本文描述了制备适用于在纳米尺度下通过透射电子显微镜进行液相电镜和冷冻电镜分析的病毒组装体的实验方案。
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Retraction Notice
This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.
本文描述了制备适用于在纳米尺度下通过透射电子显微镜进行液相电镜和冷冻电镜分析的病毒组装体的实验方案。
近年来，液相电子显微镜（liquid-EM）受到广泛关注，因为科学家现已能够在纳米尺度上实时观察动态过程。将高分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）信息与动态观测相结合具有极高的价值，许多生物事件的发生时间尺度极快，可达毫秒甚至更短。对柔性结构的深入理解也有助于设计新型试剂，以应对诸如SARS-CoV-2等新发病原体。更重要的是，在流体环境中观察生物材料能够独特地揭示其在人体内的实际功能状态。本文介绍了一种新开发的方法，用于研究病毒组装体在液相和玻璃态冰中的纳米级特性。为实现这一目标，采用了结构明确的样品作为模型系统。文中并列比较了不同的样品制备方法，并展示了具有代表性的结构信息。在约3.5 Å至10 Å分辨率范围内解析的结构中，呈现出亚纳米级别的细节特征。其他支持该互补研究框架的最新成果还包括在液相中成像获得的疫苗候选物及基于抗体疗法的动态信息。总体而言，这些关联性应用显著提升了我们可视化分子动态过程的能力，为其在人类健康与疾病研究中的应用提供了独特的视角。
生物医学研究通过新技术的开发，增进我们对人类健康与疾病的理解。高分辨率成像技术正在改变我们对纳米世界的认知——使我们能够以前所未有的细节研究细胞和分子1,2,3,4,5。对于软性聚合物、蛋白质复合物或人类病毒等动态组分的静态信息，仅能揭示其复杂生命过程的有限片段。为了更深入理解分子实体的运作机制，必须同时研究其结构与功能。
近年来，原子级厚度的石墨烯 或基于硅的微芯片等材料的制备取得了显著进展，为利用透射电子显微镜（TEM）进行实时结构-功能分析提供了新的机遇。这些材料可构建密封腔室，用于活体电子显微成像6,7,8,9,10,11。液相电子显微技术（li....
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1. 液相电子显微镜样品杆的装载
2. 微芯片三明治结构的制备
注意：不同类型的氮化硅（SiN）或二氧化硅（SiO）微芯片可直接从随货提供的凝胶包....
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所有液相透射电镜（liquid-TEM）成像实验均在200 kV下进行，所有冷冻电镜（cryo-EM）数据采集则使用300 kV下运行的冷冻透射电镜完成。本文展示了多种病毒的代表性图像与结构，以证明这些方法在不同测试样本中的适用性。其中包括重组腺相关病毒血清型3（AAV）、源自患者血清的SARS-CoV-2亚病毒组装体，以及猴轮状病毒双层颗粒（DLPs），SA11株。首先，对同一样品（1 mg/mL AAV）在液态缓冲溶液（50 mM HEPES，pH 7.5；150 mM NaCl；10 mM MgCl2；10 mM CaCl2）中和玻璃态冰中成像的结果进行了比较（图3A–C；补充图2）。液相电镜样品采用基于氮化硅（SiN）的微芯片和专用样品台制备；冷冻电镜样品则使用标准的有孔碳膜载网，并通过先进的样品制备设备在液态乙烷中快速玻璃化冷冻制备。所获得的病毒结构整体直径均约为25 nm。对单个VP1衣壳蛋白原体的比较也显示，在液相和冰相电镜图谱中具有相似的结构特征（
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通过采用源自冷冻电镜（cryo-EM）领域的新型自动化工具和技术，当前的液相电镜（liquid-EM）工作流程迎来了新的优化机遇。与其他方法相比，涉及新型微芯片夹心技术的应用具有重要意义，因其能够在液体环境或玻璃态冰中实现高分辨率成像分析。该实验方案中最关键的步骤之一是制备具有理想液层厚度的样品，以在纳米尺度上清晰观察精细结构。在进行高通量自动化数据采集之前，需先在较低放大倍数下对整个样品进行筛查，以识别出理想的感兴趣区域。若在液体或冰样品中发现目标区域存在电子束损伤伪影，或液层过厚导致无法清晰分辨单个颗粒，则应将其排除在数据采集范围之外。高分辨率数据采集的局限性包括电子束诱导的样品移动以及液体样品中的布朗运动。冷冻电镜方法旨在最大限度减少生物样品的运动；然而，运动校正算法在计算上具有较强鲁棒性，可有效缓解这些限制分辨率的因素。若液体样品出现长程漂移或热不稳定性，可在样品制备过程中通过去除过量溶液来制备更薄的样品，从而降低液层厚度。
当样品使用高浓度时，病毒颗粒之间可能会发生分子拥挤现象。如果存在多个颗粒重叠的区域，从而限制了可靠数据的采集，则应在样品制备前降低输入样品的浓度。获得.......
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作者声明不存在竞争性经济利益。作者 Madeline J. Dressel-Dukes 是 Protochips, Inc. 的员工，Michael Spilman 是 DirectElectron 的员工。
作者感谢哈佛医学院眼科系的 Luk H. Vandenberghe 博士提供了纯化的 AAV-3。本研究由美国国立卫生研究院和国家癌症研究所资助（项目编号：R01CA193578、R01CA227261、R01CA219700，授予 D.F.K.）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | Fisher Scientific | A11-1 | 1 升 |
| 自动装载夹具工具 | ThermoFisher Scientific | N/A | 也可由 SubAngstrom 供应商提供 |
| 自动装载网格夹具 | ThermoFisher Scientific | N/A | 顶部和底部夹具 |
| 碳涂层金电镜网格 | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400 目，5 纳米厚度 |
| 新冠患者血清 | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 微升 PCR 阳性血清 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A412-1 | 1 升 |
| 集成微孔微芯片 | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10x10 毫米窗口阵列 |
| TEMWindows 微芯片 | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 个大窗口，10 纳米厚 |
| TEMWindows 微芯片 | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 个小窗口，5 纳米厚 |
| 顶部微芯片 | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 毫米 × 100 毫米窗口 |
| Whatman #1 滤纸 | Whatman | 1001 090 | 100 张，90 毫米 |
| 设备 | |||
| DirectView 直接电子探测器 | Direct Electron | 6 微米像素间距 | |
| Falcon 3 EC 直接电子探测器 | ThermoFisher Scientific | 14 微米像素间距 | |
| Gatan 655 干泵站 | Gatan, Inc. | 泵头尖端可达 10-6 范围 | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | 先进的样品制备装置 | |
| PELCO easiGlow 放电装置 | Ted Pella, Inc. | 负极性模式 | |
| Poseidon Select 样品台 | Protochips, Inc. | 与 FEI 兼容；样品台 | |
| Talos F200C 透射电镜 | ThermoFisher Scientific | 200 kV；液相透射电镜 | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV；冷冻透射电镜 | |
| 免费软件 | 网站链接 | 备注（可选） | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | 其他图像处理软件 | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF 识别程序 | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | 分子结构分析软件包 |
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