本文介绍了一种用于测定单个细胞中线粒体（mt）DNA绝对拷贝数及mtDNA缺失异质性水平的实验方案。
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摘要
摘要
哺乳动物线粒体（mt）DNA 是一种小型环状双链线粒体内部 DNA 分子，编码电子传递链的 13 个亚基。与二倍体的细胞核基因组不同，大多数细胞含有更多的 mtDNA 拷贝，拷贝数从少于 100 到超过 200,000 不等，具体数量取决于细胞类型。mtDNA 拷贝数正越来越多地被用作多种与年龄相关的退行性状况和疾病的生物标志物，因此，准确测定 mtDNA 拷贝数正成为科研和诊断领域的重要工具。mtDNA 的突变通常以单核苷酸多态性（SNPs）或缺失的形式出现，这些突变可能存在于细胞内所有 mtDNA 拷贝中（称为同质性），也可能以突变型与野生型（WT）mtDNA 拷贝混合的形式存在（称为异质性）。异质性 mtDNA 突变是临床线粒体病理的主要原因，不仅见于罕见疾病，也越来越多地出现在帕金森病等常见晚发性疾病中。确定细胞中异质性水平是诊断罕见线粒体疾病以及研究线粒体可能参与的常见晚发性疾病的必要步骤。传统上，mtDNA 拷贝数和异质性的测定依赖于基于定量（q）PCR 的检测方法或深度测序。然而，近年来数字滴定 PCR（ddPCR）技术的引入为同时测定这两个参数提供了另一种方法。该技术相较于现有方法具有多项优势，包括能够测定绝对 mtDNA 拷贝数，并具备足够的灵敏度，即使在拷贝数较低的情况下也能对单个细胞进行准确测量。本文提供了一项详细方案，描述使用 ddPCR（下文简称液滴生成 PCR）在单细胞中测定 mtDNA 拷贝数的方法，并可选择性地同时测定存在 mtDNA 缺失的细胞中的异质性水平。本文还讨论了将该方法扩展应用于测定携带 mtDNA SNPs 细胞中异质性的可能性。
引言
哺乳动物线粒体（mt）DNA 是一种小型（约 16.5 Kb）环状 DNA 基因组，位于线粒体基质中，编码 37 个基因，包括两个 rRNA、22 个 tRNA 和 13 个蛋白质编码基因1。与每个细胞中每个基因仅有一个（单倍体）或两个（二倍体）拷贝的核基因组不同，mtDNA 在每个细胞的线粒体中以多个拷贝形式存在，拷贝数范围从几十个（例如成熟精母细胞）到数十万个（例如卵母细胞）2,3。由于这种多拷贝特性，mtDNA 基因组中的突变（可能表现为单核苷酸多态性（SNP）、缺失或重复）在特定细胞中可呈现不同水平，占细胞总 mtDNA 群体的比例可从 0% 到 100% 不等。同一细胞中同时存在野生型和突变型 mtDNA 基因组的现象称为异质性（heteroplasmy），而致病性的异质性 mtDNA 突变是线粒体疾病的主要病因之一，多种常见的神经系统综合征均与潜在的异质性 mtDNA 突变相关4。
导致异质性线粒体DNA突变引发临床疾病的两个关键参数是异质性水平和线粒体DNA拷贝数。许多异质性突变表现出阈值效应，即生化和临床表型仅在某一特定异质性水平之上才会显现，通常约为80%5，并随着异质性水平进一步升高而加重
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方案
所有实验均遵循ARRIVE指南，并经剑桥大学动物福利伦理审查委员会（AWERB）批准。
注意：在进行液滴生成前的所有样品制备步骤必须在洁净的PCR前工作区进行，条件允许时应尽量在紫外灭菌的生物安全柜中操作。本方案中所描述的实验使用特定的液滴生成PCR设备（见材料表），尽管该通用方法可能适用于其他系统，但仍建议参考设备制造商提供的指南，确认引物/探针浓度、PCR扩增循环条件等参数，因为这些参数可能与本文所述存在差异。本研究所用的细胞系或原代细胞如下：人HeLa细胞（商业获取）、人HEK 293T细胞（商业获取）、原代人皮肤成纤维细胞（来自纽卡斯尔生物样本库）、人细胞杂交体（野生型及ΔH2.1缺失型15，由迈阿密大学C. Moraes提供）、小鼠胚胎成纤维细胞（永生化，来自C57Bl/6小鼠，由纽卡斯尔大学J. Stewart提供）、小鼠原始生殖细胞（来自C57Bl/6小鼠胚胎）以及小鼠MII期卵母细胞（来自成年雌性C57Bl/6小鼠）。所有培养的细胞均在含10%胎牛血清的高糖（4.5 g/L）DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养。本研究所用的小鼠原代细胞来源于根据英国《动物（科学程序）法案1986》在英国内政部项目许可证P6C97520A下饲养的实验动物。
1. 设计并合成靶向目的DNA序列....
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结果
液滴生成后，每个孔中油相上层可见一层清晰的不透明液滴悬浮层（图1B）。在进行单细胞实验时，若裂解液中含有去污剂，可能会对液滴的形成产生不利影响。尽管最终样本中仍残留少量TWEEN-20，但采用2.1.2节所述的裂解方案，通常仍可获得超过推荐水平（10,000个）的液滴产量（图1C）。然而，使用其他裂解缓冲液（如RLT Plus缓冲液）时，所形成的液滴数量显著减少（图1C），这可能对拷贝数测量的准确性产生不利影响。
PCR扩增和液滴读取后，每个样本孔所用的各个通道中均会观察到明显分离的阳性和阴性液滴群（图2A），而NTC孔中仅含有阴性液滴。在分析结果时可能遇到的潜在问题包括：
阳性群与阴性群之间缺乏清晰的分离，且在两群之间出现液滴，称为“雨滴”现象（图.......
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讨论
本方案不仅适用于上述细胞类型和物种，还可广泛应用于其他多种细胞类型和物种。然而，在采用未经验证的引物/探针组合设计新检测方法时，必须对实验条件进行仔细优化，以确保方法的准确性和重复性。在处理单细胞时，至关重要的是确保样本采集尽可能准确（例如，使用严格的单细胞参数通过FACS分选细胞），以保证所得结果真实反映单个细胞的情况；同时，所有前期准备工作均需在洁净的PCR前处理区域进行，以降低污染风险。高效的细胞裂解对于确保线粒体DNA拷贝能够成功分配到独立的微滴中也极为关键；但需注意，使用较高浓度的去垢剂可能会干扰微滴的形成，因此应在裂解效率与微滴稳定性之间取得平衡。
由于检测设计和裂解步骤是实验方案中最关键的部分，因此这些步骤最有可能需要进行问题排查。如果引物/探针组合最初未能产生明显分离的阳性和阴性液滴群，可通过优化PCR程序中的退火/延伸温度来改善其性能。步骤5.1中建议的58 °C温度已针对（表1）中的引物/探针组合进行了验证；然而，最佳温度可能在55–65 °C之间变化，因此可在该温度范围内进行梯度PCR，以确定新引物/探针组合的最适温度。如果该.......
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披露
无利益冲突需要披露。
致谢
感谢L. Bozhilova博士在液滴生成PCR数据统计分析方面的建议。感谢H. Zhang博士提供用于生成数据的卵母细胞。 图 3C 和 图 4B本工作由SPB在剑桥大学医学研究委员会线粒体生物学单元（MC_UU_00015/9）完成，并由以下机构资助 由PFC持有的惠康信托主要研究奖学金（212219/Z/18/Z）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50% 吐温-20 溶液 | Novex | 3005 | |
| 自动液滴生成油 | 伯乐（Bio Rad） | 1864110 | 用于生成油相/液滴乳液的商用油制剂（用于方案步骤 4.1） |
| C1000 PCR仪配备深孔反应模块 | 伯乐（Bio Rad） | 1851197 | 配备深孔加热模块的PCR扩增仪，用于细胞裂解（实验步骤2.1.2）和PCR扩增循环（实验步骤5） |
| 收集板冷却块 | 伯乐（Bio-Rad） | 12002819 | 用于液滴生成过程中保持样本低温的冷却块（在方案步骤 4.3 中使用） |
| ddPCR 96孔板 | 伯乐（Bio Rad） | 12001925 | 适用于QX200 AutoDG微滴生成仪的96孔板移液器吸头，用于样本制备（方案步骤3.4）和微滴收集（方案步骤4.3） |
| ddPCR 微滴读取仪用油 | 伯乐（Bio Rad） | 1863004 | 商用油相制剂，用于液滴读取器（在方案步骤6.1中使用） |
| ddPCR探针超级混合液（不含dUTP） | 伯乐（Bio-Rad） | 1863023 | 用于探针法数字滴落式PCR（ddPCR）实验的商用预混液（用于方案步骤3.3） |
| DG32 自动液滴生成器 cartridges | 伯乐（Bio-Rad） | 1864108 | 用于QX200 AutoDG液滴生成仪的微流控芯片，以生成油/液滴乳液（用于方案步骤4.3） |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | 合格胎牛血清 |
| 铝箔板盖 | 伯乐（Bio Rad） | 1814040 | 用于液滴生成后密封液滴收集板的箔板盖（用于方案步骤 4.6） |
| HEK 293T 细胞 | Takara | 632180 | 表达SV40大T抗原的HEK 293人胚肾细胞系商业化亚克隆 |
| HeLa 细胞 | ECACC | 93021013 | 人宫颈上皮样癌细胞 |
| 高糖DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5 g/L D-葡萄糖，含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠 |
| 人类细胞杂交系 | 迈阿密大学 | ||
| 小鼠胚胎成纤维细胞 | 纽卡斯尔大学 | 源自C57Bl/6小鼠的永生化细胞 | |
| 无核酸酶水 | Ambion | AM9937 | |
| PCR板密封膜 | 皮尔斯 | SP-0027 | 透明粘性板密封膜，仅在液滴生成前使用（步骤4.6中必须使用铝箔密封膜） |
| 移液器吸头废弃物收集箱 | 伯乐（Bio-Rad） | 1864125 | 用于QX200 AutoDG液滴生成仪中收集废弃吸头的一次性收集盒（在方案步骤4.3中使用） |
| AutoDG 系统用移液吸头 | 伯乐（Bio-Rad） | 1864120 | 专用于QX200 AutoDG液滴生成仪的滤芯吸头（用于方案步骤4.3） |
| 原代人皮肤成纤维细胞 | 纽卡斯尔生物样本库 | ||
| 引物/探针 | IDT | N/A | 引物/探针的精确序列取决于具体检测方法。本研究中使用的引物和探针序列见表1。 |
| 蛋白酶K 20 mg/mL 溶液 | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR板封膜机 | 伯乐（Bio Rad） | 1814000 | 在液滴生成后，对数字PCR样本板应用铝箔封膜（用于方案步骤4.6） |
| QX Manager 软件 | 伯乐（Bio Rad） | 12012172 | 液滴读取仪设置 &和分析软件（用于方案步骤6） && 7) |
| QX200 AutoDG 微滴生成仪 | 伯乐（Bio-Rad） | 1864101 | 自动微流控液滴生成器（用于方案步骤4） |
| QX200 微滴读取仪 | 伯乐（Bio Rad） | 1864003 | 液滴读取仪（用于方案步骤6） |
| Trizma 预置晶体 pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
参考文献
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.
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