实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

摘要

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。

摘要

多发性硬化症（MS）是一种典型的中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病，其特征为炎性浸润、脱髓鞘以及轴突损伤。目前尚无彻底治愈MS的方法，但已有多种疾病修饰治疗（DMT）可用于控制和减缓疾病的进展。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）在中枢神经系统的病理特征与MS患者具有显著相似性，因此被广泛用作代表性模型，以评估MS药物的疗效并探索新的治疗方法。在小鼠中主动诱导EAE具有稳定且可重复的效果，特别适用于研究药物或基因对自身免疫性神经炎症的影响。本文主要介绍通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG_35-55）免疫C57BL/6J小鼠，并结合临床评分系统每日评估疾病症状的方法。鉴于MS病因复杂且临床表现多样，现有的临床评分系统难以满足对疾病治疗效果的全面评估。为克服单一干预指标的局限性，本研究引入基于MS患者焦虑样情绪和骨质疏松等临床表现的新指标，以实现对MS治疗效果更全面的评估。

引言

自身免疫性疾病是一类由免疫系统对自身抗原产生免疫反应，进而导致组织损伤或功能障碍的疾病谱¹。多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性多发性神经病，其特征为炎性细胞浸润、脱髓鞘以及神经元轴突变性^2,3。目前，全球约有250万人受MS影响，主要为20至40岁的青壮年人群，他们往往是家庭和社会的中坚力量，因此该疾病给家庭和社会带来了显著的影响与负担^2,4。

多发性硬化症（MS）是一种具有多种复杂临床表现的多因素疾病。除了以炎性浸润和脱髓鞘为特征的经典神经系统障碍外，MS 常表现为视力障碍、肢体运动障碍以及认知和情绪障碍^5,6,7。若 MS 患者未能接受适当且正确的治疗，约半数患者在 20 年后将依赖轮椅生活，近半数患者会出现抑郁和焦虑症状，其自杀意念的发生率远高于普通人群^8,9。

尽管已进行了长期的研究，多发性硬化症（MS）的病因仍然不明，其发病机制也尚未阐明。动物模型为研究MS提供了重要的工具，可用于探索疾病的发展过程及新的治疗方法。尽管啮齿类动物与人类的免疫系统存在显著差异，但两者仍具有一些基本的共同原理。目前，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究MS最理想的动物模型，该模型通过使用髓鞘蛋白的自身抗原诱导易感小鼠对中枢神经系统（CNS）成分产生自身免疫反应，并联合使用完全弗氏佐剂（CFA）和百日咳毒素（PTX）以增强体液免疫反应。根据小鼠的遗传背景和所用免疫抗原的不同，可诱导出急性、复发-缓解或慢性等不同的疾病进程，以模拟MS的多种临床类型^10,11,12。构建EAE模型常用的免疫原来源于自身中枢神经系统蛋白，如髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂质蛋白（PLP）或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。在SJL/J小鼠中，使用MBP或PLP免疫可诱导出复发-缓解型病程，而在C57BL/6小鼠中，MOG则可引发慢性进行性EAE^11,12,13。

疾病修饰治疗（DMT）的主要目的是减轻疾病症状并改善功能⁶。目前临床上已有多种药物用于缓解多发性硬化症（MS），但尚无药物能够完全治愈该疾病，这表明联合治疗的必要性。C57BL/6小鼠是目前最常用于构建转基因小鼠的品系，本研究采用在C57BL/6J小鼠中通过MOG_35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，并结合5分制评分系统来监测疾病进展。EAE模型不仅表现出广泛认知的脱髓鞘病变，还伴有类似焦虑的情绪状态和骨量流失。本文还描述了利用旷场实验和微型计算机断层扫描（Micro-CT）分析从多个角度评估EAE症状的方法。

方案

本研究经同济大学动物护理委员会批准，所有动物护理均遵循相关指南。实验使用8至12周龄的雄性或雌性C57BL/6J小鼠。确保实验组间小鼠的年龄和性别一致，否则会影响其对疾病易感性。小鼠饲养于特定病原体阴性环境中，采用12小时光照与12小时黑暗交替循环，环境条件恒定（室温23 ± 1 °C，湿度50% ± 10%），并可自由摄取小鼠饲料和饮水。

1. MOG_35-55 乳剂的制备

1. 将热灭活的冻干结核分枝杆菌（MTB，H37Ra）加入完全弗氏佐剂中（该佐剂本身已含有1 mg/mL的热灭活MTB，H37Ra），使最终MTB浓度达到5 mg/mL（见材料表）。
   注意：整个操作必须在生物安全柜中进行；切勿开启吹风功能。
2. 用无菌预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）（不含钙和镁离子，pH 7.4）溶解冻干的MOG_35-55多肽（见材料表），配制成浓度为2 mg/mL的抗原溶液。
3. 取一支洁净的2 mL微量离心管，向每支管中加入一个已灭菌的5 mm钢珠（见材料表）。
4. 向上述含有一个钢珠的微量离心管中加入500 µL含5 mg/mL MTB的完全弗氏佐剂和500 µL MOG_35-55抗原溶液。
5. 将上述离心管置于TissueLyser（见材料表）上振荡10分钟，冰上冷却10分钟，重复此步骤四次，以充分混匀，最终形成白色黏稠状乳剂。
   注意：良好的乳化是制备MOG_35-55乳剂的关键步骤，因此必须充分混合。TissueLyser的振荡频率设定为28 Hz。

2. 百日咳毒素（PTX）的制备

1. 用ddH₂O将PTX配制成100 µg/mL的浓度，并于4 °C保存。
2. 用无菌1x PBS（不含钙和镁离子，pH 7.4）将PTX储备液稀释50倍，制成200 ng/100 µL的工作溶液使用。

3. 建立EAE动物模型

1. 使用8-12周龄的雄性或雌性C57BL/6J小鼠构建EAE模型。在免疫前，确保小鼠已充分适应饲养环境。
2. 离心制备好的MOG_35-55 乳化（步骤1）在4 °C下持续2-3秒，通过按压 脉冲 设备上的按钮（参见 材料表) 使所有乳状液沉淀至管底。
   注意：MOG_35-55 乳剂可在 -20 °C 下保存数天。为避免药物失效，建议尽快使用。
3. 将22 G针头连接至1 mL注射器筒上，吸取MOG_35-55 乳液，并转移MOG_35-55 将乳剂转移至一支新的1 mL注射器筒中。使用封口膜将1 mL注射器筒与26 G针头连接处固定密封（参见 材料表).
   注意：加入MOG时避免产生气泡_35-55 将乳剂装入1 mL注射器筒中。
4. 擦拭并消毒 用70%乙醇消毒注射部位。
5. 注射 MOG_35-55 在小鼠背部脊柱两侧皮下分别注射100 µL乳剂。注射操作完成后，观察小鼠背部皮下自发形成的球状肿块。
   注意：免疫过程应由经验丰富的实验人员操作，注射时应轻柔缓慢，以尽量减少对小鼠的压力。
6. 向上述小鼠腹腔注射 100 µL PTX（步骤 2）。
   注意：免疫当天记为第0天。同时，需确保能够准确识别小鼠，以便进行后续每日评估，例如使用彩色标记笔在小鼠尾巴上做标记。
7. 在免疫后第2天注射相同剂量的PTX。
8. 准备一组未免疫的野生型（WT）小鼠。

4. 小鼠的临床监测

1. 每天记录EAE和WT小鼠的体重。
   注意：EAE的严重程度与小鼠体重减轻呈正相关，因此体重也是一个非常重要的监测指标。
2. 使用表1中列出的0-5分评分系统，在免疫后0-21天内监测小鼠状态。
   注意：介于两者之间的症状记为±0.5分。

5. 开放旷场实验

注意：本步骤选用的实验动物为处于早期发病、高峰期和缓解期的EAE小鼠。此外，使用野生型（WT）小鼠作为对照。需要注意的是，所有小鼠在建模前均进行了类似焦虑行为的检测，以排除具有焦虑障碍的小鼠用于EAE建模。此外，在高峰期和缓解期完全丧失运动能力的EAE小鼠也被排除在测试之外。

1. 准备一个 40 × 40 × 40 cm³ 的开放场地反应箱和一套运动活动（开放场地）视频分析系统（参见材料表）。
   注意：摄像头应安装在能够完全覆盖箱子的位置，反应室需光照均匀，且测试房间应为安静区域。
2. 在开始实验前 1 小时，将待测小鼠放入测试房间进行适应。
3. 使用 70% 乙醇喷洒整个区域，并用干净的纸巾擦拭，以确保测试开始前反应箱清洁。
4. 从笼中逐一取出每只小鼠，并将其放置在场地的同一角落，再开始探索。
   注意：箱底被划分为 16 个网格，其中中间四个网格区域为中心区域，周围区域为外围区域。
5. 点击视频分析系统菜单栏中的开始采集按钮，记录时间并开始拍摄。
6. 测试过程中保持测试房间安静。
7. 在录制过程中让小鼠自由活动 5 分钟。
8. 停止采集系统，并保存视频。
9. 将小鼠从场地中取出，放回笼中，然后进行下一只小鼠的测试。
   注意：每次测试之间需用 70% 乙醇清洁测试区域，以去除气味及其他残留物质。
10. 使用视频分析系统分析结果。

6. 骨表型分析

1. 在第21天通过颈椎脱位法处死EAE小鼠和野生型（WT）小鼠。
   注意：执行颈椎脱位操作的人员必须经过良好培训，以尽量减少动物在死亡过程中所承受的痛苦。
2. 将小鼠平放在解剖托盘中，并固定其四肢。
3. 用镊子夹住小鼠后肢皮肤，使用剪刀切开小鼠的皮肤和肌肉组织。
4. 用剪刀小心地将股骨与胫骨及髋骨分离。
5. 用剪刀去除附着在股骨上的肌肉组织，并将股骨置于室温下的70%乙醇中。
6. 使用显微CT系统（见材料表），以10 µm的各向同性体素尺寸、70 kV的X射线管峰值电压和0.114 mA的X射线强度扫描股骨远端。
   注意：3D高斯滤波器可用于对2D阈值图像进行去噪处理。
7. 分析从股骨中段开始扫描的100个切片，以测量股骨参数，包括骨体积、组织体积、骨矿物密度、小梁分离度、小梁数量、小梁连接密度以及小梁和皮质厚度。
   注意：从小鼠股骨远端生长板近端起始处开始，找到完全不含骨骺帽结构的切片，并继续向近端股骨方向延伸100个切片，通过手动勾画距离皮质骨内表面数个体素的轮廓区域，以识别骨骺端的小梁结构。
8. 通过在显微CT系统中叠加来自轮廓区域的阈值2D图像，生成3D重建图像。

结果

小鼠免疫后，每天记录其体重，并根据上述方案（步骤4）评估其临床症状。在用MOG肽免疫的C57BL/6J小鼠中，由于病变部位主要局限于脊髓，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的发病过程通常从尾部向头部发展。疾病初期，EAE小鼠表现为尾巴无力和下垂，随后出现后肢无力、运动不协调及瘫痪。随着病情加重，逐渐发展为前肢无力、瘫痪，在严重情况下，小鼠活动困难，甚至接近死亡状态。如图所示 图1A，不同EAE病理程度小鼠的状态图描绘了一组小鼠从无症状发展至重度EAE症状（评分4分）的典型过程。前文也已提及，EAE小鼠的体重变化与临床症状相关。与野生型（WT）小鼠相比，EAE小鼠的体重下降可能在免疫后最初几天即开始出现，而临床症状通常在免疫后第6–9天开始，并于第14–16天达到高峰。此后，EAE小鼠的症状通常会部分恢复，同时体重下降情况也会随之缓解（图1B, C因此，EAE 发病过程通常分为早期发病、高峰期和缓解期，准确预测这些时间点对于评估结局指标具有重要意义。一般而言，为分析EAE病灶局部免疫...

讨论

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统的脱髓鞘炎症性疾病，也是导致年轻人慢性残疾的最常见神经系统疾病之一，给家庭和社会带来巨大负担^3,4。MS 一直被归类为器官特异性的T细胞介导的自身免疫性疾病，可诱导自身免疫系统逐渐破坏中枢神经系统，并累及全身多个系统²⁷。典型的临床症状包括视力障碍、运动功能障碍、认知与情绪障碍等^6,7。若未得到妥善治疗，MS 是一种破坏性极强且进行性加重的疾病，可导致严重失明和瘫痪²⁸。目前 MS 的发病机制尚未完全阐明，因其临床表现和病理进展具有高度异质性，因此动物模型对于 MS 的研究及治疗手段的开发至关重要。

MS 最常研究的动物模型是 EAE，其主要建模方法有两种：主动免疫和被动免疫²⁹

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器（带 26 G 针头）	上海 kindly 医疗器械有限公司	60017031
2 mL 微量离心管	HAIKELASI	KY-LXG2A
22 G 针头	上海 kindly 医疗器械有限公司	60017208
完全弗氏’s 佐剂	Sigma	F5881	4 °C 保存，每 mL 含 1 mg 热灭活的 MTB（H37Ra）
条件性位置偏爱系统	上海吉量软件科技有限公司		动物行为
乙醇	国药集团化学试剂有限公司	10009218	室温保存
运动活动（敞箱）视频分析系统	上海吉量软件科技有限公司	DigBehv-002	动物行为
MOG35-55 肽	吉尔生化有限公司	GLS-Y-M-03590	-20 °C 保存
结核分枝杆菌 H37Ra	BD	231141	4 °C 保存
敞箱实验反应室	上海吉量软件科技有限公司		动物行为
百日咳毒素	Calbiochem	516560	4 °C 保存
磷酸盐缓冲液			本实验室配制
剪刀	上海医疗器械（集团）有限公司	J21010
封口膜	Heathrow Scientific	HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R 微型离心机	Thermo Scientific	75002447
钢珠	QIAGEN	69975
TissueLyser II	QIAGEN	85300
镊子	上海医疗器械（集团）有限公司	JD1060
μCT 35 台式微计算机断层扫描仪	Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland