使用微孔板读数仪提高细菌生长数据高通量定量的可重复性与精确性

摘要

本文介绍了一种高通量的实验方案，用于测量生长数据，包括生长曲线、生长速率和最大生长速率。该方案通过两种生物膜形成细菌进行了验证和确认。本研究中的结果和方法可拓展应用于其他基于微孔板读板仪的高通量实验方案。

摘要

本研究旨在建立一种可重复、可靠且高通量的实验方案，用于在96孔板中监测细菌生长并分析其最大生长速率。实验测定了两种细菌的生长曲线及其最大生长速率，并探讨了以下关键问题：（i）盖子冷凝、（ii）光程校正、（iii）接种量、（iv）采样时间间隔以及（v）孔板空间偏差。通过三次独立的技术重复实验评估了该方案的可重复性，各次运行之间的标准差为0.03。结果显示，Bacillus mycoides 和 Paenibacillus tundrae 的最大生长速率分别为 （均值 ± 标准差）0.99 h⁻¹ ± 0.03 h⁻¹ 和 0.85 h⁻¹ ± 0.025 h⁻¹。由于这两种细菌易于聚集，因此在光学监测上更具挑战性。本研究证明了接种量、光程校正、加热盖板、采样时间间隔以及微孔板空间偏差对于在微孔板读数仪上获得可靠、准确且可重复数据的关键重要性。所建立的实验方案及其验证步骤可推广至其他基于微孔板读数仪和高通量技术的方法，有助于减少研究人员的操作误差和材料成本。

引言

对包括细菌机制和代谢研究在内的多组学操控产生兴趣，凸显了高通量和自动化方法的重要性，例如记录生长数据^1,2。包含动力学参数（如最大生长速率）的生长数据有助于表征细菌在不同物理、化学和抗菌条件下的响应。生长速率数据是揭示潜在基因型-表型关联¹ 或指示食品微生物安全性和保质期^3,4 的标准响应变量。适应性实验室进化^5,6,7、全基因组筛选、某些化学检测⁸ 以及多种正向遗传筛选⁹ 等技术均依赖生长速率来评估实验结果。

细菌培养物的光密度（OD）测定是监测细菌生长的标准微生物学方法。OD 测定通常在 600 nm 波长下进行，其原理基于光散射和细胞密度^10,11。比尔....

方案

注意：本实验方案中的所有步骤都必须在无菌条件下进行（即在两处火焰之间或生物安全柜内操作）。所有材料和工具均需高压灭菌 20 分钟。有关本实验方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。操作时需对戴着手套的双手进行消毒，并用手部消毒剂或 70% 酒精溶液保持湿润至少 1 分钟，之后不得将手移出安全柜。若手部离开安全柜，则在重新放入前必须重复消毒程序。警告：使用明火前，务必确保消毒剂已完全挥发。

注意：两种细菌此前已报道过²⁷，它们是从饮用水生物滤池中分离得到的，因其具有形成生物膜的能力。通过全长16S rRNA测序鉴定，并提交至NCBI，分别为Bacillus mycoides (SAMN10518261)和Paenibacillus tundrae (SAMN10452279)。

1. 准备甘油细菌保存液

1. 称取3 g胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic soy broth, TSB）粉末，溶于100 mL蒸馏水中。将肉汤在高压灭菌器中灭菌20分钟，然后冷却至室温。向50 mL锥形瓶中加入50 mL TSB。
2. 将细菌转移至琼脂平板上^27,28

结果

OD 读数验证与光程校正因子
在不同时间点采集 B. mycoides 培养物的分装样品，并使用微孔板读数仪和分光光度计进行测定（图 1A）。此步骤用于验证不同设备之间的结果一致性。OD₆₀₀ 数据呈相关性但数值不完全一致（图 1B）。二者呈线性相关，斜率为 0.55（95% 置信区间 [CI]：0.53–0.58，R² = 0.99），表明两台仪器之间存在恒定的偏移（斜率）。拟合优度检验得出均方根误差（RMSE）和估计标准误差（Sy.x）均为 0.01，证实了高度的相关准确性。

讨论

酶标仪可获得一致且可重复的生长速率。该技术能最大限度地减少人为误差，并实现高通量取样。由于每个样品所需的培养物量较少，这种方法相较于使用锥形瓶或试管进行细胞计数，具有成本低、吸引力强的优势。酶标仪支持较大的样本量，在保持低成本和低劳动强度的同时，提高了统计效能，进而有助于可靠地计算生长速率。

本文介绍了一种测量和分析生长数据的详细实验方案。该方案已使用B. mycoides和P. tundrea进行验证。这些细菌分离自一个实际规模的饮用水生物滤池，因其具有形成生物膜的能力，使得生长数据的评估更具挑战性。

确定了影响可靠且准确测量的几个重要因素：光程校正、盖子冷凝、接种量、读数间隔和空间偏差（图6）。光程校正是获得准确结果的关键，可自动或事后进行测定和应用。通过与分光光度计交叉校准验证的数据表明，针对特定样品体积、盖子和微孔板类型进行光程校正至关重要。

数据采集过程中盖子产生冷凝.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机	Eppendorf	5810 R
15 mL 离心管	ThermoFisher- Scientific	339650	无菌
50 mL 离心管	ThermoFisher- Scientific	339652	无菌
一次性接种环，10 µL	Cole-Parmer	UZ-06231-08	无菌
250 mL 锥形瓶	Cole-Parmer	UZ-34502-59	玻璃
异丙醇	ThermoFisher- Scientific	396982500	≥99.0
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417
1,000 µL 移液器吸头	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-76
10 mL 移液器吸头	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-83
200 µL 移液器吸头	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-85
5 mL 移液器吸头	ThermoFisher- Scientific	UZ-25001-80
1,000 µL 移液器	Cole-Parmer	UZ-07909-11
10 mL 移液器	Cole-Parmer	UZ-07909-15
200 µL 移液器	Cole-Parmer	UZ-07909-09
5 mL 移液器	Cole-Parmer	UZ-07859-30
胰蛋白酶大豆肉汤	Millipore	22091	适用于微生物学