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在液体和冰中推进病毒组装的高分辨率成像

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DOI：

10.3791/63856

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2022年7月20日

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1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

* These authors contributed equally

本文内容

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

摘要

本文描述了制备适用于在纳米尺度下通过透射电子显微镜进行液相电镜和冷冻电镜分析的病毒组装体的实验方案。

摘要

近年来，液相电子显微镜（liquid-EM）受到广泛关注，因为科学家现已能够在纳米尺度上实时观察动态过程。将高分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）信息与动态观测相结合具有极高的价值，许多生物事件的发生时间尺度极快，可达毫秒甚至更短。对柔性结构的深入理解也有助于设计新型试剂，以应对诸如SARS-CoV-2等新发病原体。更重要的是，在流体环境中观察生物材料能够独特地揭示其在人体内的实际功能状态。本文介绍了一种新开发的方法，用于研究病毒组装体在液相和玻璃态冰中的纳米级特性。为实现这一目标，采用了结构明确的样品作为模型系统。文中并列比较了不同的样品制备方法，并展示了具有代表性的结构信息。在约3.5 Å至10 Å分辨率范围内解析的结构中，呈现出亚纳米级别的细节特征。其他支持该互补研究框架的最新成果还包括在液相中成像获得的疫苗候选物及基于抗体疗法的动态信息。总体而言，这些关联性应用显著提升了我们可视化分子动态过程的能力，为其在人类健康与疾病研究中的应用提供了独特的视角。

引言

生物医学研究通过新技术的开发，增进我们对人类健康与疾病的理解。高分辨率成像技术正在改变我们对纳米世界的认知——使我们能够以前所未有的细节研究细胞和分子1,2,3,4,5。对于软性聚合物、蛋白质复合物或人类病毒等动态组分的静态信息，仅能揭示其复杂生命过程的有限片段。为了更深入理解分子实体的运作机制，必须同时研究其结构与功能。

近年来，原子级厚度的石墨烯 或基于硅的微芯片等材料的制备取得了显著进展，为利用透射电子显微镜（TEM）进行实时结构-功能分析提供了新的机遇。这些材料可构建密封腔室，用于活体电子显微成像6,7,8,9,10,11。液相电子显微技术（liquid-EM）是低温电子显微技术（cryo-EM）在室温条件下的对应方法，能够以前所未有的清晰度观察溶液中的硬质或软质材料，使科学家能够同时研究样品的结构与动态行为。液相电子显微技术的应用包括实时记录治疗性纳米颗粒与癌症干细胞之间的相互作用，以及病毒病原体分子结构的复杂变化过程12,13,14。

正如方法学的进步推动了冷冻电镜（cryo-EM）领域的分辨率革命，新的技术和方法同样亟需拓展液相电镜（liquid-EM）在科学界作为高通量工具的应用。本文所介绍方法的总体目标是简化液相电镜样品制备流程。所开发技术的核心理念是采用新型微芯片设计和自动进样装置，适用于液相和冷冻电镜的数据采集（图1）7,14,15,16,17。该组件通过标准载网夹进行机械密封，可兼容自动化仪器，例如Krios（每轮实验可容纳多个样品）或F200C透射电镜（TEM）（图2）。该方法将高分辨率成像的应用范围扩展至传统冷冻电镜之外，展现出在实时材料分析中的更广泛用途。

在本视频文章中，介绍了在有无商用样品 holder 的情况下制备液体中病毒组装体的实验方案。利用专用于液相电子显微镜（liquid-EM）的样品 holder，薄层液体样品可提供与冷冻电镜（cryo-EM）样品相当的结构信息，同时还能揭示样品的动态特征。本文还演示了使用自动加样工具制备液体样品以实现高通量操作的方法。相较于其他技术，其主要优势在于自动化样品制备可使用户在数据采集前快速评估样品的最佳厚度和电子束剂量。该筛选技术能够快速识别出适合在液体或冰环境中进行实时记录的理想区域12,14,18,19。在三维结构解析方面，液相电镜可作为已广泛建立的冷冻电镜方法的补充。采用传统透射电镜（TEM）或冷冻电镜技术的研究人员，可考虑引入液相电镜工作流程，以获得对其样品的新颖动态观察结果，从而补充现有的研究策略。

本方案中使用的病毒样本包括作为馈赠获得的纯化腺相关病毒3型（AAV），并在标准条件下培养12。此外，还使用了来自COVID-19患者血清的非感染性SARS-CoV-2亚病毒颗粒，该样本购自商业来源12 。最后，纯化的猴轮状病毒（SA11株）双层颗粒（DLPs）由维克森林大学Sarah M. McDonald Esstman博士实验室提供，并采用标准条件进行培养6,17。本文所述软件包可免费获取，相关链接已列于材料表部分。

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方案

1. 液相电子显微镜样品杆的装载

  1. 将每片氮化硅（SiN）微芯片在 150 mL 丙酮中孵育 2 分钟，随后在 150 mL 甲醇中孵育 2 分钟，以清洁芯片。在层流空气中使芯片自然干燥。
  2. 使用辉光放电仪在标准条件下（30 W，15 mA，氩气氛围）对干燥后的芯片进行等离子体清洗，持续 45 秒。
  3. 将一片干燥的基底微芯片装入样品 holder 的尖端。向基底芯片上加入约 0.2 µL 样品（病毒组装体浓度为 0.2–1 mg/mL，溶于 50 mM HEPES，pH 7.5；150 mM NaCl；10 mM MgCl2；10 mM CaCl2）。孵育 1–2 分钟后，将上层芯片覆盖在含有样品的湿润基底芯片上。
  4. 夹紧组件，形成由三个黄铜螺丝机械固定的气密封闭腔室。密封后，使用涡轮泵干式抽气站将尖端抽至 10-6 Torr。此时，样品 holder 已准备就绪，可插入透射电子显微镜（TEM）中。
    注意：该特定 holder 不具备冷却功能，不可用于冷冻电镜（cryo-EM）。

2. 微芯片三明治结构的制备

注意：不同类型的氮化硅（SiN）或二氧化硅（SiO）微芯片可直接从随货提供的凝胶包装中取出使用。碳涂层金网格也可直接使用，无需预处理。

  1. 使用辉光放电仪，在标准条件下（30 W，15 mA，氩气环境）对微芯片和碳支持膜进行等离子清洗，持续45秒。
  2. 取约2 µL样品（溶于50 mM HEPES，pH 7.5；150 mM NaCl；10 mM MgCl2；10 mM CaCl2 ），滴加至放置在凝胶包上的经辉光放电处理的微芯片上。用滤纸或移液器去除多余液体（约50%）。在室温下孵育1–2分钟后，将经辉光放电处理的碳支持膜置于含有样品的湿润微芯片上。
  3. 使用单倾样品台或自动进样器网格夹具在室温下将组件夹紧，形成一个密封的腔室。对于自动进样器夹具，先将夹心结构放置在底部C型夹上，再将顶部夹具置于组件上方，并使用标准夹紧工具将组件密封。
    注意：此处的夹紧操作步骤与冷冻电镜网格夹紧步骤相同，但操作在室温下进行。夹紧后的样品可在成像前于室温下保存2个月或更长时间，且腔室内液体保持不泄漏。室温样品台或自动进样器无需进行漏液检测。
  4. 样品现已准备就绪，可插入透射电子显微镜（TEM）中进行观察。可在低温或室温条件下对装载于自动进样器中的样品进行检测。

使用透射电子显微镜对样品进行成像

  1. 液相电子显微镜（liquid-EM）成像
    1. 将 样品 holder 装入配备场发射枪（FEG）且工作电压为 200 kV 的透射电子显微镜（TEM）中。
    2. 开启电子枪，并使用摇摆（wobbler）功能调节显微镜载物台相对于样品的齐焦高度，使样品在镜筒内从 -15° 倾斜至 +15°。该步骤通过在 Z 方向调节载物台以适应样品厚度，并有助于在图像记录过程中确保准确的放大倍数。
    3. 使用集成有直接电子探测器（像素间距为 6 µm）的原位（in situ）成像软件包，以长帧电影模式记录图像（视频 1 和 视频 2）。也可使用串行数据采集软件包20记录单张图像，并实施自动成像程序。在低剂量条件下，以 28,000×–92,000× 的放大倍数和每秒 40 帧的速度采集图像。
    4. 调整曝光时间（0.25–1 秒），以最小化电子束对样品的损伤。在指定放大倍数下，使用 -1–4 µm 的欠焦范围。若遇到较厚的溶液，应使用更高的欠焦值或选择其他感兴趣区域。
    5. 在整个成像过程中，通过将电子束聚焦于用于数据采集区域之外的牺牲区域，直至产生气泡，以确认样品中溶液的存在（补充图 1）。
  2. 冷冻电子显微镜（cryo-EM）成像
    1. 将 夹持的 EM 载网或微芯片夹层装入配备场发射枪（FEG）且工作电压为 300 kV 的透射电子显微镜（TEM）中。开启电子枪，并参照上述液相 TEM 的步骤（3.1.2）调节显微镜载物台的齐焦高度。
    2. 使用集成在显微镜系统中的单颗粒分析系统，并结合自动成像程序，记录单张图像。在低剂量条件下，使用单颗粒分析专用的直接电子探测器（像素间距为 14 µm），在 59,000× 放大倍数下以每秒 40 帧的速度记录图像。
    3. 在指定放大倍数下，使用 1–4 µm 的欠焦范围。若遇到较厚的玻璃态冰层，应使用更高的欠焦值，或选择其他区域进行数据采集。

4. 数据分析与三维结构比较

  1. 在液体和玻璃态冰中分析腺相关病毒（AAV）
    1. 使用 RELION-3.08 程序21或其他图像处理软件22对液体和冰中的 AAV 颗粒进行电影图像处理。使用 MotionCor2 v1.2.3 进行运动校正。
    2. 校正后，使用程序软件包中的自动选颗粒工具提取颗粒。液体样品的典型盒尺寸为 330 像素，冰样品为 350 像素。
    3. 使用程序的 3D 初始模型流程和/或数据处理软件包中的ab-initio模型选项，采用 C1 对称性计算初始重构。在程序中，液体样品使用正则化参数 T = 4 和像素尺寸 1.01 Å，冰样品使用 1.13 Å。
    4. 在整个精修过程中使用 300 Å 的掩模值。在数据处理软件中使用 I1 对称性执行精修流程，以获得多个 EM 图谱。预期结构分辨率可能达到 4 Å 或更高。在液体样品中采用 16,800 的二十面体对称性颗粒等效性，在冰样品中采用 15,24012,14。
      注：分辨率估计基于金标准傅里叶壳层相关（FSC）准则。
    5. 将 EM 图谱在约 250 Å 处加掩模，并使用分子结构分析软件包检查结果23,24。在图 3中，切片以约 5 nm 的间隔显示。
    6. 从 EM 图谱中提取衣壳蛋白（VP1）亚基以进行比较。基于颗粒直径测量值（补充图 2）量化 EM 结构之间的动态变化，然后使用软件中的 Morph 图谱功能进行可视化。
  2. 在液体中分析 SARS-CoV-2 亚病毒组装体
    1. 使用 RELION-3.08 程序处理电影图像。使用 MotionCor2 v1.2.3 校正图像漂移和电子束诱导运动。校正显微镜的对比度传递函数（CTF）。
    2. 使用程序中的自动选颗粒工具选择病毒组装体，盒尺寸为 800 像素。为提高计算效率，可将提取的颗粒重缩放至 256 像素。在程序中使用 C1 对称性、正则化参数 T = 2 和像素尺寸 1.66 Å 获得初始模型。
    3. 在程序中进行 3D 精修以获得 EM 图谱，根据标准 FSC 准则，示例分辨率达到约 8.25 Å（图 4）。使用分子结构分析软件以 25 nm 为增量显示 EM 图谱切片，如图 4所示。
  3. 在玻璃态冰中分析轮状病毒双层颗粒（DLPs）
    1. 使用其他图像处理软件对轮状病毒 DLPs 的电影图像进行处理。使用 MotionCor2 v1.2.3 校正图像漂移。使用 Patch CTF 估计校正透镜对图像的影响。
    2. 使用软件中的自动选颗粒工具提取颗粒，盒尺寸为 950 像素。根据计算需要对盒尺寸进行下采样。
    3. 使用ab-initio选项和 C1 对称性计算初始模型。使用包括 1.47 Å 像素尺寸和 800 Å 掩模值在内的精修参数。
    4. 在施加 I1 对称性的条件下进行额外的精修流程。示例结果包括根据金标准 FSC 准则获得的 10.15 Å EM 图谱。使用的总颗粒数为 2050，由于二十面体对称性算子，相当于 123,000 个原体单元（图 5）。
    5. 在约 750 Å 处对最终图谱加掩模，并在分子结构分析软件包中可视化结果。EM 图谱的示例切片如图 5所示，以约 10 nm 的间隔显示。

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结果

所有液相电镜成像实验均使用在200 kV下运行的液相透射电子显微镜（liquid-TEM），而所有冷冻电镜数据采集则使用在300 kV下运行的冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）。本文展示了多种病毒的代表性图像与结构，以证明这些方法在不同测试样本中的适用性。这些病毒包括重组腺相关病毒3型（AAV）、源自患者血清的SARS-CoV-2亚病毒组装体，以及猴轮状病毒双层颗粒（DLPs），SA11株。首先，对同一样品（1 mg/mL的AAV）在液相缓冲溶液（50 mM HEPES，pH 7.5；150 mM NaCl；10 mM MgCl2；10 mM CaCl2）中和在玻璃态冰中成像的结果进行了比较（图3A-C；补充图 2）。液相电镜样品采用基于氮化硅（SiN）的微芯片和专用样品台制备；冷冻电镜样品则使用标准的有孔碳支持膜载网，并通过先进的样品制备装置在液态乙烷中快速玻璃化冷冻制备。所得病毒结构的整体直径相似，约为25 nm。对单个VP1...

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讨论

通过采用源自冷冻电镜（cryo-EM）领域的新型自动化工具和技术，当前的液相电镜（liquid-EM）工作流程迎来了新的优化机遇。与其他方法相比，涉及新型微芯片夹心技术的应用具有重要意义，因其能够在液体环境或玻璃态冰中实现高分辨率成像分析。该实验方案中最关键的步骤之一是制备具有理想液层厚度的样品，以在纳米尺度上清晰观察精细结构。在进行高通量自动化数据采集之前，需先在较低放大倍数下对整个样品进行筛查，以识别出理想的感兴趣区域。若在液体或冰样品中发现目标区域存在电子束损伤伪影，或液层过厚导致无法清晰分辨单个颗粒，则应将其排除在数据采集范围之外。高分辨率数据采集的局限性包括电子束诱导的样品移动以及液体样品中的布朗运动。冷冻电镜方法旨在最大限度减少生物样品的运动；然而，运动校正算法在计算上具有较强鲁棒性，可有效缓解这些限制分辨率的因素。若液体样品出现长程漂移或热不稳定性，可在样品制备过程中通过去除过量溶液来制备更薄的样品，从而降低液层厚度。

当样品使用高浓度时，病毒颗粒之间可能会发生分子拥挤现象。如果存在多个颗粒重叠的区域，从而限制了可靠数据的采集，则应在样品制备前降低输入样品的浓度。获得...

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披露

作者声明不存在竞争性经济利益。作者 Madeline J. Dressel-Dukes 是 Protochips, Inc. 的员工，Michael Spilman 是 DirectElectron 的员工。

致谢

作者感谢哈佛医学院眼科系的 Luk H. Vandenberghe 博士提供了纯化的 AAV-3。本研究由美国国立卫生研究院和国家癌症研究所资助（项目编号：R01CA193578、R01CA227261、R01CA219700，授予 D.F.K.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮Fisher Scientific A11-11 升
自动装载夹具工具ThermoFisher ScientificN/A也可由 SubAngstrom 供应商提供
自动装载网格夹具ThermoFisher ScientificN/A顶部和底部夹具
碳涂层金电镜网格Electron Microcopy SciencesCF400-AU-50400 目，5 纳米厚度
新冠患者血清RayBiotechCoV-Pos-S-500500 微升 PCR 阳性血清
甲醇Fisher Scientific A412-11 升
集成微孔微芯片Protochips, Inc.EPB-42A1-1010x10 毫米窗口阵列
TEMWindows 微芯片Simpore Inc.SN100-A10Q33B9 个大窗口，10 纳米厚
TEMWindows 微芯片Simpore, Inc. SN100-A05Q33A9 个小窗口，5 纳米厚
顶部微芯片Protochips, Inc.EPT-50W500 毫米 × 100 毫米窗口
Whatman #1 滤纸Whatman1001 090100 张，90 毫米
设备 
DirectView 直接电子探测器Direct Electron6 微米像素间距
Falcon 3 EC 直接电子探测器ThermoFisher Scientific14 微米像素间距
Gatan 655 干泵站Gatan, Inc. 泵头尖端可达 10-6 范围
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientific先进的样品制备装置 
PELCO easiGlow 放电装置Ted Pella, Inc. 负极性模式
Poseidon Select 样品台Protochips, Inc. 与 FEI 兼容；样品台
Talos F200C 透射电镜ThermoFisher Scientific200 kV；液相透射电镜
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV；冷冻透射电镜
免费软件网站链接备注（可选）
cryoSPARChttps://cryosparc.com/其他图像处理软件
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF 识别程序
MotionCorr2https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/分子结构分析软件包

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