由于测序技术的广泛应用，已在蚊子中发现大量新型类病毒序列。我们提供了一种利用脊椎动物和蚊子细胞系分离与扩增病毒的有效方法，该方法可为未来针对蚊媒病毒及蚊子特异性病毒的研究提供基础。
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摘要
摘要
随着测序技术的广泛应用，已在节肢动物（包括蚊虫）中发现许多新的类病毒序列。这些新发现的蚊虫相关病毒主要分为两类："蚊媒病毒（MBVs）"和"蚊虫特异性病毒（MSVs）"。这些新病毒可能对脊椎动物和蚊虫均具有致病性，也可能仅与蚊虫共生。分离病毒对于确认这些病毒的生物学特性至关重要。因此，本文详细描述了一种从野外采集的蚊虫中分离和扩增病毒的实验方案。首先，将蚊虫样品制备为蚊虫匀浆液的上清液。经过两次离心后，将上清液接种至蚊虫细胞系C6/36或脊椎动物细胞系BHK-21中以进行病毒扩增。7天后，收集上清液作为P1代上清液，并于-80 °C保存。随后，将P1代上清液在C6/36或BHK-21细胞中再连续传代两次，同时每日观察细胞状态。当观察到细胞出现细胞病变效应（CPE）时，收集上清液用于病毒鉴定。该方案为今后开展蚊虫相关病毒（包括MBVs和MSVs）的研究奠定了基础。
引言
蚊子是一类重要的节肢动物病原传播媒介。蚊科（Culicidae）包含约3500种蚊子1,2。高通量测序技术的发展使得研究人员从世界各地的蚊子中发现了大量新型的类病毒序列3。通常，这些与蚊子相关的病毒可分为两大类：蚊媒病毒（MBVs）和蚊特异性病毒（MSVs）。
节肢动物媒介病毒（MBVs）是一类多样的病毒，可引起多种人类或动物疾病，例如黄热病病毒（YFV）、登革热病毒（DENV）、日本脑炎病毒（JEV）、西尼罗河病毒（WNV）和裂谷热病毒（RVFV）4。这些病毒在全球范围内导致人类和动物严重的发病率和死亡率，对公共卫生构成严重威胁。MBVs 在自然界中通过从感染的蚊子传播给易感宿主，以及从病毒感染的宿主传播给吸血蚊子的方式，在多种宿主间维持其生命周期5。因此，这些病毒在实验室中能够感染蚊子细胞系和脊椎动物细胞系1。
蚊媒病毒（MSVs），包括宜昌病毒（YCN）、库蚊黄病毒（CxFV）和朝阳病毒（CHAOV），是一类昆虫特异性病毒的亚群1,6,7。近年来，新MSVs的发现数量不断增加，其中一些MSVs被发现会影响蚊媒病毒（MBVs）的传播。例如，库蚊黄病毒（CxFV）可在致倦库蚊（Culex pipiens）中建立持续性感染，并在早期阶段抑制西尼罗病毒（WNV）的复制8。另一种昆虫特异性黄病毒——细胞融合剂病毒（CFAV）——被发现可抑制埃及伊蚊（Aedes aegypti）体内登革病毒（DENV）和寨卡病毒（ZIKV）的增殖9。因此，本方案是分离蚊虫相关病毒的有效方法，有助于进一步研究蚊媒病原体的分布及蚊媒疾病的防控。
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方案
1. 蚊虫采样与分选
- 在野外使用 MXA-02 光诱捕蚊器或二氧化碳蚊虫捕集器捕获成蚊。
- 将采集到的蚊虫浸入液氮中致死10,11，并通过冷链运输系统运送至实验室12。
注意：冷链运输系统主要使用干冰。 - （可选）若采样地点靠近实验室，可直接将网捕的活蚊送至实验室，并在 ≤-20 °C 条件下冷冻 30 分钟以实施安乐死4。
- 利用蚊虫分类鉴定工具书对采集的蚊虫进行形态学鉴定13。
注意：如有必要，可采用DNA条形码技术对蚊虫进行分类与鉴定14,15。 - 根据采样日期和采样地点，将蚊虫分组为不同的样本池 ，然后将其储存于 2–5 mL 的离心管中。
- 绘制表格，记录每管中蚊虫的种类、数量、采样编号、日期和采样地点。
- 打印带有采样编号的标签并粘贴至各管上。
- 将含有蚊虫样本的离心管保存于 -80 °C 环境中，待后续分析使用。
2. 蚊虫研磨
- 将20-50只蚊子放入含有3 mm陶瓷珠的2 mL无菌管中，每管加入1.5 mL含2%青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）培养基。
注意：将试管置于冰上或冰盒中保存。 - 使用低温组织匀浆器在4 °C条件下以70 Hz频率研磨30秒，重复3个循环，对蚊子进行匀浆处理16。
- 在4 °C条件下以15,000 × g离心30分钟，收集上清液并转移至新的试管中。
- 再次在4 °C条件下以15,000 × g离心10分钟，以去除蚊子残渣12,17。
注意：如有需要，可使用0.22 μm滤器对上清液进行过滤。 - 将上清液（P0代）分装至2 mL螺旋盖储存管中（每管200 µL），并于-80 °C保存。
3. 细胞的制备及细胞培养维持培养基的配制
注意：使用蚊子细胞系 C6/36（Aedes albopictus RNAi 缺陷型）和脊椎动物细胞系 BHK-21（幼仓鼠肾细胞）进行病毒扩增与分离。
- 在28 °C、5% CO2的湿化培养箱中，将1 × 106个C6/36细胞接种至含10 mL RPMI培养基的75 cm2培养瓶中，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）。
- 在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中，将1 × 106个BHK-21细胞接种至含10 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的75 cm2培养瓶中，培养基中添加10% FBS和1% P/S。
注：细胞每周传代两到三次17,18。 - 将75 cm2培养瓶中培养的细胞（C6/36或BHK-21细胞）接种至24孔板中（每孔C6/36细胞：1.4 × 105；每孔BHK-21细胞：0.8 × 105）。
- 将24孔板在28 °C或37 °C下孵育过夜。
- 在显微镜下观察细胞，确认每孔细胞融合度是否达到80%–90%。
- 配制细胞培养维持培养基（500 mL）。
注：C6/36细胞使用含2% FBS和2%青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的RPMI培养基；BHK-21细胞使用含2% FBS和2%青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的DMEM培养基。
4. 病毒分离
注意：所有步骤均在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。生物安全实验室的安全等级要求应根据各国和地区法规，通过生物安全风险评估确定。该操作过程必须在生物安全柜中进行。
- 从24孔板中移除细胞培养基，每孔加入100 µL细胞维持培养基和100 µL蚊子匀浆上清液（P0）。
- 将培养板置于28 °C或37 °C孵育60分钟，每15分钟轻轻振荡一次，以防止细胞干燥。
- 吸除上清液，然后用600 µL细胞培养维持培养基轻轻冲洗每个孔，以彻底去除碎片。
- 向每个孔中加入 800 µL 细胞培养维持培养基，并将培养板置于 5% CO₂ 培养箱中继续培养。2 在28 °C或37 °C的加湿培养箱中培养7天。
- 每天在显微镜下观察每个孔的细胞状态15.
- 收集细胞上清液（P1 上清液）于第 7 天th 天，并将上清液于 -80 °C 保存。
- 重复步骤 4.1–4.6 两次，以获得 P2 和 P3 上清液。
注意：在步骤 4.3 中，用 600 µL 细胞培养维持培养基轻轻冲洗每个孔对于 P2 和 P3 是可选的。 - 取决于哪个孔出现细胞病变效应（CPE）——细胞死亡、核固缩 并从表面脱落；与邻近细胞融合形成合胞体；或出现核内或胞浆内包涵体——向每个含有细胞（细胞融合度为80%-90%）的新6孔板孔中加入该CPE孔上清液300-400 µL，以大幅扩增病毒。
- 收集上清液，并分装至2 mL螺口储存管中（每管500 µL），于-80 °C保存。
注意：在细胞中连续传代三代后，未引起细胞病变效应（CPE）的样本予以弃用。如有必要，可增加细胞连续传代的代数。
5. 通过逆转录聚合酶链式反应检测病毒序列
- 使用病毒RNA小量提取试剂盒从200 µL病毒上清液中提取总RNA16。
注意：此处采用自动化核酸提取系统，按照仪器制造商的说明提取总RNA。 - 使用PCR仪，根据RT-PCR试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。
- 在PCR管中加入15 µL RNA与1 µL随机引物的混合液。将PCR管置于70 °C孵育5分钟，随后置于冰上冷却5分钟。
- 向PCR管中加入5 µL 5x缓冲液和25 µL混合液（含10 mM dNTP、40 U/µL RNase抑制剂和200 U/µL M-MLV），混匀后于42 °C孵育60分钟，再于95 °C孵育10分钟。
- 将PCR管储存于-20 °C。
- 使用PCR试剂盒和通用引物（表1）通过PCR检测病毒。
- 针对虫媒病毒，设置PCR反应体系（总体积30 µL），包含以下组分：3 µL 10x Taq缓冲液、3 µL dNTP（1 mM）、1 µL上游引物（10 µM）、1 µL下游引物（10 µM）、0.3 µL Taq酶（10 U/µL）、19.7 µL ddH2O和2 µL cDNA。
- 黄病毒检测的反应程序设置如下：第一阶段：94 °C变性30秒、52 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，共35个循环；第二阶段：72 °C延伸10分钟。
- 甲病毒检测的反应程序设置如下：第一阶段：94 °C变性30秒、50 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，共35个循环；第二阶段：72 °C延伸10分钟。
- 布尼亚病毒检测的反应程序设置如下：第一阶段：94 °C变性30秒、50 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，共35个循环；第二阶段：72 °C延伸10分钟。
- 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并送样进行测序分析。
注意：若条件允许，可对上清液进行高通量测序分析，以鉴定新病毒并获得完整的病毒基因组序列。
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结果
接种蚊虫匀浆上清液（P0）后，C6/36 细胞在 120 小时时出现明显的细胞间隙增宽，并观察到细胞脱落现象（图 1A），而同期未接种的对照细胞则无此现象（图 1B）。将 BHK-21 细胞与 P3 代上清液孵育后，48 小时时可见明显的细胞病变效应（CPE）（图 1C），而对照细胞无此变化（图 1D）。通过 PCR 鉴定病毒种类。用于检测黄病毒属（flaviviruses）、甲病毒属（alphaviruses）和布尼亚病毒属（bunyaviruses）的通用引物均购自商业合成（表 1）。布尼亚病毒——艾比湖病毒（Ebinur Lake Virus）的 PCR 扩增产物作为阳性对照加入第 1 泳道。分别使用针对布尼亚病毒、黄病毒和甲病毒的通用引物对病毒上清液进行 PCR 扩增，所得产物分别加入第 2、3 和 4 泳道。黄病毒、甲病毒和布尼亚病毒 PCR 产物的预期大小...
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讨论
本方法的目的是提供一种利用不同细胞系分离蚊媒相关病毒的实用方法。必须向蚊虫匀浆液的上清中添加抗生素-抗真菌剂（青霉素-链霉素-两性霉素），以防止细菌或真菌污染。野外采集的蚊虫及病毒上清液必须在 -80 °C 条件下冷藏，以避免反复冻融循环。
该实验方案中的另一个关键步骤是研磨。蚊虫样品应充分研磨成粉末状，并在冰上保存。蚊虫组织研磨不充分可能导致细胞死亡，并可能影响细胞病变效应（CPE）分析结果的准确性。在进行病毒分离之前，有必要使用正常蚊虫来验证研磨参数。研磨过程必须在低温条件下进行，以防止病毒在操作过程中失活。
该方法可有效分离并扩增与蚊子相关的病毒，但仅适用于能在哺乳动物或昆虫细胞系中产生细胞病变效应（CPE）的病毒。对于不引起细胞病变效应的病毒，该方法不适用。通过本方案，我们可能获得仅含一种病毒类型的候选样本，也可能获得包含多种不同病毒的混合样本。仍需进一步研究——如病毒纯化、形态学鉴定和空斑分析——以获得纯化的病毒。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由武汉市科技计划项目（2018201261638501）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 膜过滤器 | Millipore | SLGP033RB | 具有特定孔径等级的聚合物薄膜，用于去除细胞碎片和细菌。 |
| 24 孔板 | CORNING | 3524 | 细胞培养容器 |
| 75 cm2 培养瓶 | CORNING | 430641 | 细胞培养容器 |
| 含 3 mm 陶瓷珠的无菌 2 mL 管 | |||
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240-062 | 培养基中的抗生素，用于防止细菌和真菌污染 |
| 自动化核酸提取系统 | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 细胞 | 中国武汉病毒研究所国家病毒资源中心 | ||
| C6/36 细胞 | 中国武汉病毒研究所国家病毒资源中心 | ||
| 离心机 | Himac | CF16RN | 用于蚊虫样品离心的仪器 |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s 最低必需培养基 (DMEM) | Gibco | C11995500BT | 用于脊椎动物细胞系的培养基 |
| Ebinur 湖病毒 | Cu20-XJ 分离株 | ||
| 胎牛血清 (FBS) | Gibco | 10099141C | 为细胞提供营养 |
| 高速低温组织匀浆器 | servicebio | KZ-III-F | 用于研磨的仪器 |
| 培养箱 (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | 用于细胞培养的仪器 |
| 培养箱 (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | 用于细胞培养的仪器 |
| PCR 管 | |||
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15410-122 | 培养基中的抗生素，用于防止细菌污染 |
| 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液 | Gibco | 15240096 | |
| 冰箱 (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI) | Gibco | C11875500BT | 用于蚊虫细胞系的培养基 |
| 带螺帽的储存管 (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| 无菌研磨棒 | Tiangen | OSE-Y004 | 用于研磨的耗材 |
| TGrinder OSE-Y30 电动组织研磨器 | Tiangen | OSE-Y30 | 用于研磨的仪器 |
| 解剖显微镜 | ZEISS | stemi508 | |
| 光诱捕蚊器 MXA-02 | Maxttrac | ||
| 蚊虫采集装置 | Ningbo Bangning | ||
| 移液器吸头 | Axygen | TF | |
| QIAamp 病毒 RNA 小量提取试剂盒 | QIAGEN | 52906 | |
| 镊子 | Dumont | 0203-5-PO |
参考文献
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