使用酶标仪提高细菌生长数据高通量定量的重现性和精度

Summary

这里提出了一种高通量方案来测量生长数据，包括生长曲线、生长速率和最大生长速率。该方案使用两种产生生物膜的细菌进行了验证和确认。本研究中应用的结果和方法可以扩展到使用酶标仪的其他高通量方案。

Abstract

本研究旨在开发一种可重复、可靠、高通量的方案，以监测 96 孔板中的细菌生长并分析最大生长速率。测定 2 种细菌的生长曲线和最大生长速率。研究了包括 （i） 盖子冷凝、（ii） 光程校正、（iii） 接种大小、（iv） 采样时间间隔和 （v） 空间偏差在内的问题。通过三个独立的技术重复来评估方案的可重复性，运行之间的标准差为 0.03。芽 孢杆菌 和 苔原芽 孢杆菌的最大生长速率分别为 （平均值 ± SD） 0.99 ^h-1 ± 0.03 ^h-1 和 0.85 ^h-1 ± 0.025 ^h-1。这些细菌由于具有聚集在一起的亲和力，因此在光学监测中更具挑战性。这项研究证明了接种大小、光程校正、盖子升温、采样时间间隔和孔板空间偏差对于在酶标仪上获得可靠、准确和可重复的数据至关重要。开发的方案及其验证步骤可以扩展到使用酶标仪和高通量方案的其他方法，从而减少研究人员的先天误差和材料成本。

Introduction

对多组学作（包括细菌的机制和代谢研究）的兴趣日益浓厚，强调了高通量和自动化方法的重要性，例如记录生长数据 ^1,2。包含动力学参数（例如最大生长速率）的生长数据有助于表征细菌对不同物理、化学和抗菌条件的反应。生长速率数据是用于揭示潜在基因型-表型联系¹ 或指示食品的微生物安全性和保质期的标准响应变量 ^3,4。适应性实验室进化^5,6,7、全基因组筛选、某些化学测定⁸（certain chemical assays）和各种正向遗传筛选⁹（forward genetic screening）等技术都依赖于生长速率来评估结果。

细菌培养物的光密度 （OD） 测量是监测细菌生长的标准微生物学方法。OD 测量值通常在 60....

Protocol

注意:必须在无菌条件下（即，在两个火焰或生物安全柜之间）遵循本协议中的所有步骤。所有材料和工具均高压灭菌 20 分钟。有关本协议中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表 。戴手套的手进行消毒，用手部消毒剂或 70% 酒精溶液保持湿润至少 1 分钟，之后不要从安全柜中取出。否则，在将手放回安全柜之前，必须重复消毒程序。注意: 使用明火前，请确保消毒剂完全蒸发。

注意:如前所述²⁷ 从饮用水生物过滤中分离出两种细菌，因为它们能够产生生物膜。它们通过全 16S rRNA 测序鉴定并提交给 NCBI 作为 Bacillus mycoides （SAMN10518261） 和 Paenibacillus tundrae （SAMN10452279）。

1. 在甘油中制备细菌原液

1. 称取 3 g 胰蛋白酶酱油汤 （TSB） 粉末，将其溶解在 100 mL 蒸馏水中。将肉汤高压灭菌 20 分钟，然后冷却至室温。向 50 mL 培养瓶中加入 50 mL TSB。
2. 将细菌转移到琼脂平板^27,28 中。使用环，从琼脂平板中挑选一个细菌菌落。轻轻旋转 Lo....

Results

OD 读数验证和光程校正因子
在不同时间点采集 B. mycoides 培养物的分离样品，并使用酶标仪和分光光度计进行测量（图 1A）。采取此步骤是为了验证不同设备上的结果。OD₆₀₀ 数据相关但不匹配（图 1B）。相关性呈线性，斜率为 0.55 （95% 置信区间 [CI]: 0.53-0.58，R² = 0.99），表明两种工具之间存在恒定的偏移量（斜率）。拟合优度检验发现均方根误差 （RMSE） 和估计标准误差 （Sy.x） 为 0.01，证实了高相关性准确度。

.......

Discussion

微孔板读板机可获得一致且可重复的生长速率。该技术可最大限度地减少人为错误并实现高通量采样。每个样品所需的少量培养物使该方法成为使用培养瓶或试管进行细胞计数的有吸引力的低成本替代方案。微孔板检测仪允许较大的样品量，从而提高统计功效，从而促进可靠的生长速率计算，同时保持较低的成本和劳动力。

本文介绍了测量和分析生长数据的详细方案。该方案用 B. mycoides 和 P. tundrea 进行了验证。由于这些细菌能够产生生物膜，因此从全尺寸饮用水生物过滤器中分离出来，这使得生长数据评估更具挑战性。

确定了可靠和准确测量的几个重要因素:光程校正、眼睑冷凝、接种量、读取间隔和空间偏差（图 6）。光程校正对于获得准确的结果至关重要，可以自动或回顾性地确定和应用。通过使用分光光度计进行交叉校准验证的数据表明，光程校正对于特定样品体积、盖子和孔板类型非常重要。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
离心机	Eppendorf	5810 R
离心管 - 15 mL	ThermoFisher - 科学	339650	无菌
离心管 - 50 mL	ThermoFisher - 科学	339652	无菌
一次性接种环，10 µL	科尔-帕尔默	UZ-06231-08	无菌
锥形瓶 - 250 mL	科尔-帕尔默	UZ-34502-59	玻璃
异丙醇	ThermoFisher - 科学	396982500	≥99.0
磷酸盐缓冲盐水	Sigma-Aldrich	P4417
Pipett 吸头 1,000 和微量;L	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-76
移液吸头 10 mL	ThermoFisher - 科学	UZ-25001-83
Pipett 吸头 200 和微量;L	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-85
移液器吸头 5 mL	ThermoFisher - 科学	UZ-25001-80
移液器 1,000 和微量;L	科尔-帕尔默	UZ-07909-11
移液器 10 mL	Cole-Parmer	UZ-07909-15
移液器 200 &L	科尔-帕尔默	UZ-07909-09
移液器 5 mL	科尔-帕尔默	UZ-07859-30
胰蛋白酶大豆肉汤	Millipore	22091	适用于微生物学