由于测序技术的广泛应用，已在蚊子中发现大量新型类病毒序列。我们提供了一种利用脊椎动物和蚊子细胞系分离与扩增病毒的有效方法，该方法可为未来针对蚊媒病毒及蚊子特异性病毒的研究提供基础。
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本文内容
摘要
摘要
随着测序技术的广泛应用，已在节肢动物（包括蚊虫）中发现许多新的类病毒序列。这些新发现的蚊虫相关病毒主要分为两类："蚊媒病毒（MBVs）"和"蚊虫特异性病毒（MSVs）"。这些新病毒可能对脊椎动物和蚊虫均具有致病性，也可能仅与蚊虫共生。分离病毒对于确认这些病毒的生物学特性至关重要。因此，本文详细描述了一种从野外采集的蚊虫中分离和扩增病毒的实验方案。首先，将蚊虫样品制备为蚊虫匀浆液的上清液。经过两次离心后，将上清液接种至蚊虫细胞系C6/36或脊椎动物细胞系BHK-21中以进行病毒扩增。7天后，收集上清液作为P1代上清液，并于-80 °C保存。随后，将P1代上清液在C6/36或BHK-21细胞中再连续传代两次，同时每日观察细胞状态。当观察到细胞出现细胞病变效应（CPE）时，收集上清液用于病毒鉴定。该方案为今后开展蚊虫相关病毒（包括MBVs和MSVs）的研究奠定了基础。
引言
蚊子是一类重要的节肢动物病原传播媒介。蚊科（Culicidae）包含约3500种蚊子1,2。高通量测序技术的发展使得研究人员从世界各地的蚊子中发现了大量新型的类病毒序列3。通常，这些与蚊子相关的病毒可分为两大类：蚊媒病毒（MBVs）和蚊特异性病毒（MSVs）。
节肢动物媒介病毒（MBVs）是一类多样的病毒，可引起多种人类或动物疾病，例如黄热病病毒（YFV）、登革热病毒（DENV）、日本脑炎病毒（JEV）、西尼罗河病毒（WNV）和裂谷热病毒（RVFV）4。这些病毒在全球范围内导致人类和动物严重的发病率和死亡率，对公共卫生构成严重威胁。MBVs 在自然界中通过从感染的蚊子传播给易感宿主，以及从病毒感染的宿主传播给吸血蚊子的方式，在多种宿主间维持其生命周期5。因此，这些病毒在实验室中能够感染蚊子细胞系和脊椎动物细胞系1。
蚊媒病毒（MSVs），包括宜昌病毒（YCN）、库蚊黄病毒（CxFV）和朝阳病毒（CHAOV），是一类昆虫特异性病毒的亚群1,
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方案
1. 蚊虫采样与分选
- 在野外使用 MXA-02 光诱捕蚊器或二氧化碳蚊虫捕集器捕获成蚊。
- 将采集到的蚊虫浸入液氮中致死10,11，并通过冷链运输系统运送至实验室12。
注意：冷链运输系统主要使用干冰。 - （可选）若采样地点靠近实验室，可直接将网捕的活蚊送至实验室，并在 ≤-20 °C 条件下冷冻 30 分钟以实施安乐死4。
- 利用蚊虫分类鉴定工具书对采集的蚊虫进行形态学鉴定13。
注意：如有必要，可采用DNA条形码技术对蚊虫进行分类与鉴定14,15。 - 根据采样日期和采样地点，将蚊虫分组为不同的样本池 ，然后将其储存于 2–5 mL 的离心管中。
- 绘制表格，记录每管中蚊虫的种类、数量、采样编号、日期和采样地点。
- 打印带有采样编号的标签并粘贴至各管上。
- 将含有蚊虫样本的离心管保存于 -80 °C 环境中，待后续分析使用。
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结果
接种蚊虫匀浆上清液（P0）后，C6/36 细胞在 120 小时时出现明显的细胞间隙增宽，并观察到细胞脱落现象（图 1A），而同期未接种的对照细胞则无此现象（图 1B）。将 BHK-21 细胞与 P3 代上清液孵育后，48 小时时可见明显的细胞病变效应（CPE）（图 1C），而对照细胞无此变化（图 1D）。通过 PCR 鉴定病毒种类。用于检测黄病毒属（flaviviruses）、甲病毒属（alphaviruses）和布尼亚病毒属（bunyaviruses）的通用引物均购自商业合成（表 1）。布尼亚病毒——艾比湖病毒（Ebinur Lake Virus）的 PCR 扩增产物作为阳性对照加入第 1 泳道。分别使用针对布尼亚病毒、黄病毒和甲病毒的通用引物对病毒上清液进行 PCR 扩增，所得产物分别加入第 2、3 和 4 泳道。黄病毒、甲病毒和布尼亚病毒 PCR 产物的预期大小.......
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讨论
本方法的目的是提供一种利用不同细胞系分离蚊媒相关病毒的实用方法。必须向蚊虫匀浆液的上清中添加抗生素-抗真菌剂（青霉素-链霉素-两性霉素），以防止细菌或真菌污染。野外采集的蚊虫及病毒上清液必须在 -80 °C 条件下冷藏，以避免反复冻融循环。
该实验方案中的另一个关键步骤是研磨。蚊虫样品应充分研磨成粉末状，并在冰上保存。蚊虫组织研磨不充分可能导致细胞死亡，并可能影响细胞病变效应（CPE）分析结果的准确性。在进行病毒分离之前，有必要使用正常蚊虫来验证研磨参数。研磨过程必须在低温条件下进行，以防止病毒在操作过程中失活。
该方法可有效分离并扩增与蚊子相关的病毒，但仅适用于能在哺乳动物或昆虫细胞系中产生细胞病变效应（CPE）的病毒。对于不引起细胞病变效应的病毒，该方法不适用。通过本方案，我们可能获得仅含一种病毒类型的候选样本，也可能获得包含多种不同病毒的混合样本。仍需进一步研究——如病毒纯化、形态学鉴定和空斑分析——以获得纯化的病毒。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由武汉市科技计划项目（2018201261638501）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 膜过滤器 | Millipore | SLGP033RB | 具有特定孔径等级的聚合物薄膜，用于去除细胞碎片和细菌。 |
| 24 孔板 | CORNING | 3524 | 细胞培养容器 |
| 75 cm2 培养瓶 | CORNING | 430641 | 细胞培养容器 |
| 含 3 mm 陶瓷珠的无菌 2 mL 管 | |||
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240-062 | 培养基中的抗生素，用于防止细菌和真菌污染 |
| 自动化核酸提取系统 | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 细胞 | 中国武汉病毒研究所国家病毒资源中心 | ||
| C6/36 细胞 | 中国武汉病毒研究所国家病毒资源中心 | ||
| 离心机 | Himac | CF16RN | 用于蚊虫样品离心的仪器 |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s 最低必需培养基 (DMEM) | Gibco | C11995500BT | 用于脊椎动物细胞系的培养基 |
| Ebinur 湖病毒 | Cu20-XJ 分离株 | ||
| 胎牛血清 (FBS) | Gibco | 10099141C | 为细胞提供营养 |
| 高速低温组织匀浆器 | servicebio | KZ-III-F | 用于研磨的仪器 |
| 培养箱 (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | 用于细胞培养的仪器 |
| 培养箱 (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | 用于细胞培养的仪器 |
| PCR 管 | |||
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15410-122 | 培养基中的抗生素，用于防止细菌污染 |
| 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液 | Gibco | 15240096 | |
| 冰箱 (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI) | Gibco | C11875500BT | 用于蚊虫细胞系的培养基 |
| 带螺帽的储存管 (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| 无菌研磨棒 | Tiangen | OSE-Y004 | 用于研磨的耗材 |
| TGrinder OSE-Y30 电动组织研磨器 | Tiangen | OSE-Y30 | 用于研磨的仪器 |
| 解剖显微镜 | ZEISS | stemi508 | |
| 光诱捕蚊器 MXA-02 | Maxttrac | ||
| 蚊虫采集装置 | Ningbo Bangning | ||
| 移液器吸头 | Axygen | TF | |
| QIAamp 病毒 RNA 小量提取试剂盒 | QIAGEN | 52906 | |
| 镊子 | Dumont | 0203-5-PO |
参考文献
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. ....
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重印与许可
