需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

年轻成年与老年沙鼠耳蜗中带状突触的免疫标记与计数

2.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63874

⸱

2022年4月21日

 ,  , 
1Cluster of Excellence "Hearing4all" and Research Centre Neurosensory Science, Department of Neuroscience, School of Medicine and Health Science, Carl von Ossietzky University Oldenburg

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于处理年轻成年及老年沙土鼠耳蜗的实验方案，包括对传入性突触结构和毛细胞进行免疫标记、淬灭老年组织中的自发荧光、解剖并测量耳蜗长度，以及对共聚焦成像获得的图像序列进行突触定量分析。

摘要

连接内毛细胞与传入听觉神经纤维的带状突触的丢失被认为是与年龄相关的听力损失的原因之一。检测带状突触丢失最常用的方法是免疫标记法，因为它允许从单个耳蜗的多个拓扑位置进行定量取样。然而，所关注的结构深埋于骨性耳蜗内部。沙鼠被用作研究年龄相关性听力损失的动物模型。本文描述了沙鼠耳蜗整体组织的常规固定、免疫标记、共聚焦成像以及带状突触数量和体积定量的实验方案。此外，还强调了从珍贵的老龄个体中获取优质样本所面临的特殊挑战。

将沙鼠实施安乐死后，进行心血管灌注，或小心地从颅骨中分离出鼓室泡。在耳蜗的顶端和底端打开后，直接转移至固定液中。无论采用何种初始方法，耳蜗均需进行后固定，随后进行脱钙处理。接着，使用针对突触前和突触后结构以及毛细胞的一抗对组织进行标记。然后，将耳蜗与荧光标记的二抗共同孵育，这些二抗特异性识别相应的一抗。对于老年沙鼠的耳蜗，还需使用自发荧光淬灭剂处理，以降低老年动物组织中通常较强的背景荧光。

最后，将耳蜗解剖为6至11个节段。通过重建整个耳蜗长度，可在不同个体之间可靠地确定特定的耳蜗位置。依次获取的共聚焦图像堆栈有助于在选定位置可视化毛细胞和突触。对共聚焦图像堆栈进行去卷积处理后，可使用ImageJ手动计数突触，或通过在Matlab中自定义编写的图像分析程序对突触结构进行更全面的定量分析。

引言

老年性耳聋是全球最常见的疾病之一，影响着全球超过三分之一年龄在65岁及以上的人群1。其根本原因目前仍在争论中，并且正在被积极研究，可能包括连接内毛细胞（IHCs）与传入听觉神经纤维的特化突触的丧失2。这些带状突触由突触前结构组成，其上锚定着充满神经递质谷氨酸的囊泡，以及突触后α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）谷氨酸受体3,4,5。在沙土鼠中，约有20根传入听觉神经纤维与一个内毛细胞相接触6,7,8。位于内毛细胞朝向蜗轴一侧的神经纤维对应较大的突触带状体，而连接在内毛细胞支柱侧的纤维则面对较小的突触带状体（例如，在猫9、沙土鼠7、豚鼠10和小鼠3,11,12,13,14中均如此）。此外，在沙土鼠中，突触前带状体的大小与突触后谷氨酸受体斑块的大小呈正相关7,14。位于内毛细胞蜗轴侧、对应较大带状体的神经纤维直径较小，具有较低的自发放电率和较高的听觉阈值15。有证据表明，与位于内毛细胞支柱侧的高自发放电率、低阈值纤维相比，低自发放电率的纤维对噪声暴露10和耳毒性药物16更为敏感15。

带状突触的丢失是耳蜗神经性老年听力损失中最早的退行性事件，而螺旋神经节细胞及其传入性听觉神经纤维的丢失则滞后于前者17,18。相应的电生理指标包括听觉脑干反应17和复合动作电位的记录8；然而，这些指标并不能反映突触丢失的细微变化，因为低自发放电率的神经纤维对这些测量无明显贡献16。更有前景的电生理指标是基于群体电位的神经指数19和刺激锁时反应时间20。然而，这些指标仅在动物除听觉神经纤维丢失外不存在其他影响残余听觉神经纤维活动的耳蜗病理改变时才可靠8。此外，在沙鼠中通过行为学评估的听觉阈值与突触数量之间未发现相关性21。因此，唯有通过对耳蜗组织的直接检查，才能可靠地定量存活的带状突触数量，进而确定功能性听觉神经纤维的数量。

蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）是研究年龄相关性听力损失的合适动物模型。其寿命较短，具有与人类相似的低频听力，易于饲养，并且表现出与人类年龄相关性听力损失相关的病理特征2,22,23,24。当沙鼠达到36月龄时即被视为进入老年阶段，这接近其平均寿命的终点22。重要的是，已有研究表明，在安静环境中饲养并自然衰老的沙鼠会出现与年龄相关的带状突触丢失8,21。

本文介绍了一种对不同年龄沙鼠（从年轻成年到老年）耳蜗进行免疫标记、解剖和分析的实验方案。实验中使用了针对突触前成分（CtBP2）、突触后谷氨酸受体斑块（GluA2）以及内毛细胞（IHCs）的抗体（myoVIIa）。同时应用了一种自发荧光淬灭剂，可有效降低老年耳蜗组织中的背景荧光，同时保持目标荧光信号的完整性。此外，本文还详细描述了耳蜗解剖方法，以便同时观察感觉上皮和血管纹结构。通过测量耳蜗长度，可确定对应于特定最佳频率的不同耳蜗位置25。突触数量的定量分析采用免费软件ImageJ进行26。对单个毛细胞内突触体积及其空间定位的进一步定量分析则使用基于Matlab自主编写的软件完成。由于作者缺乏资源以提供专业的文档编写和技术支持，该软件未对外公开。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验方案和操作程序均已获得德国下萨克森州相关主管部门的批准，许可编号为 AZ 33.19-42502-04-15/1828 和 33.19-42502-04-15/1990。本实验方案适用于两种性别的蒙古沙鼠（M. unguiculatus）。青年成年鼠指年龄为 3–12 个月的个体，而 36 个月及以上年龄的沙鼠被视为老年鼠。除非另有说明，缓冲液和溶液均可配制后置于冰箱中保存数月（4–8 °C）。使用前应确保缓冲液和溶液未发生沉淀。

1. 固定与器官采集

注意：如果仅需耳蜗，建议采用相对简单的浸入法固定。然而，若同时需要保存良好的脑组织，则只能选择经心灌注固定法。两种方法所用的固定液均为含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）。固定液应新鲜配制，但可分装后冷冻保存备用。进行经心灌注时，每例使用约300 mL；采用浸入法固定耳蜗时，每个耳蜗使用50–100 mL。

警告：PFA 为有害物质；操作时须遵循常规实验室安全规程。

  1. 经心脏灌注固定
    1. 冲洗灌注装置，直至管路中无任何气泡。用含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS）充满灌注管路（0.2 mL 肝素加入 100 mL PBS 中），以防止血液凝固。当管路充满 PBS 且液体储存瓶刚好排空时，停止流动；随后向瓶中倒入 200 mL 解冻的多聚甲醛（PFA）溶液。
      注：此时装置已准备好用于动物。管路中残留的 PBS 足以冲洗血液，一旦恢复流动，固定液将自动接续灌注。
    2. 确保已设置废液收集系统以接收流出的 PFA。准备新的套管针（19 G），并备好大剪刀、镊子（带扁平尖端）、止血钳、手术刀或锋利的套管针，以及带图钉的橡胶垫。
    3. 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠对沙鼠实施安乐死（160 mg/mL，每只动物 0.3 mL，体重范围：50–120 g）。将动物放回笼中。当出现呼吸停止，呼吸变得不规则且间隔达 30 秒或更长时，将沙鼠仰卧置于橡胶垫上，并用图钉固定其双前肢和一只后肢（保留另一只后肢自由活动，以便更好地判断灌注是否成功；见步骤 1.1.7 后的注释）。
    4. 为打开胸腔，用镊子提起胸骨上方的皮肤，用剪刀在胸骨下方约 0.5 cm 处剪开皮肤，直至露出白色的processus xiphoideus。用镊子夹住processus xiphoideus，沿膈肌剪开，以充分暴露胸腔。从两侧横向剪开肋骨，直至能良好接触心脏。操作时应保持剪刀角度与沙鼠身体平行且平贴，避免损伤器官，从而维持循环系统的封闭性。
    5. 用止血钳夹住胸骨，抬起胸廓，并将止血钳置于沙鼠肩部上方，避免其接触任何身体部位，以防阻碍血流。
    6. 轻微开启液体流动，使 PBS 以约每 2 秒一滴的速度从套管针（19 G）流出。用镊子握住心脏并向左轻微旋转，使左心室清晰可见。以避免穿破室间隔的角度将套管针插入左心室。可用手或另一把止血钳固定针头位置。
      注：左心室与右心室可通过颜色差异区分；左心室颜色较浅，与其他心肌组织不同。
    7. 缓慢增加液体流速压力，同时用精细剪刀、手术刀或另一根套管针剪开右心耳。进一步打开液体流动，使滴液室中流速达到约 2–3 滴/秒，或设定泵流速为 4 mL/min。一旦心脏开始固定，确保灌注套管保持原位而无需继续手动固定。
      注：成功灌注的迹象包括缓慢的肌肉收缩、颈部和四肢僵硬、肝脏变苍白以及肺部呈粉红色。若肺部变白，则提示灌注失败，表明室间隔被穿破，导致肺循环被灌注。
    8. 若灌注失败，尝试将套管针进一步向上推进至主动脉，并用止血钳夹紧固定。
    9. 将沙鼠断头。按步骤 1.2.2 所述方法去除鼓泡并剪除、剥离其骨组织。
      注：若组织固定不充分，在解剖过程中柯蒂氏器的感觉上皮可能从基底膜脱落。
    10. 若在灌注开始后 5–10 分钟内未见固定迹象，应立即终止灌注，并按以下浸入法固定程序操作。此时，按步骤 1.2.2 处理耳蜗，并将组织置于约 50–80 mL 的 4% PFA 溶液中，于 8 °C 条件下在二维摇床上后固定 1–2 天。
      注：由于在灌注过程中难以最终评估固定质量，建议常规按上述方法对耳蜗进行后固定。
  2. 组织浸入法固定
    1. 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠对沙鼠实施安乐死（160 mg/mL，每只动物 0.3 mL，体重范围：50–120 g）。当沙鼠呼吸停止后，立即断头。
    2. 用剪刀和镊子分别去除鼓泡并剪除、剥离其骨组织，以暴露耳蜗。去除锤骨、砧骨及半规管。用镊子轻轻刮擦耳蜗骨，在蜗顶和基转处制造小孔。立即将鼓泡转移至过量冷固定液中（至少 50 mL），并在低温（4–8 °C）下于二维摇床（100 rpm）中轻柔振荡固定 2 天。
      ​注：组织固定后，耳蜗可立即进行后续处理，或保存于含 0.05% 叠氮化钠的 PBS 中。警告：叠氮化钠具有毒性。需注意，储存时间可能对染色质量产生负面影响。有限的试验表明，组织在叠氮化钠中储存 2 年后，免疫染色信号明显减弱。

2. 组织制备与免疫标记

  1. 将乙二胺四乙酸（EDTA）粉末溶解于PBS中，配制pH为8的0.5 M溶液。具体操作：将烧杯置于磁力搅拌器上，加入约一半总体积的PBS，然后加入适量EDTA粉末，形成酸性悬液。在pH计监测下，小心滴加浓氢氧化钠溶液（NaOH）。用PBS定容至所需最终体积，并过滤溶液以防止微生物污染。
    注意：EDTA粉末仅在悬液达到中性pH值后才会完全溶解。
  2. 进行脱钙时，将耳蜗组织转移至80 mL含0.5 M EDTA的PBS溶液中。在4–8 °C低温条件下，于2D摇床（100 rpm）上轻柔振荡孵育2天。
    注意：脱钙步骤完成后，组织可在PBS中于4 °C保存数天至3周，再继续后续处理步骤。对于标记血管纹的抗体，建议在此时（即免疫染色前）沿蜗轴将耳蜗组织从中间切开，以确保抗体均匀到达靶标区域。此操作依赖于所用抗体，不适用于本实验中用于标记突触结构和毛细胞（IHCs）的抗体。切割时使用可折式刀片及刀片架（如步骤4.2所述）。
  3. 以下步骤（至步骤3.2）均在2 mL密封反应管中进行。若组织过大无法放入管中，可用剪刀修剪多余部分。为增强抗体渗透，先将组织在1 mL含1%吐温-100（Triton X-100）的PBS溶液中，于室温下在2D摇床（100 rpm）上孵育1小时进行通透处理。随后在含0.2%吐温-100的PBS溶液中，于2D摇床（100 rpm）上室温洗涤3次，每次5分钟。
  4. 为阻断非特异性抗原，将耳蜗组织在1 mL封闭液（含3%牛血清白蛋白[BSA]和0.2%吐温-100的PBS溶液）中，于2D摇床（100 rpm）上室温孵育1小时。
    注意：封闭液可预先配制，但不宜超过约10天。
  5. 将以下一抗用同一份封闭液新鲜稀释：抗myoVIIa（myosin VIIa）抗体用于标记内毛细胞（IHCs）（兔源IgG多克隆抗体），稀释比例为1:400；抗CtBP2（C末端结合蛋白2）抗体用于标记突触前带状结构（小鼠源IgG1单克隆抗体），稀释比例为1:400；抗GluA2抗体用于标记突触后受体斑块（小鼠源IgG2a单克隆抗体），稀释比例为1:200。确保耳蜗组织完全浸没于抗体溶液中（通常为0.4 mL），并在37 °C孵育24小时。
  6. 随后，在含0.2%吐温-100的PBS溶液中，于2D摇床（100 rpm）上室温洗涤组织5次，每次5分钟。选择与一抗宿主物种匹配的二抗，并用含3% BSA和0.2%吐温-100的PBS溶液新鲜稀释：羊抗小鼠（IgG1）-Alexa荧光染料（AF）488，稀释比例为1:1,000；羊抗小鼠（IgG2a）-AF568，稀释比例为1:500；驴抗兔-AF647（IgG），稀释比例为1:1,000。用铝箔包裹反应管以避免荧光淬灭。将耳蜗组织在0.4 mL二抗溶液中，于37 °C孵育24小时。
    注意：有限的实验尝试表明，将耳蜗组织在37 °C下与一抗和二抗孵育24小时，相比更常见的低温短时孵育方案，可获得更强的免疫荧光信号。
  7. 将耳蜗组织在含0.2%吐温-100的PBS溶液中洗涤2次，每次1 mL、5分钟；再在PBS中洗涤3次，每次5分钟，均于2D摇床（100 rpm）上室温进行。
    ​注意：完成上述洗涤步骤后，耳蜗组织可在约4 °C冰箱中的PBS中保存数天。

3. 自发荧光淬灭剂处理（可选）

注意：中年和老年沙鼠的耳蜗表现出广泛的背景自发荧光。在年轻成年组织中，无需使用自发荧光淬灭剂。原则上，可在免疫染色程序之前应用自发荧光淬灭剂，从而避免意外降低目标抗体的荧光信号。然而，根据制造商的产品说明书，使用去污剂（如本方案中的Triton X-100）将不再可行，因为它们会将淬灭剂从组织中去除。

  1. 在体视显微镜下将耳蜗切成两半，操作步骤如4.2所述。
  2. 将自发荧光淬灭剂与70%乙醇混合，配制成5%溶液，将耳蜗置于该溶液中，在室温下于二维摇床上孵育1分钟。随后在二维摇床上用1 mL PBS洗涤耳蜗，每次5分钟，共洗涤3次。
    ​注意：自发荧光淬灭剂具有危害性和毒性。操作该物质时应佩戴手套。

4. 最终精细解剖

  1. 在体视显微镜下解剖耳蜗 。将一个聚苯乙烯培养皿及其盖子装满PBS，并准备好两把精细镊子、Vannas弹簧剪、刀片架和可折断的剃刀刀片。根据解剖步骤，从剃刀刀片上折下小段，获得约2-4 mm的切割面。准备载玻片，将三滴封片介质按顺序滴在载玻片上。
    注意：剃刀刀片的切割面磨损较快。每解剖并封片大约两个耳蜗样本后，必须更换刀片。
  2. 如果尚未在步骤3.1中完成，首先在体视显微镜下沿蜗轴将耳蜗 切成两半。为此，将一段长度超过耳蜗盘绕长度的刀片插入刀片架中。将耳蜗置于培养皿中，用刀片去除多余组织。用精细镊子固定耳蜗，沿蜗轴将其切为两半。
  3. 从其中一半开始操作，但将另一半也保留在培养皿中。用镊子小心固定半侧耳蜗，使切割面向上。使用精细弹簧剪剪除覆盖在蜗顶（顶回）上方、前庭阶区域的耳蜗骨质。
  4. 开始分离耳蜗各部分时，通过在蜗轴和听神经处（上方为前庭阶，下方为鼓室阶）进行剪切，分离出中回部分。
  5. 切开耳蜗导管内覆盖血管纹的耳蜗骨质。在柯蒂器上方、血管纹两侧的耳蜗骨质上做两个切口，并使用剃刀刀片最终分离耳蜗各部分。
    注意：血管纹呈深色条带，易于识别。沿血管纹切割可保持柯蒂器结构完整。
  6. 可选步骤：如需收集血管纹，可小心地在柯蒂器与血管纹之间进行切割以分离两者。将血管纹保留在与耳蜗外表面骨质相连的螺旋韧带处，用镊子去除脱钙后的骨组织。将带有血管纹的一面朝上放置于载玻片的封片介质液滴中。
    注意：若所取组织弯曲过度，可能需要将其分割为更小片段，以便在载玻片上展平。
  7. 将耳蜗组织片转移至盛有PBS的聚苯乙烯培养皿盖中，确保耳蜗整体封片样本尽可能平展地贴附于载玻片上。去除多余组织，例如非神经侧的螺旋韧带部分和神经侧的螺旋缘部分。用超细镊子小心移除盖膜。
  8. 将耳蜗组织片放入载玻片上的封片介质液滴中。将耳蜗整体封片样本以柯蒂器朝上的方向放置在载玻片上，避免在成像时光路中遮挡内毛细胞（IHCs）。通过将耳蜗组织片调整至矢状面，观察靠近内毛细胞处的螺旋缘凹陷结构，以确定应朝上的面。
    注意：为了在后续处理中对耳蜗各部分进行数字重建，强烈建议绘制各组织片的示意图并标注解剖标志。此外，组织片在载玻片上应尽量按正确顺序排列。
  9. 重复步骤4.3至4.8，直至整个耳蜗均转移至载玻片上。如有必要，可添加更多封片介质，加盖盖玻片，并用黑色指甲油沿边缘密封盖玻片。在室温避光条件下干燥，随后将载玻片于4 °C避光保存。
    ​注意：即使感觉上皮部分意外丢失，仍应将剩余的耳蜗组织封片，以确保准确估算耳蜗长度。

5. 耳蜗长度测量

  1. 使用落射荧光显微镜系统及其配套软件，通过耳蜗各片段的明场图像测量耳蜗长度。保存每个耳蜗片段的低倍图像（4倍物镜），并使用显微镜软件中的套索测量工具，在每张图像中沿内毛细胞（IHC）排列的行绘制一条线。将所有片段的长度相加，计算总长度。
    注意：当耳蜗片段内的感觉上皮部分缺失时，需对线条进行插值估算。
  2. 为确定单个耳蜗中需要分析的耳蜗位置，使用Müller25提供的公式计算其距耳蜗顶点的相应距离。可在耳蜗片段的打印图等位置标记这些点。

使用共聚焦显微镜进行图像采集

  1. 使用配备油浸40倍物镜（数值孔径1.3）及相应高分辨率成像专用油的共聚焦显微镜。
    注意：若共聚焦显微镜采用倒置光路，则载玻片需倒置放置。此时，在开始最终扫描前，应让样本静置约30分钟，使其稳定沉降至盖玻片上。或者，可使用一种在解剖过程中保持液态、之后逐渐固化并同时保护荧光信号的封片介质。
  2. 激活适当的激光器：本实验方案使用两束波长分别为λ = 488 nm和λ = 522 nm的光泵浦半导体激光器，以及一束波长为λ = 638 nm的二极管激光器。选择荧光标记物的发射波长范围（AF488：499–542 nm，AF568：582–621 nm，AF647：666–776 nm）。由于使用混合探测器计数发射光子，激光波长应至少距离发射光谱曲线10 nm以上。
    注意：必须使用单标记组织进行初步检测，以确保所选探测器带宽能清晰分离各颜色通道（即避免通道串扰）。无线电波会干扰混合探测器，导致光子计数达到最大值，从而在图像堆栈中产生伪影条纹。因此，应避免在显微镜附近使用手机。
  3. 放大组织区域，使图像覆盖约10个内毛细胞（IHCs）。根据奈奎斯特采样定理设置图像分辨率，通常为~40–60 nm/像素。设定z方向步长为0.3 µm，成像速度为400–700 Hz。
    注意：上述两个参数（步长和成像速度）是在最优成像参数与缩短扫描时间之间所做的权衡。
  4. 采用双向采样以缩短成像时间。对488 nm和638 nm通道进行3次帧累积，对522 nm通道进行6次帧累积；此外，对每个通道均进行3次线平均。在z维度上选择图像堆栈的起始和终止位置。
  5. 使用混合探测器（计数模式）时，将增益设为100，以避免信噪比下降。调节激光功率，使感兴趣区域中无像素饱和，同时结构信号尽可能覆盖完整的8位灰度范围。起始激光功率设为0.5%，逐步增加直至结构可见。
    注意：良好的染色效果通常所需激光功率在0.1%至5%之间。
  6. 使用去卷积软件对图像堆栈进行事后处理，利用理论点扩散函数去除小荧光结构周围的模糊光晕。同一实验中的所有堆栈应使用相同的去卷积参数。将去卷积后的图像保存为.tif或.ics格式。
    ​注意：myoVIIa标记（IHCs）经过去卷积处理并无明显改善，为节省时间可省略此步骤。软件会读取图像文件的元数据，但需手动指定若干参数，如光路、包埋介质或浸油介质等。

7. 突触定量分析

  1. 在免费软件 ImageJ 中打开去卷积后的图像序列，该软件需安装 Biovoxxel 插件，插件可从其官网获取。
  2. 通过拆分通道（图像 | 颜色 | 拆分通道）并重新合并通道（图像 | 颜色 | 合并通道），为各通道分配不同颜色以调整其显示颜色。将图像转换为 RGB 图像序列（图像 | 颜色 | 图像序列转 RGB），如有需要，调整亮度和对比度（图像 | 调整 | 亮度/对比度，可选择自动或手动调节最大值滑块），使突触前和突触后结构以及毛细胞标记清晰可辨，与背景形成良好对比。
  3. 选择五个毛细胞（IHC），使用文字工具在图像序列中点击目标位置进行标记（IHC1–IHC5）。打开 ROI 管理器（分析 | 工具 | ROI 管理器），勾选标签选项，以便用数字标记各点。放大感兴趣的毛细胞区域。
  4. 使用点/多点工具，并设置为多点模式（右键点击该工具可切换点模式或多点模式）。在 z 轴方向逐层浏览时，点击功能性带状突触（即突触前带状结构紧邻突触后谷氨酸受体斑块的位置）。
    注意：根据各通道重叠程度及所选颜色，共定位像素会呈现混合色。通常情况下，各个功能性突触之间距离足够远，易于区分。
  5. 当所有目标结构均被标记后，点击 ROI 管理器图形界面中的添加按钮。点击默认名称，选择重命名。
    注意：若在点工具选项菜单中（双击点工具图标）勾选了显示全部复选框，则点标签将在整个图像序列的所有层面中持续显示，有助于避免重复计数同一带状突触。
  6. 在切换至下一个毛细胞进行计数时，应使用手型工具调整图像，完整显示下一个毛细胞，以避免误加计数。在开始新细胞计数前，先从多点工具切换至点工具，防止将新标记误加入先前保存的数据中。在下一个毛细胞中点击目标结构后，再切换回多点工具。重复步骤 7.4 至 7.5，直至完成所有目标毛细胞的评估。
  7. 为保存数据，先在 ROI 管理器中选中对应数据集，然后点击测量。等待新窗口弹出，其中将列出所有测量的数据点。将此列表另存为电子表格文件（文件 | 另存为）。保存图像时，在 ROI 管理器中启用显示全部，然后点击拼合，将点标签永久添加至图像序列中。关闭图像序列时，确认保存更改。

8. 毛细胞上突触体积与位置的分析

注意：作者使用了一种基于 Matlab 自行编程的程序。由于该程序未公开，此处仅作概括性描述（另请参见7）。如有使用意向，请联系通讯作者。该程序以 TIFF 格式、三重标记（IHCs、突触前和突触后）的图像堆栈作为输入，通过图形界面引导用户完成各项分析步骤，并以电子表格格式提供详尽的结果输出。

  1. 将突触结构的位置归一化到由单个内毛细胞（IHC）在支柱-蜗轴方向、耳蜗顶-底轴方向以及IHC顶部（顶膜板）到底部（突触极）轴方向所定义的三维坐标系中。
    注意：突触元件的体积（包括突触前和突触后，以及功能突触的总体积）以 µm3 提供，并归一化至相应的中位数值3。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

耳蜗组织可通过全身灌注固定液后取材，或在动物安乐死后迅速解剖并进行浸没固定。采用后一种方法时，内毛细胞在解剖过程中通常能保持原位；而当灌注失败导致组织固定不充分时，感觉上皮常被破坏。需要注意的是，作者曾遇到过经心脏灌注固定后，耳蜗固定效果不足而脑组织固定仍充分的情况。对于灌注效果较差的组织，可通过在耳蜗顶回和底回钻孔，并将耳蜗浸入4%多聚甲醛中再固定2天来挽救。

根据 Müller25 的方法测定整个耳蜗的长度，以评估特定耳蜗位置的内毛细胞（IHCs）及其突触，这些位置对应于不同的特征频率（表 1）。为此，所需耳蜗位置以从耳蜗基部起算的基底膜长度百分比表示。13 个年轻成年沙鼠耳蜗的中位长度为 11.3 mm（四分位距：11.02–11.52 mm）；24 个老年沙鼠耳蜗的中位长度为 11.5 mm（四分位距：11.24–11.73 mm）。年轻成年与老年耳蜗长度之间无显著差异（Mann-Whitney U 检验：U = -1.62，p = 0.105）；总体中位长...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

通过本方案所述方法，可对年轻成年及老年沙鼠耳蜗中的内毛细胞（IHCs）和突触结构进行免疫标记，通过共定位突触前和突触后成分鉴定假定的功能性突触，将其分配至各个IHC，并定量分析其数量、体积和位置。 本方法所用抗体还可标记外毛细胞（OHCs；myoVIIa）及其突触前带状结构。此外，针对耳铁蛋白（otoferlin）的抗体可作为对IHCs和OHCs进行免疫标记的可行替代方案，其中OHCs的信号强度明显弱于IHCs。

灌流可采用两种不同的装置。1）重力滴注系统，即一个瓶子连接商用滴注管路，悬挂于离动物约1.5米高的滑轮装置上。通过降低瓶子（瓶口敞开）可依次加入液体。2）使用数字控制变速蠕动泵的系统，其一端为细长软管开口用于吸入液体，另一端可方便地连接针头。两种系统效果相当，此处不再详述其细微差异。然而，作者特别推荐使用下吸式工作台，将动物置于带孔平台之上，废气从下方抽走。这种设置可在不影响排风功能的前提下，为手术区域提供良好的操作空间（与在敞开式通风柜中操作不同）。

组织的适当固定至关重要，否则在解剖过程中感觉上皮会脱落...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

作者感谢Lichun Zhang在建立该方法过程中提供的帮助，以及奥尔登堡卡尔·冯·奥西茨基大学荧光显微镜服务单元提供的成像设施支持。本研究由德国研究基金会（DFG，德国研究基金会）根据德国卓越战略——EXC 2177/1 资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无生物素V型白蛋白组分卡尔·罗斯0163.2
抗-CtBP2（IgG1 单克隆小鼠）BD 生物科学，Eysins612044
抗GluA2（IgG2a单克隆小鼠）MilliporeMAB39
抗小鼠（IgG1）-AF 488Molecular Probes 公司A21121
抗肌球蛋白VIIa（兔多克隆IgG）Proteus Biosciences25e6790
刀片架 && 断路器 - 平口钳Fine Science Tools10052-11
波恩动脉剪 - 球头尖端Fine Science Tools14086-09
盖玻片厚度1.5H，24 × 60 mm卡尔·罗斯LH26.1
一次性手术刀片Henry Schein0473
驴抗兔（IgG）-AF647Life Technologies-Molecular ProbesA-31573
Dumont #5 — 精细镊Fine Science Tools11254-20
Dumont #5SF 镊子Fine Science Tools11252-00
乙醇，纯度99.8%Fisher Scientific12468750
乙二胺四乙酸卡尔·罗斯8040.2
Excel微软公司
羽毛双刃刀片普拉诺112-9
G19 套管针Henry Schein9003633
山羊抗小鼠（IgG2a）-AF568InvitrogenA-21134
肝素RatiopharmN68542.04
Huygens Essentials科学成像体积
ImageJFiji
Immersol，浸油 518F卡尔·蔡司10539438
Intrafix Primeline Classic，150 cm（无菌包装上带数据矩阵码）布劳恩4062957E
ISM596DIsmatec蠕动泵
KL 1600 LEDSchott150.600体视显微镜光源
Leica Application Suite X徕卡显微系统 CMS 有限公司
Leica TCS SP8 系统Leica Microsystem CMS GmbH
MatlabThe Mathworks Inc.
梅奥剪 钨碳合金 ToghCutFine Science Tools14512-17
Mini-100 轨道摇床科学工业公司SI-M100用于寒冷环境
Narcoren（戊巴比妥）勃林格殷格翰动物保健有限公司
尼康 Eclipse Ni-EiNikon
NIS Elements尼康欧洲有限公司
多聚甲醛卡尔·罗特0335.3
无通气孔培养皿Avantor VWR390-1375
<强>磷酸盐缓冲液：
磷酸氢二钠AppliChemA1046
磷酸二氢钾卡尔·罗斯3904.1
氯化钾卡尔·罗斯6781.1
氯化钠Sigma Aldrich31434-M
带螺帽的容器Sarstedt75.562.300
叠氮化钠卡尔·罗斯K305.1
学生用阿克森持针钳精细科学工具91106-12
学生用哈尔斯特德-蚊式止血钳精细科学工具91308-12
Superfrost 防脱载玻片EprediaJ1800AMNZ
Triton  X卡尔·罗斯3051.2
TrueBlack 脂褐素自发荧光淬灭剂Biotium23007
Vannas弹簧剪，3 mmFine Science Tools15000-00
Vectashield 抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1000
Vibrax VXR basicIKA0002819000
VX 7 型培养皿附件，适用于 Vibrax VXR basicIKA953300
野生型 TYP 355110（体视显微镜）Wild Heerbrugg不再提供

参考文献

  1. Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
  2. Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
  3. Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
  4. Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
  5. Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
  6. Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
  7. Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
  8. Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
  9. Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
  10. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  11. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  12. Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
  13. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).
  14. Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933(2020).
  15. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  16. Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
  17. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  18. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  19. Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).
  20. Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).
  21. Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
  22. Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
  23. Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
  24. Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
  25. Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).
  28. Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).
  29. Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).
  30. Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
  31. Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
  32. Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).
  33. Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).
  34. Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
  35. Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

带状突触计数免疫标记耳蜗沙鼠耳蜗年龄相关性听力下降内毛细胞共聚焦成像自发荧光淬灭剂耳蜗解剖ImageJ分析突触定量
年轻成年与老年沙鼠耳蜗中带状突触的免疫标记与计数
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。