本文介绍了一种用于处理年轻成年及老年沙土鼠耳蜗的实验方案，包括对传入性突触结构和毛细胞进行免疫标记、淬灭老年组织中的自发荧光、解剖并测量耳蜗长度，以及对共聚焦成像获得的图像序列进行突触定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
连接内毛细胞与传入听觉神经纤维的带状突触的丢失被认为是与年龄相关的听力损失的原因之一。检测带状突触丢失最常用的方法是免疫标记法，因为它允许从单个耳蜗的多个拓扑位置进行定量取样。然而，所关注的结构深埋于骨性耳蜗内部。沙鼠被用作研究年龄相关性听力损失的动物模型。本文描述了沙鼠耳蜗整体组织的常规固定、免疫标记、共聚焦成像以及带状突触数量和体积定量的实验方案。此外，还强调了从珍贵的老龄个体中获取优质样本所面临的特殊挑战。
将沙鼠实施安乐死后，进行心血管灌注，或小心地从颅骨中分离出鼓室泡。在耳蜗的顶端和底端打开后，直接转移至固定液中。无论采用何种初始方法，耳蜗均需进行后固定，随后进行脱钙处理。接着，使用针对突触前和突触后结构以及毛细胞的一抗对组织进行标记。然后，将耳蜗与荧光标记的二抗共同孵育，这些二抗特异性识别相应的一抗。对于老年沙鼠的耳蜗，还需使用自发荧光淬灭剂处理，以降低老年动物组织中通常较强的背景荧光。
最后，将耳蜗解剖为6至11个节段。通过重建整个耳蜗长度，可在不同个体之间可靠地确定特定的耳蜗位置。依次获取的共聚焦图像堆栈有助于在选定位置可视化毛细胞和突触。对共聚焦图像堆栈进行去卷积处理后，可使用ImageJ手动计数突触，或通过在Matlab中自定义编写的图像分析程序对突触结构进行更全面的定量分析。
引言
老年性耳聋是全球最常见的疾病之一，影响着全球超过三分之一年龄在65岁及以上的人群1。其根本原因目前仍在争论中，并且正在被积极研究，可能包括连接内毛细胞（IHCs）与传入听觉神经纤维的特化突触的丧失2。这些带状突触由突触前结构组成，其上锚定着充满神经递质谷氨酸的囊泡，以及突触后α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）谷氨酸受体3,4,5。在沙土鼠中，约有20根传入听觉神经纤维与一个内毛细胞相接触6,7,8。位于内毛细胞朝向蜗轴一侧的神经纤维对应较大的突触带状体，而连接在内毛细胞支柱侧的纤维则面对较小的突触带状体（例如，在猫9、沙土鼠7、豚鼠10和小鼠3,11,
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方案
所有实验方案和操作程序均已获得德国下萨克森州相关主管部门的批准，许可编号为 AZ 33.19-42502-04-15/1828 和 33.19-42502-04-15/1990。本实验方案适用于两种性别的蒙古沙鼠（M. unguiculatus）。青年成年鼠指年龄为 3–12 个月的个体，而 36 个月及以上年龄的沙鼠被视为老年鼠。除非另有说明，缓冲液和溶液均可配制后置于冰箱中保存数月（4–8 °C）。使用前应确保缓冲液和溶液未发生沉淀。
1. 固定与器官采集
注意：如果仅需耳蜗，建议采用相对简单的浸入法固定。然而，若同时需要保存良好的脑组织，则只能选择经心灌注固定法。两种方法所用的固定液均为含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）。固定液应新鲜配制，但可分装后冷冻保存备用。进行经心灌注时，每例使用约300 mL；采用浸入法固定耳蜗时，每个耳蜗使用50–100 mL。
警告：PFA 为有害物质；操作时须遵循常规实验室安全规程。
- 经心脏灌注固定
- 冲洗灌注装置，直至管路中无任何气泡。用含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS）充满灌注管路（0.2 mL 肝素加入 100 mL PBS 中），以防止血液凝固。当管路充满 PBS 且液体储存瓶刚好排空时，停止流动；随后向瓶中倒入 200 ....
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结果
耳蜗组织可通过全身灌注固定液后取材，或在动物安乐死后迅速解剖并进行浸没固定。采用后一种方法时，内毛细胞在解剖过程中通常能保持原位；而当灌注失败导致组织固定不充分时，感觉上皮常被破坏。需要注意的是，作者曾遇到过经心脏灌注固定后，耳蜗固定效果不足而脑组织固定仍充分的情况。对于灌注效果较差的组织，可通过在耳蜗顶回和底回钻孔，并将耳蜗浸入4%多聚甲醛中再固定2天来挽救。
根据 Müller25 的方法测定整个耳蜗的长度，以评估特定耳蜗位置的内毛细胞（IHCs）及其突触，这些位置对应于不同的特征频率（表 1）。为此，所需耳蜗位置以从耳蜗基部起算的基底膜长度百分比表示。13 个年轻成年沙鼠耳蜗的中位长度为 11.3 mm（四分位距：11.02–11.52 mm）；24 个老年沙鼠耳蜗的中位长度为 11.5 mm（四分位距：11.24–11.73 mm）。年轻成年与老年耳蜗长度之间无显著差异（Mann-Whitney U 检验：U = -1.62，p = 0.105）；总体中位长.......
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讨论
通过本方案所述方法，可对年轻成年及老年沙鼠耳蜗中的内毛细胞（IHCs）和突触结构进行免疫标记，通过共定位突触前和突触后成分鉴定假定的功能性突触，将其分配至各个IHC，并定量分析其数量、体积和位置。 本方法所用抗体还可标记外毛细胞（OHCs；myoVIIa）及其突触前带状结构。此外，针对耳铁蛋白（otoferlin）的抗体可作为对IHCs和OHCs进行免疫标记的可行替代方案，其中OHCs的信号强度明显弱于IHCs。
灌流可采用两种不同的装置。1）重力滴注系统，即一个瓶子连接商用滴注管路，悬挂于离动物约1.5米高的滑轮装置上。通过降低瓶子（瓶口敞开）可依次加入液体。2）使用数字控制变速蠕动泵的系统，其一端为细长软管开口用于吸入液体，另一端可方便地连接针头。两种系统效果相当，此处不再详述其细微差异。然而，作者特别推荐使用下吸式工作台，将动物置于带孔平台之上，废气从下方抽走。这种设置可在不影响排风功能的前提下，为手术区域提供良好的操作空间（与在敞开式通风柜中操作不同）。
组织的适当固定至关重要，否则在解剖过程中感觉上皮会脱落.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
作者感谢Lichun Zhang在建立该方法过程中提供的帮助，以及奥尔登堡卡尔·冯·奥西茨基大学荧光显微镜服务单元提供的成像设施支持。本研究由德国研究基金会（DFG，德国研究基金会）根据德国卓越战略——EXC 2177/1 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无生物素V型白蛋白组分 | 卡尔·罗斯 | 0163.2 | |
| 抗-CtBP2（IgG1 单克隆小鼠） | BD 生物科学，Eysins | 612044 | |
| 抗GluA2（IgG2a单克隆小鼠） | Millipore | MAB39 | |
| 抗小鼠（IgG1）-AF 488 | Molecular Probes 公司 | A21121 | |
| 抗肌球蛋白VIIa（兔多克隆IgG） | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| 刀片架 && 断路器 - 平口钳 | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| 波恩动脉剪 - 球头尖端 | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| 盖玻片厚度1.5H，24 × 60 mm | 卡尔·罗斯 | LH26.1 | |
| 一次性手术刀片 | Henry Schein | 0473 | |
| 驴抗兔（IgG）-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 — 精细镊 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF 镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| 乙醇，纯度99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| 乙二胺四乙酸 | 卡尔·罗斯 | 8040.2 | |
| Excel | 微软公司 | ||
| 羽毛双刃刀片 | 普拉诺 | 112-9 | |
| G19 套管针 | Henry Schein | 9003633 | |
| 山羊抗小鼠（IgG2a）-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| 肝素 | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | 科学成像体积 | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol，浸油 518F | 卡尔·蔡司 | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic，150 cm（无菌包装上带数据矩阵码） | 布劳恩 | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | 蠕动泵 | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | 体视显微镜光源 |
| Leica Application Suite X | 徕卡显微系统 CMS 有限公司 | ||
| Leica TCS SP8 系统 | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| 梅奥剪 钨碳合金 ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 轨道摇床 | 科学工业公司 | SI-M100 | 用于寒冷环境 |
| Narcoren（戊巴比妥） | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | ||
| 尼康 Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | 尼康欧洲有限公司 | ||
| 多聚甲醛 | 卡尔·罗特 | 0335.3 | |
| 无通气孔培养皿 | Avantor VWR | 390-1375 | |
| <强>磷酸盐缓冲液： | |||
| 磷酸氢二钠 | AppliChem | A1046 | |
| 磷酸二氢钾 | 卡尔·罗斯 | 3904.1 | |
| 氯化钾 | 卡尔·罗斯 | 6781.1 | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| 带螺帽的容器 | Sarstedt | 75.562.300 | |
| 叠氮化钠 | 卡尔·罗斯 | K305.1 | |
| 学生用阿克森持针钳 | 精细科学工具 | 91106-12 | |
| 学生用哈尔斯特德-蚊式止血钳 | 精细科学工具 | 91308-12 | |
| Superfrost 防脱载玻片 | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | 卡尔·罗斯 | 3051.2 | |
| TrueBlack 脂褐素自发荧光淬灭剂 | Biotium | 23007 | |
| Vannas弹簧剪，3 mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 型培养皿附件，适用于 Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| 野生型 TYP 355110（体视显微镜） | Wild Heerbrugg | 不再提供 |
参考文献
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging coch....
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重印与许可
