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方法文章

高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

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DOI：

10.3791/63860

⸱

2022年4月28日

 ,  ,  , 
1Division of Biomedical and Life Sciences, Lancaster University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

肠道微生物可能对宿主的健康产生正面或负面的影响 通过 特异性或保守性机制 秀丽隐杆线虫 是一种用于筛选此类微生物的便捷平台。本实验方案描述了对48种细菌分离株进行高通量筛选，以评估其对线虫应激抗性的影响，该指标被用作线虫健康状况的替代参数。

摘要

由于体型小、生命周期短且遗传操作简便，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）为研究微生物分离株对宿主生理的影响提供了便捷的实验平台。此外，该线虫在死亡时会发出蓝色荧光，便于准确判断死亡时间。这一特性已被用于开发高通量、无需标记的C. elegans生存率检测方法（LFASS）。该方法通过对多孔板中的线虫群体进行延时荧光记录，进而推算出群体的中位死亡时间。本研究采用LFASS方法，同时筛选多种微生物分离株对C. elegans抵抗严重热应激和氧化应激能力的影响。本文报道了利用严重应激抗性作为宿主健康指标的微生物筛选流程，该流程特别适用于益生菌的初步筛选。本实验方案详细描述了如何在多孔板阵列中培养C. elegans肠道微生物分离株文库及同步化的线虫群体，并将其合并用于后续检测。示例实验涵盖了在两种线虫品系上平行开展的两个应激检测，共测试47种细菌分离株和一种对照菌株。然而，该方法具有良好的可扩展性，也可应用于多种其他类型的筛选。因此，该体系为快速评估影响C. elegans健康的多参数生物学与生物化学条件提供了一种灵活且高效的实验平台。

引言

人体内寄居着约10万亿至100万亿个活体微生物细胞（细菌、古菌、真菌），主要存在于肠道、皮肤和黏膜环境中1在健康状态下，这些微生物可为宿主提供多种益处，包括维生素的合成、免疫系统的成熟、对病原体的固有免疫和适应性免疫反应的刺激、脂肪代谢的调控、应激反应的调节等，进而影响机体的生长发育、疾病发生及衰老过程2,3,4,5肠道微生物群在人的一生中也会发生显著变化。其中最剧烈的变化发生在婴儿期和幼儿期。6，但随着年龄增长也会发生显著变化，包括减少 双歧杆菌 丰度及增加 梭菌属、乳杆菌属、肠杆菌科 和 肠球菌 物种7生活方式可进一步改变肠道菌群组成，导致菌群失调（有益菌减少，机会性致病菌过度增殖），从而引发多种病理状态，如炎症性肠病、糖尿病和肥胖。5，还与阿尔茨海默病和帕金森病的发生相关8,9,10,11.

这一认识极大地推动了肠-脑轴（GBA）概念的完善，其中肠道生理（现包括其中的微生物）与神经系统之间的相互作用被认为是调控动物代谢和生理功能的主要机制12。然而，微生物群在肠-脑信号传导中的确切作用及其相关作用机制仍远未被充分阐明13。鉴于肠道微生物群是健康衰老的关键决定因素，细菌如何调控衰老过程已成为一个备受关注且存在争议的研究课题6,14,15。

通过秀丽隐杆线虫的示范 秀丽隐杆线虫 宿主拥有一个真正的肠道微生物群，其组成与其他物种一样，以……为主导 拟杆菌门, 厚壁菌门，以及 放线菌门16,17,18,19,20，其作为研究宿主-肠道共生菌相互作用的实验平台的迅速兴起21,22,23,24,25,26 显著扩展了我们的研究工具 arsenal26,27,28,29特别是可用于高通量实验研究的方法 秀丽隐杆线虫 研究基因-饮食、基因-药物、基因-病原体等相互作用，可被用于快速探索细菌分离株及菌群混合物的影响 秀丽隐杆线虫 健康与衰老

本实验方案描述了一种可同时筛选置于多孔板中的细菌分离株阵列或混合物对C. elegans应激抗性影响的方法流程，以此作为健康状况的替代指标，可用于鉴定益生菌。方案详细说明了如何培养大量线虫群体，并在96孔和384孔板体系中处理细菌阵列，随后利用荧光酶标仪对线虫进行自动化应激抗性分析（图1）。该方法基于无标记自动化生存分析（LFASS）30，利用“死亡荧光”现象31，即线虫在死亡时会产生短暂的蓝色荧光，借此可精确定位死亡时间。这种蓝色荧光来源于C. elegans肠道颗粒（一种溶酶体相关细胞器）中储存的犬尿氨酸酸葡萄糖基酯，当线虫肠道在死亡时触发坏死级联反应，这些颗粒会破裂释放荧光物质31。

秀丽隐杆线虫氧化应激检测实验方案；时间线，细菌培养准备，幼虫转移步骤，试剂
图1：影响细菌分离株的高通量筛选实验流程 秀丽隐杆线虫 抗应激能力 (A) 线虫与细菌培养及实验设置时间线。B96孔细菌培养板阵列的设置与操作C384孔线虫板设置 请点击此处以查看此图的放大版本。

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方案

本研究中平行使用的两种 C. elegans 品系为Bristol N2野生型和HT1890：daf-16(mgDf50)，二者生长速率相似。然而，本方案也可使用任何生长速率相近的两种品系组合进行复制。需要注意的是，当平行测试其他品系时（例如野生型与生长缓慢的 daf-2 突变体），必须考虑其生长速率的差异，并相应调整本方案。以下方案中的时间尺度、线虫与细菌的数量均针对在两次LFASS实验中以四重复方式平行测试48种细菌分离物在两种线虫品系上的效果进行了优化。若需平行测试更多条件，则需进行相应调整。Escherichia coli OP50细菌菌株购自明尼苏达大学的秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）。48种细菌分离物来自Schulenburg实验室，并在LB琼脂培养基上保存。

1. 秀丽隐杆线虫 在OP50上培养（第1-8天）

注意：本方法旨在所有发育阶段均于固体培养基上培养 C. elegans 雌雄同体，避免不必要的饮食改变（例如使用生长更快的 E. coli 菌株 NA22 或更丰富的培养基如鸡蛋琼脂平板），以尽可能接近目前仍广泛使用的标准培养条件32,33。线虫培养温度（此处设定为 15 °C）取决于所使用的 C. elegans 菌株，可能需要调整（例如为避免或诱导温度敏感型表型或生物标志物的表达）。有关线虫饲养的更多信息，请参见参考文献33。

  1. 准备八块直径为 6 cm 的 NGM 平板（每种线虫品系使用 10 mL 线虫生长培养基琼脂，NGM，补充文件 1）32,33，在室温下晾干 1 天。
  2. 通过将新培养的溶菌肉汤琼脂（LB 琼脂，补充文件 1）平板上的单个细菌克隆接种至 50 mL 锥形管中的 25 mL OP50 培养基（补充文件 1）中，制备 E. coli OP50 细菌的饱和液体培养物。在 37 °C 摇床培养箱中过夜培养。
  3. 每种品系的八块 6 cm NGM 平板上各加入 100 µL 饱和 E. coli OP50 液体培养物进行接种，并将平板置于 20 °C 下放置 2 天后再使用。
  4. 使用解剖刀从近期饥饿处理的 NGM 平板上切取一块含线虫的 0.5 cm 见方的琼脂块，转移至每种品系的八块已接种的 6 cm NGM 平板上，于 20 °C 培养 3 天（或直至线虫耗尽食物）。
  5. 为每种线虫品系准备五块直径为 15 cm 的 NGM 平板（每板含 30 mL NGM 培养基），每板接种 3 mL OP50，待平板晾干后，在 37 °C 下过夜培养。之后将平板保存于 20 °C，待后续步骤使用。
  6. 使用 P-1000 移液器向 6 cm NGM 平板（步骤 1.1）中加入最多 3 mL 无菌 M9 缓冲液（补充文件 1），重悬线虫，并将每种品系八块平板的线虫悬液全部收集至一个 15 mL 锥形管中。
    1. 在 4 °C 下以 142 x g 离心 2 分钟。使用 P-5000 移液器或配备无菌巴斯德移液管或吸头的水泵小心去除上清液。加入 10 mL 无菌 M9 缓冲液洗涤线虫沉淀。重复此步骤 2 次。
    2. 尽可能去除上清液，并使用移液器将线虫转移至一块已接种 OP50 的 15 cm NGM 平板（步骤 1.5）。加入 0.5 mL 浓缩的 OP50 培养物。
    3. 制备浓缩 OP50：在四个 1 L 的 LB 培养瓶中各加入 2 mL OP50 起始培养物（步骤 1.2 制备），在 37 °C、160 x g 条件下于摇床培养箱中培养 6 小时。在 20 °C 下以 3057 x g 离心 15 分钟收集菌体。弃去上清液，用 6 mL OP50 培养基重悬细菌沉淀，并收集至无菌的 50 mL 锥形管中。
      注：细菌可在 4 °C 下保存最多 1 周。
  7. 将每种线虫品系在 15 cm 直径的 NGM 平板上于 15 °C 培养 3–4 天，每天补充 0.5 mL 浓缩 OP50 进行再喂养。
    1. 当线虫即将耗尽食物时，收集并用 M9 缓冲液洗涤（步骤 1.6.1），将每种线虫品系的培养物转移至两块 15 cm NGM 平板（步骤 1.5），在 20 °C 下继续扩增，直至约 95% 的个体为怀卵成虫（野生型 Bristol N2 品系约需 24 小时）。
      注：怀卵成虫的特征是虫体内含有卵，理想的平板应布满未孵化的卵，且幼虫数量不多33。

2. 肠道微生物分离物保藏的维护（第9天）

  1. 将48种细菌分离物分别划线接种到6 cm LB琼脂平板上，在20 °C下培养48小时。
    注意：如需更快获得结果，细菌可在25 °C下培养24–36小时，但较长时间的20 °C培养有助于发现潜在的污染菌。
  2. 同步化大量C. elegans。
    1. 采用标准的卵制备方法对处于产卵期的成虫进行漂白处理33，并将卵转移至两个未接种细菌的15 cm NGM平板上，在15 °C下孵育24小时，以确保所有L1幼虫在后续步骤中同步孵化并生长。
      ​警告：操作漂白液时需小心谨慎。

3. 培养大量秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养物（第10天）

  1. 孵化后，将L1幼虫（来自步骤2.2.1）收集至洁净的15 mL锥形管中，加入3–4 mL M9缓冲液。用移液器吸取4滴10 µL线虫溶液，分别滴加至载玻片或培养皿上，在体视显微镜下以16倍放大倍数计数每滴中的线虫数量。通过计算所有液滴中幼虫数量的平均值，确定线虫溶液的浓度。将该数值乘以剩余液体体积，估算每种品系的线虫总数。
    注意：此阶段每种品系需要 46,000–50,000 条 L1 幼虫，以便后续填满一个 384 孔板或两个半板。
    1. 对于每种菌株，将所有L1幼虫转移至两个预先接种了3 mL OP50（步骤1.5）并重新接种0.5 mL浓缩OP50的15 cm NGM平板上（每板23,000–25,000个L1幼虫）。
  2. 在15 °C条件下培养，根据需要每天补充0.5 mL浓缩的OP50，直至线虫发育至L4阶段。
    注意：L4 阶段的特征是肠道颜色略深，以及在阴门最终形成的位置出现一个半圆盘状或新月形的白色斑块32,33.
  3. 按照以下步骤制备96孔NGM-琼脂糖平板。
    1. 通过向每个孔中加入125 µL NGM-琼脂糖，制备八块96孔NGM-琼脂糖板（每项检测使用四块板）。
      注意：建议多准备一些额外的平板，以防后续步骤中部分平板受到污染。需要两台酶标仪并行进行检测，但也可以先进行热应激检测，因其最短可运行6小时，之后再依次进行其他检测。对于这些平板， <4% 灰分琼脂被琼脂糖替代（参见 材料表），从而实现NGM凝胶塞更缓慢且均匀的干燥，减少线虫钻孔行为，提高回收效率。
    2. 确保各孔中的液体均匀且无气泡。使用设定在70 °C的加热模块（由于多孔板的塑料材质导热较慢，NGM-琼脂糖的实际温度可能仅升至约55–60 °C）以防止混合物在操作过程中凝固。为去除孔内的气泡，可使用经无菌火焰加热的细针处理。
    3. 将96孔板置于无菌环境中室温静置，然后倒置（盖子朝下以防止冷凝），并存放于洁净盒子中，4 °C保存备用。
  4. 第11天，检查3.2步骤中的线虫，确保无污染出现且线虫仍处于饱满状态。
  5. 第12天，检查3.1步骤中的线虫，确保无污染出现且线虫仍处于饱食状态。同时检查线虫的发育阶段。
    ​注意：所使用的线虫的性别/品系及发育阶段（例如 L4 或 L4 + 24 h 的线虫）取决于对线虫施加的处理条件。此处，野生型雌雄同体线虫从 L4 阶段开始暴露于细菌分离物，持续 36 小时。

4. 为重新喂养线虫制备肠道微生物分离物集合

  1. 观察第2.1步中LB琼脂平板上的细菌生长情况，并继续在20 °C下培养。
    注意：若某些克隆生长不良或出现污染，可从干净的菌种中重新划线接种至6 cm LB平板，于25–28 °C培养24小时，以备后续实验使用（尽管此情况并非理想）。
  2. 为待测的细菌文库设计96孔阵列布局，以便在后续步骤中系统性地接种平板并进行数据分析（补充表1）。
  3. 从每个6 cm细菌平板（第4.1步）上收集菌体，转移至已标记的含1 mL M9缓冲液的1.5 mL离心管中。可使用一次性无菌塑料环（直径2 mm）或金属环（直径5 mm）进行操作。每次更换菌株前，需将金属环浸入100%乙醇中消毒，火焰灼烧后冷却5秒。
  4. 涡旋振荡离心管，直至细菌沉淀完全重悬（根据菌株不同，可能需要约1–10秒）。
  5. 在室温下以9,300 × g 离心5分钟，弃去700 µL上清液，再通过涡旋振荡重悬细菌沉淀。
  6. 根据第4.2步设定的布局，将每种细菌悬液各200 µL转移至一个无菌96孔板的对应孔中。
  7. 使用多通道移液器从此96孔板中取10 µL菌液，接种至八个NGM-琼脂糖96孔板（第3.3步制备）中，盖上盖子于25 °C培养24小时。不要密封平板，以利于平板干燥和细菌的有氧生长，并避免过多冷凝水产生。
  8. 用洁净的压敏封板膜（见材料表）密封第4.6步制备的96孔菌悬液板，于15 °C保存最多5天，用于后续线虫的补充喂食。

5. LFASS 热激和氧化应激实验设置（第13-14天）

  1. 观察步骤 3.5 中的培养皿，评估线虫的发育阶段。一旦 >90%的线虫已发育至L4期34用最多10 mL无菌M9溶液将线虫收集到15 mL锥形管中。
  2. 用142 x g离心，充分洗涤线虫（至少4次） g 在4 °C下离心2分钟，弃去上清液，每次洗涤之间加入10 mL新鲜无菌M9以去除OP50细菌。将线虫沉淀重悬于10 mL M9中。
  3. 将50 µL线虫溶液转移至低吸附表面离心管中（参见 材料表) 加入950 µL M9。轻轻混匀管内液体以避免线虫沉降，迅速使用润湿的低吸附枪头将3-4个10 µL液滴分别转移至玻片或NGM平板上，在体视显微镜下计数线虫数量（参见 材料表在16倍放大倍数下进行计数。取3-4滴样本的计数平均值，确定虫液中每微升的线虫数量（参见步骤3.1）。
  4. 将10 mL离心管中的线虫浓度调整至8 µL中含有约120条线虫。如果5.2步制备的溶液浓度过低，可离心收集线虫，并相应去除M9缓冲液，直至每8 µL中含有120条线虫。
  5. 将8 µL线虫溶液（约120条线虫）使用多通道移液器或重复移液器转移至第4.7步中准备的八个96孔NGM-琼脂板的每个孔中。应使用低吸附枪头以减少线虫损失。必要时可剪切枪头末端，以便大尺寸成虫通过，从而降低对成虫的机械损伤。
    注意：该检测至少需要 30 条健康存活的线虫才能可靠进行，但每孔约 100 条线虫时效果最佳。
  6. 将线虫和接种细菌的96孔NGM-琼脂板在25 °C下孵育36 h。
  7. 在12至24小时之间检查平板，确保线虫在整个过程中保持饱食状态。若需重新喂食，将第4.8步中保存于15 °C的96孔细菌阵列板中的细菌重新悬浮，并向其中线虫可能在36小时培养期结束前发生饥饿的96孔NGM-琼脂糖平板中加入最多10 µL相应的细菌溶液（饥饿线虫将导致结果产生显著差异，因此该步骤极为重要）。
    注意：以下步骤需在第15天进行。在开始检测之前，可能需要优化读板高度。最佳读数高度为孔底部上方20–50 µm处，具体取决于酶标仪的型号。部分酶标仪提供Z轴扫描功能，而另一些则允许手动输入高度。应将最佳高度设定为检测到最高蓝色荧光（365 nm/430 nm）信号的位置。某些酶标仪在固定高度运行，该高度已针对贴壁细胞检测优化，可能不适用于LFASS检测。
  8. 36小时后，向96孔板的每孔中加入30 µL M9。
    注意：进行热应激实验时，酶标仪需提前开启并达到实验所需温度方可使用，建议提前启动仪器预热。本实验方案采用 42 °C 以最大化杀伤速度，但该方法同样适用于 30 °C 以上的其他温度条件。
  9. 根据预设布局，使用低吸附枪头（可考虑剪去枪头末端，以便较大线虫通过，减少对成年线虫的机械损伤）将线虫（约 20 µL）转移至 384 孔板中。
    注意：本研究中，所描述的两种检测方法（热应激和氧化应激）需使用两种不同的酶标仪设置，因此用于这两种检测的样品不得置于同一块384孔板中。
  10. 确保酶标仪已正确设置（表1).
  11. 用M9培养基补足384孔板，使每孔终体积达到60 µL。进行热应激实验时，每孔加入40 µL M9培养基，并进行后续操作 t-BHP诱导的氧化应激，向6 µl样品中加入34 µl M9 t- BHP（参见 材料表).
    1. 在加入t-BHP后2分钟内开始检测（理想情况下，所有线虫应同时暴露于t-BHP，检测的时间分辨率为2分钟）。若无法实现，应使用计时器记录加入t-BHP过程中移液操作所耗时间，以便后续校正死亡中位时间。
  12. 用透明盖板盖紧板孔，再用美纹纸胶带密封384孔板的边缘（将胶带贴在板和盖子上），确保胶带不覆盖盖子上方或板子下方。使用手术刀在盖子与板之间每隔一段距离划开胶带，以允许气体交换，同时在检测过程中尽量减少蒸发。
  13. 将培养板放入酶标仪中（参见 材料表）并开始运行。设定激发波长为365 nm，每2分钟检测一次435 nm处的发射光，持续6-12小时（表1).
    ​注意：通常情况下，42 °C 热应激实验需 6 小时，7% t-BHP 氧化应激实验需 8 小时。

6. 酶标仪数据处理

  1. 将酶标仪的原始荧光数据保存为逗号或制表符分隔的 .txt、.csv 或 .xls /.xlsx 格式，然后转换为 xls /.xlsx 格式。根据数据格式，重新整理数据以匹配 LFASS 分析所需的 Excel 表格布局。请遵循参考文献30中提供的详细说明。
    注意：虽然数据可以手动分析，例如对每个时间序列进行归一化处理，并确定死亡荧光达到半最大值的时间点，但也可在 Matlab 中运行 LFASS 程序实现自动化分析30。
  2. 从 https://github.com/ABA80/LFASS 下载并安装 Matlab（版本 2014a 或更高版本）以及 LFASS 软件包。请遵循其中提供的指南和注释。
    注意：图 1C 简要描述了该方法。运行 LFASS 程序需要使用 Matlab。或者，可将 Matlab 代码转换为 Oracle 语言，但拟合函数除外，因其为专有功能。新的平滑函数和 S 型函数可被重写，以实现在完全开源平台上的应用。
  3. 在两次 LFASS 分析之间，应将数据和结果移至新的位置，因为 LFASS 分析会处理数据文件夹中的所有文件，并覆盖结果文件夹中的文件。

7. 数据检查

  1. 打开 Excel 文件，并根据 384 孔板上的孔位标记行。 补充文件 2 展示了热激实验生成的原始荧光数据 Excel 文件的一个示例。使用 384 孔板上的孔位来标注线虫和细菌菌株。
  2. 在进行 Matlab 分析之前，先在 Excel 中目视检查数据，绘制代表性孔位的荧光强度随时间变化的曲线。根据所用酶标仪的不同，数据可能存在噪声，但应显示出明显的峰值。具体包括：
    1. 确定一个荧光值阈值，低于该值的峰值与噪声无显著差异（在 LFASS 中设置此阈值可通过排除空孔来加快分析速度）。
    2. 记录荧光波动在上升前趋于平稳的最早时间点（动物可能剧烈摆动长达 30 分钟，导致蓝色荧光读数快速波动）。
      注意：通过从曲线拟合窗口中排除这些早期时间点，可提高峰值拟合效果。
    3. 记录最小和最大荧光值预期出现的时间点范围（观察多个孔位以确定这些范围），这些范围将用于曲线拟合。
    4. 检查各孔位间荧光峰值幅度是否存在显著差异；若存在，使用以下公式在进一步分析前对数据进行归一化处理：
      归一化荧光值 孔n(t) = (荧光值 孔n[t] - 孔最小荧光值[Dt]) / (孔最大荧光值[Dt] - 孔最小荧光值[Dt])
      其中 "n" 为当前孔编号，"t" 为时间点，"Dt" 为该实验的时间点序列。

8. LFASS 数据处理

注意：详细信息请参见 https://github.com/ABA80/LFASS 以及参考文献30 的补充材料。

  1. 在 LFASS 文件夹内创建两个子文件夹，一个用于存放待分析的数据，另一个用于存放结果，例如 "my data" 和 "results"。
  2. 在完成数据检查后，将检测的 Excel 数据文件复制到 LFASS 子文件夹 "my data" 中。
  3. 启动 MATLAB，导航至 LFASS 文件夹，在命令窗口中输入并运行 fitfolder （补充文件 3），然后按照屏幕提示操作。
  4. 输入 "fitfolder" 后，系统将提示输入包含 Excel 文件的文件夹名称，例如 'my data'。输入您的数据文件夹名称（在本例中为 "my data"）。
  5. 按照屏幕提示，提供所需的各种参数。
    1. 输入 "2" 作为当前实验方案中连续测量之间的时间间隔（指定此参数可使结果以分钟为单位，而非时间点单位）。
      注：可根据需要修改时间间隔，以更频繁或更少地进行荧光测量（降低或提高时间分辨率），并需根据酶标仪的性能进行调整（例如，对于无法快速测量的酶标仪，可能需要增加时间间隔）。务必始终确保实验时间间隔与 LFASS 程序设置一致。
    2. 通过输入 "0.95" 设置上限容差阈值（可根据需要调整以优化拟合），输入 "0.05" 设置下限容差阈值（可根据需要调整以优化拟合），以约束 S 形曲线拟合。
      注：其他时间参数基于数据检查时的用户记录（步骤 7.2）。
  6. 当系统提示时，输入 "y" 表示“是”或 "n" 表示“否”，选择是否显示拟合和平滑后的曲线。若需视觉检查拟合收敛情况，请选择前者。
    注：后者可用于可视化所有平滑数据，但通常不选择，因其会产生过多弹出图形。随后，MATLAB 将执行 LFASS 程序，若一次性处理多个 Excel 文件，可能需要 1–10 分钟。弹出的曲线窗口将根据步骤 8.6 的选择显示。补充文件 4A 展示了一个拟合曲线的示例。
  7. 选择是否（1）分析被识别为噪声的曲线，或（2）对拟合不佳的曲线进行重新拟合，选项为 [y/n]。输入 y 表示同意，输入 n 表示拒绝。
    注：建议选择重新拟合，特别是当存在大量拟合不佳或未拟合的曲线时。这将允许用户在每条曲线出现在屏幕上时，为其提供定制的曲线拟合参数，仅需指定 S 形拟合的起始和结束边界。此操作可重复多次，直至满意为止。
  8. 数据分析完成后，关闭 MATLAB 并打开 LFASS 文件夹。
  9. 点击 LFASS 子文件夹 My results，结果文件将自动以 .txt 格式保存在 Results 文件夹中。
    注：MATLAB 生成三个 .txt 文件："Batch-fitted.txt"、"Batch and noise-fitted.txt" 和 "Refitted.txt"。前两个文件为预防计算机崩溃或用户在重新拟合过程中出错而保存。包含最准确完整分析结果的文件是 "Refitted.txt"。
  10. 使用 Microsoft Excel 打开 Refitted.txt 文件，并另存为 .xls 格式以供进一步处理。补充文件 4B 展示了此类结果文件的一个示例。
    注：对于每一孔（按行排列），列中提供三个值，用于估计线虫种群死亡时间的中位数："Raw"：报告实验数据峰值半最大值处的时间交点；"Batch-fitted"：报告批量拟合曲线半最大值处的时间交点；"Refitted"：报告重新拟合曲线半最大值处的时间交点。
  11. 将文件以 .xls 格式另存一份至安全位置。若未执行此操作，下次运行 LFASS 程序时文件可能被覆盖。
    注：结果可进一步用于作图或统计分析。

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结果

LFASS 检测能够同时对多种测试条件进行稳健、高通量且快速的筛选，例如筛选影响抗应激能力和衰老的多种遗传和微生物组参数。实验仅需 2–3 周即可获得涵盖多种测试条件的大量数据集。将 L4 + 36 h 的野生型成虫种群在 48 种肠道微生物分离株上培养 36 小时后，分别暴露于 42 °C 的热应激和 7% t-BHP 诱导的氧化应激条件下。该检测重复进行了四次，每次实验中每种条件均设置四个重复。在所有测试条件下，热应激检测中线虫的中位死亡时间在 40–130 分钟之间，而 t-BHP 诱导的氧化应激检测中则在 90–240 分钟之间。早期成虫期的热应激检测通常比氧化应激检测结果更一致，且日间和日内变异更小，对后续寿命的预测能力也更强30。以不同微生物饮食喂养的线虫在中位死亡时间上的差异，明确说明了肠道共生菌对宿主抗应激能力的影响。图 2 展示了布里斯托尔 N2 野生型线虫在两种感兴趣的肠道微生物分离株及标准实验室菌株 E. coli OP50 上进行的 16 个生物学重复的...

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讨论

C. elegans 因其体型小、透明、发育迅速、寿命短、成本低廉且易于操作，非常适合同时快速筛选多个实验参数。其基因组、身体结构、神经系统、肠道和微生物组相较于人类虽显著简化，但仍具有足够的复杂性和相似性，因此是一种强大的临床前模型，可在测试生物活性功效或毒性的同时获得机制性认识。随着人们对开发微生物干预疾病疗法的兴趣日益增长8,9,34,35，利用此类临床前模型快速研究益生菌成为一种极具吸引力的选择，因为微生物具有尚未充分开发且近乎无限的治疗潜力34。本文所述方案适用于研究环境细菌对 C. elegans 健康的影响，但也可轻松调整用于其他目的。

多功能性
构成该实验流程的不同"模块...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

感谢美国明尼苏达州的秀丽隐杆线虫遗传资源中心（CGC Minnesota，美国麦迪逊，NIH - P40 OD010440）提供线虫品系和OP50菌株，感谢德国基尔大学（CAU, Kiel, Germany）的Hinrich Schulenburg教授提供本文所展示的所有环境微生物分离株。本研究由英国科研与创新署-生物技术和生物科学研究理事会（UKRI-BBSRC）向AB提供的基金（BB/S017127/1）资助。JM由兰卡斯特大学健康与医学学部（FHM）博士奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
直径 10 cm 的培养皿（非透气型）Fisher Scientific10720052细菌培养无需透气
直径 15 cm 的培养皿（透气型）Fisher Scientific168381
384 孔黑色透明平底板Corning3712 或 3762快速应激实验无需无菌
直径 6 cm 的培养皿（透气型）Fisher Scientific150288线虫培养需要透气，以避免缺氧
96 孔透明板（Biolite）Thermo130188
琼脂（<4% 灰分）Sigma-Aldrich102218041高质量琼脂对培养基结构完整性至关重要，可防止线虫钻入
琼脂糖Fisher ScientificBP1356
Avanti Centrifuge J-26 XPBeckman coulter
次氯酸钠溶液（漂白剂）Honeywell425044
氯化钙Sigma-AldrichC5080
Centrifuge 5415 REppendorf
Centrifuge 5810 REppendorf
胆固醇Sigma-AldrichC8667
LB 琼脂Difco240110
LB 肉汤Invitrogen12795084
LoBind 吸头VWR732-1488LoBind 可减少转移过程中线虫的损失
LoBind 离心管Eppendorf22431081
硫酸镁Fisher ScientificM/1100/53
酶标仪 - infinite M nano+Tecan单色器设置可实现荧光调节，但使用滤光片的系统亦可满足要求
酶标仪 - SparkTecan
磷酸二氢钾HoneywellP0662
氯化钠Sigma-AldrichS/3160/63
配备透射照明底座的体视显微镜系统LeicaMZ6 或 M80需要 0.6–0.8 倍至 40–60 倍的放大倍数，同时需要高质量的透射照明底座，配备可变形、可倾斜或可滑动的反射镜以调节对比度
t-BHP（tert-丁基过氧化氢）Sigma-Aldrich458139
透明粘性封板膜 NuncFisher Scientific101706871封板膜必须透明，并能耐受实验过程中的温度变化
色氨酸Sigma-Aldrich1278-7099
酵母提取物Fisher ScientificBP1422

参考文献

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