  2. 选择适当的参数以进行图像显示和比较。
    1. 在 Fiji 中打开几个 z-stack 图像。
    2. 将每个图像堆栈的 z 轴位置拖动至中段（或根据所研究结构的可视化需求选择其他合适位置）。
    3. 前往 图像 > 调节 > 亮度/对比度 并点击 重置.
    4. 在 亮度/对比度 (B&C）窗口中，使用滚动条调整两个参数， 最低限度 和 最大值 数值，以清晰识别所研究的结构。
      注意：通常情况下， 最低值 值被设定为接近空白区域的平均值，且 最大值 应设置为接近图像中的最大值。这些数值可从显示的直方图中推断得出。图 2A如果成像工作站已进行色彩校准，可将最小值设得稍高一些，以隐藏更多的背景信号。
    5. 在 亮度/对比度 (B&C) 窗口中，单击 设置 并选择 传播至所有其他打开的图像 弹出窗口中的复选框 设置显示范围.
      注意：此操作应用相同的亮度/对比度设置（包括最小值 & 最大值）应用于所有已打开的图像，以便对图像进行交叉比较。
    6. 观察不同图像，并逐层浏览每个图像的z轴层切。如果图像背景较暗、无明显过饱和现象且成像效果良好，请记录下 最低限度 和 最大值 设置
  3. 对于多通道图像，为每个通道选择图像显示设置：
    1. 前往 图像 > 颜色 > 通道工具，选择 灰度 弹出窗口中的模式 通道.
    2. 逐个检查每个通道，选择合适的 亮度/对比度 针对该通道，并记录下设置参数。
    3. 随着 亮度/对比度 调整后，返回“通道”窗口并更改为 复合材料 用于多通道同步成像的模式。
      注意：可根据个人偏好在“通道”中手动更改各通道的伪彩色。复选框用于显示或隐藏特定通道。
  4. 如有需要，使用复选框中的选项 通道 窗口用于显示或隐藏特定通道。
  5. 如有需要，可通过以下步骤生成图像堆栈投影： 图像 > 堆叠 > Z轴投影.
    注意：提供多种投影模式可供选择。最大强度投影适用于快速评估。应根据研究的具体性质，确定是否使用特定的投影模式或单个切片进行定量分析。此外，投影可限定于选定的 z 切片，以减少离焦光的干扰。
  6. 筛选单拷贝整合转化子。
    1. 一旦相同 亮度/对比度 所有已打开的图像均应用相同的设置，通过比较各样品间的图像强度来推断质粒整合数量。
      注意：图像采集应遵循单时间点成像的一般流程，从液体培养基中过夜培养开始。多拷贝整合（参见克隆2 & 3 在 图2B 例如）明显比单拷贝的更亮（1号菌落） 图2B）。相比之下，单拷贝序列彼此之间看起来相似图2B).
    2. 对每种菌株的八个转化子图像进行观察，确保使用相同的 亮度/对比度 设置
    3. 重新划线培养并保存三个或更多单拷贝转化子以供后续研究。
  7. 导出图像用于展示。
    1. 前往 图像 > 重复 复制感兴趣图像，并为其命名。
    2. 前往 图像 > 类型 > 8位 根据需要将副本从16位转换为8位并保存。
      注意：请知晓，一旦应用此操作，如果 亮度/对比度 如果之前未记录这些设置，则无法轻松检索该信息，因此也无法在后续的图像可视化中轻松重新应用相同的设置。这也是建议之前进行复制操作的原因。
    3. 要将一个Z轴图像序列拆分为一系列单独的图像，请前往 图像 > 堆叠 > 堆栈转图像 根据需要保存。
      注意：在 Fiji 中也可以将图像裁剪为更小的区域。

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结果

细胞器的形态和动态会随着酵母细胞对外部和内部信号的响应而发生变化。此处，我们提供了酵母细胞在对数中期的细胞器代表性图像（图3A，B）。如前所述，某些细胞器具有独特的形态特征，因此无需与其他细胞器标记物进行广泛比对即可轻易识别，包括内质网（ER）、线粒体和液泡。需要注意的是，在某些实验室菌株中（包括我们此处展示的菌株），液泡的分裂-融合平衡发生偏移，导致许多对数生长期的细胞仅含有一个液泡。高尔基体、内体、脂滴和过氧化物酶体通常过于微小，普通光学显微镜难以分辨其轮廓，因此它们在显微镜下均表现为细胞质中的点状结构。确认这些结构的身份需要与其他细胞器标记物进行共定位比对，我们已在对数期细胞中针对本组标记物完成了此类验证7。

如引言部分所述，我们的大多数标记载体在基因组中可能发生多次整合。为避免不必要的复杂性，在通过荧光显微镜验证标记表达时，可筛选具有单拷贝整合的转化子（图2B）。携带多个拷贝...

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讨论

本文所述方案为来自其他研究领域的人员探索酵母细胞器成像提供了简单的起点。在进入具体主题之前，我们想再次强调，应避免过度使用成像软件中的自动功能。显微镜图像不仅仅是美观的图片，更是科学数据，因此其采集与解读应被相应地严肃对待。尤其重要的是，应审慎选择图像采集参数，并熟悉16位与8位图像之间的区别。

本实验方案列出了四种不同的酵母培养基：SMD、SMD+CA、YPD 和 SD-N。SMD 是“合成最低葡萄糖培养基”（synthetic minimal dextrose）的缩写。SMD 的优点是自发荧光较低，因此是荧光成像的首选培养基。SMD+CA 含有酪蛋白氨基酸（casamino acids），比 SMD 提供更丰富的营养，但其局限性在于不再完全是合成培养基。YPD 营养丰富，适合作为酵母细胞培养的通用培养基，但由于其自发荧光较高，因此在成像应用中不太理想。SD-N 是一种氮饥饿培养基，可用于诱导自噬及脂滴的增殖。SD-N 也是合成培养基，且产生低水平的自发荧光。

请注意，本实验方案中使用的SMD培养基配方所含的氨基酸和核碱基补...

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致谢

作者感谢谢实验室成员在手稿准备过程中提供的大力支持。本工作得到国家自然科学基金（项目编号 91957104）、上海市教育委员会（项目编号 2017-01-07-00-02-E00035）和上海市科学技术委员会（项目编号 22ZR1433800）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺嘌呤Sangon BiotechA600013
酪蛋白氨基酸Sangon BiotechA603060
刀豆蛋白A（来自菜豆，Jack bean）Sigma AldrichL7647
D-葡萄糖Sangon BiotechA501991
Fijihttps://fiji.sc/
玻璃底培养皿NEST706001Φ35 mm
ImageJhttps://imagej.net/
倒置荧光显微镜OlympusIX83，配备UPLXAPO 100X油浸物镜、Lumencor Spectra X光源和Hamamatsu Orca Flash4.0 LT相机。
L-组氨酸Sangon BiotechA604351
L-亮氨酸Sangon BiotechA100811
L-赖氨酸Sangon BiotechA602759
L-甲硫氨酸Sangon BiotechA100801
L-色氨酸Sangon BiotechA601911
显微镜盖玻片CITOTEST10222222C22 mm × 22 mm，0.16–0.19 mm
显微镜载玻片CITOTEST1A510125 mm × 75 mm，1–1.2 mm
蛋白胨Sangon BiotechA505247
尿嘧啶Sangon BiotechA610564
VisiViewVisitron System GmbHhttps://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
酵母提取物Sangon BiotechA100850
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基Sangon BiotechA610507
不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础培养基Sangon BiotechA600505

参考文献

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  2. Spang, A. Anniversary of the discovery of sec mutants by Novick and Schekman. Molecular Biology of the Cell. 26 (10), 1783-1785 (2015).
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  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
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