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寡核苷酸的化学三磷酸化

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DOI：

10.3791/63877

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2022年6月2日

 , 
1The Salk Institute

本文内容

摘要

寡核苷酸5′-三磷酸盐是多种重要生物途径中的常见组分，并在生物技术应用中日益广泛使用。本文介绍了从通过标准自动化合成方法制备的寡核苷酸出发，常规合成与纯化寡核苷酸5′-三磷酸盐的技术。

摘要

5′-三磷酸是一种存在于所有生命体中的重要核酸修饰，目前在生物技术和合成生物学中正越来越多地被用作寡核苷酸的功能性修饰。寡核苷酸5′-三磷酸的传统制备方法 体外 通过酶学方法实现。然而，这些方法仅限于天然RNA寡核苷酸，具有显著的序列偏好性，且往往产生异质性产物。化学三磷酸化新方法的出现，不仅与亚磷酰胺化学法实现的自动化寡核苷酸合成成本降低相辅相成，也适应了当前可获得的多种核苷酸修饰形式。因此，现在可以合成任意序列和长度的寡核苷酸三磷酸酯，并可选择性地引入多种非天然修饰。

本文介绍了使用水杨酰氯磷酸酯和焦磷酸盐对寡核苷酸进行化学三磷酸化的适当方法与技术。该方法采用 commercially available 试剂，适用于大多数通过标准固相合成法制备的寡核苷酸，可在寡核苷酸合成后、脱保护和纯化前2小时内完成。文中展示了化学三磷酸化寡核苷酸作为催化性RNA酶底物的两种应用，包括利用非天然L-构型RNA三磷酸盐合成锤头状核酶的镜像版本。

引言

RNA的5′-三磷酸化形式在生物学中普遍存在，因为它在所有生命领域的RNA转录过程中以及许多RNA病毒生命周期中的RNA复制过程中均会生成。这些三磷酸化分子在真核生物中作为形成7-甲基鸟苷酸帽状mRNA的底物，因此在蛋白质表达中发挥着关键作用1。相比之下，细菌和病毒中会保留三磷酸基团；因此，RNA 5′-三磷酸可被真核生物的先天免疫应答调控因子识别2,3,4,5,6,7。在生物学之外，已进化出多种RNA连接酶核酶，可在体外利用5′-三磷酸基团in vitro8，并已被改造用于诊断检测9,10,11,12,13,14,15。其中一种核酶可用于以小分子L-RNA寡核苷酸5′-三磷酸为原料，进行模板依赖性的L-RNA合成，L-RNA是天然D-RNA的非生物来源“镜像”对映体16,17,18。常规制备不同序列和骨架组成的三磷酸化寡核苷酸，对于研究这些系统至关重要。

实验室中制备RNA 5′-三磷酸盐最常用且易于实现的方法是通过 体外 转录。然而，该方法产生的RNA在序列和大小上受到RNA聚合酶对启动子和底物要求的限制。T7 RNA聚合酶及其特化衍生物是用于此目的最常用的聚合酶。19,20,21,22. 体外 使用这些酶制备的转录RNA必须以5′-末端嘌呤开始，且在前10个核苷酸中显著偏向于嘌呤23,24此外，天然聚合酶对碱基或骨架修饰的核苷酸进行酶促掺入的效率极低，甚至通常无法实现，这限制了除天然D-RNA以外的寡核苷酸5′-三磷酸的合成机会。另一个限制因素是，通过转录生成的RNA 体外 转录产物可能含有显著的5′端和3′端异质性，当长度短于20 nt时，会产生极为异质的产物23,24,25,26,27.

相比之下，通过固相亚磷酰胺合成法制备的寡核苷酸进行化学三磷酸化28,29,30,31,32,33,34,35，可用于制备任意序列、长度为 3–50 nt 的寡核苷酸 5′-三磷酸盐。此外，在进行 5′-三磷酸化之前，还可将多种可通过亚磷酰胺合成法引入的核酸修饰引入寡核苷酸中14,15,16,17,18,29,36。这些方法中的许多均使用水杨酰氯磷酸酯作为磷酰化试剂，该试剂由 Ludwig 和 Eckstein 开发，最初用于单核苷的液相三磷酸化反应37。使用该试剂对寡核苷酸进行三磷酸化可在固相上完成，具体步骤包括：对寡核苷酸 5′-羟基进行磷酰化，随后与焦磷酸盐反应并氧化生成三磷酸基团，最后通过标准程序将寡核苷酸从固相载体上切割下来，并进行脱保护和纯化（图 1）28。

使用试剂和溶剂制备核苷亚磷酰胺的化学合成示意图。
图1：合成寡核苷酸三磷酸化的反应路线图。 第一步中，寡核苷酸5ʹ-羟基与SalPCl发生磷酰化反应；第二步中，5ʹ-水杨酸亚磷酸酯与TBAP反应生成环状亚磷酸中间体；第三步在DNA/RNA合成仪的氧化溶液（0.1 M 碘/吡啶/H2O/THF）中将其氧化，生成环状5ʹ-三偏磷酸酯，并在同一溶液中迅速水解为线性5ʹ-三磷酸产物28,33,37。随后，在水相MeNH2/氨溶液中从固相CPG载体上进行碱性裂解并脱除保护基，此过程可将任何残留的环状三偏磷酸酯进一步水解为线性形式。缩写：SalPCl = 水杨酸亚磷酰氯；TBAP = 三丁基铵焦磷酸盐；THF = 四氢呋喃；CPG = 控孔玻璃；MeNH2 = 甲胺。 请点击此处查看该图的放大版本。

尽管早期使用该方法的发表报告常因产率低和产生不期望的副产物而受限28,37,38，但只要严格维持无水条件，即可常规获得高产率。通过仔细准备试剂并使用由标准塑料组件组装的简易反应装置，即可实现这一条件。本文中，我们演示了寡核苷酸化学三磷酸化的适当步骤，包括试剂准备、反应室组装、三磷酸化反应，以及随后对三磷酸化寡核苷酸的去保护和纯化。此外，还展示了5′-三磷酸化寡核苷酸作为连接酶核酶底物的代表性应用，用于合成具有天然D-RNA和非生物L-RNA骨架的较大核酸产物。

方案

1. 在固相载体上自动化合成5′-羟基寡核苷酸

  1. 根据目标寡核苷酸的组成和仪器说明书，为自动DNA/RNA合成仪准备试剂和亚磷酰胺单体。
  2. 将含有固相载体的合成柱装入合成仪，并按照合成仪的操作规程合成寡核苷酸。
    注意：三磷酸化步骤已针对在1 µmole规模下制备的寡核苷酸进行了优化。
  3. 在上一步寡核苷酸合成过程中，通过去除5′-二甲氧三苯甲基保护基团，获得固相载体上带有5′-羟基的寡核苷酸；或根据合成仪的操作规程进行末端脱三苯甲基步骤以实现该目的。
  4. 从合成仪上取下含有固相载体的5′-羟基寡核苷酸合成柱，在常压真空下干燥10分钟以除去残留溶剂，待三磷酸化所需材料准备就绪后（见第2节），立即进行三磷酸化反应（第3和第4节）。
    注意：若不立即使用，可将干燥后的合成柱置于含干燥剂的密封塑料容器中，在-20 °C、常压环境下保存。此阶段无需进一步干燥，因为在第3节中进行三磷酸化前会再次彻底干燥合成柱。

2. 三磷酸化反应所需材料的准备

  1. 将可调节压力的干燥氩气源连接至至少带有两条管路的气体分配装置，并连接到鼓泡器。确保管路末端接有1 mL塑料注射器，以便与反应装置连接。
  2. 准备三磷酸化反应过程中所需的设备，包括1 mL塑料注射器、三通聚丙烯旋塞、无芯针头、1.5 mL聚丙烯管和小型金属刮勺。使用前至少1天，将其存放于带有干燥剂的密封容器或干燥器中，室温保存。
  3. 至少在使用前1天，分别准备30 mL无水1,4-二氧六环、按体积比3:1配制的二氧六环:吡啶混合液、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和乙腈（ACN），装入带有干燥阱（密封膜袋装4 Å分子筛）的干燥30 mL玻璃瓶中。用橡胶隔垫密封后，存放于含干燥剂的干燥器中。
  4. 将固体2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮（水杨酰氯磷酸酯，SalPCl）保存在其原装容器内，置于含干燥剂的密封广口瓶中，4 °C保存。每次使用前后均需用氩气吹洗容器。
  5. 三磷酸化反应前至少5天配制三丁基铵焦磷酸盐（TBAP）溶液：
    1. 称取1–5 g固体TBAP，置于干燥的30 mL玻璃瓶中，每克TBAP加入1 mL DMF和0.5 mL三丁胺溶解。
    2. 加入三个干燥阱，用橡胶隔垫在氩气氛围下密封瓶口，通入氩气鼓泡30分钟以除气。
    3. 将瓶子放入含干燥剂的密封广口瓶中，4 °C保存5天，使分子筛充分吸附痕量水分。之后将广口瓶转移至-20 °C保存，6个月后需重新配制新鲜溶液。

3. 三磷酸化装置的组装与使用

  1. 若从 -20 °C 保存条件下取出合成柱，请先使其升至室温。
  2. 组装如图2所示的反应室：
    1. 准备前室：从一个干燥的1 mL注射器中取出推杆，使用剪刀或刀片切掉注射器顶部，然后将注射器连接到合成柱上。将三通旋塞连接至注射器顶部，并将旋塞的侧入口通过鼓泡器连接至干燥的氩气源，使旋塞的顶部入口作为试剂加样口。
    2. 使用夹具将该装置固定在支架上，并用石蜡密封膜密封所有上游接头。调节旋塞，使加样口关闭，装置与氩气源连通。关闭鼓泡器，使低压（<10 psi）氩气流经反应室5分钟。
      注意：可并行设置多个反应室，以同时对2-4条寡核苷酸进行三磷酸化。但应保留歧管中的一条管线，专门用于向试剂瓶供应氩气。
    3. 重新打开鼓泡器，并在合成柱底部连接一个注射器作为废液注射器。使用废液注射器反复抽吸氩气通过柱体；然后，将注射器重新连接，并将推杆完全推入。
      注意：除非正在加载试剂，旋塞应始终保持加样口关闭、装置与氩气源连通的状态，如图2A所示。同样，废液注射器应始终连接，并用石蜡密封膜密封与合成柱的接头，除非正在主动移除试剂。
  3. 添加试剂或溶剂时：
    1. 将针头连接至干燥氩气源，并插入试剂或溶剂瓶的隔垫中，注意不要将针头浸入瓶内液体中。
    2. 准备一个带针头的干燥注射器，将其插入试剂或溶剂瓶的隔垫中，同样避免浸入液体。先用氩气充满注射器，拔出针头后排出氩气；再次充满氩气并排出；然后在氩气压力下吸入所需体积的溶剂或试剂。
    3. 调节装置上的旋塞，关闭氩气源，打开加样口（图2B）。迅速将装有试剂的注射器和针头从试剂瓶中取出，擦去针头侧面或尖端附着的任何溶剂，将针头插入加样口。将试剂排入装置的前室，拔出针头，关闭加样口，并重新打开装置与氩气源的通路。
    4. 使用废液注射器轻柔地将前室中的液体完全抽吸通过合成柱，使所有液体进入废液注射器。然后缓慢将溶液重新推回合成柱中，确保柱内无气泡。如需混合或搅动，可使用废液注射器轻柔地上下抽吸溶液通过柱体。
      注意：在反应室中移动液体时，始终应缓慢轻柔操作，以确保密封完好，防止空气进入装置。
  4. 从柱中移除试剂或溶剂时：
    1. 缓慢将溶液抽入废液注射器。当大部分溶液进入废液注射器后，继续抽吸氩气，以冲洗柱中残留的溶剂。
    2. 移除废液注射器接头周围的石蜡密封膜，取下注射器并弃去废液。更换为新的干燥注射器，并用石蜡密封膜重新密封接头。

蛋白质纯化实验的色谱柱组装示意图及装置设置。
图 2：三磷酸化装置。 在混合或反应过程中，通过调节三通旋塞（ii），使装置（A）与氩气源（i）连通，并与空气隔绝。试剂通过废液注射器（v）从预室（iii）吸入合成柱（iv）中。通过将所有液体吸入废液注射器（v）并弃去，即可去除试剂。在加载试剂时（B），三通旋塞（ii）与大气相通，使用注射器和针头（vi）将试剂加入预室（iii）中。(C) 装置组装完成并按（A）设置用于试剂混合与反应的照片。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 合成5′-羟基寡核苷酸的柱上三磷酸化

  1. 将 SalPCl 和 TBAP 溶液从 -20 °C 保存条件下取出，使其升至室温后再使用。
  2. 根据步骤 3.3.1–3.3.3，向前室加入 200 µL 吡啶/二氧六环混合溶剂。但在步骤 4.4 之前，不要将溶剂加载到合成柱上。
  3. 使用干燥的金属刮勺将 6–12 mg SalPCl 称量至干燥的 1.5 mL 微离心管中，并通过在微离心管内轻轻抽吸二氧六环溶剂上下混合，使其溶解于 100 µL 二氧六环中。
  4. 将溶解的 SalPCl 加入前室，并按照步骤 3.3 加载至合成柱上。反应 15 分钟，每 5 分钟振荡一次溶液。随后按照步骤 3.4 移除并弃去 SalPCl 溶液。
    注意：SalPCl 以大量过量加入，可清除在准备和加载过程中吸附的任何水分。然而，在步骤 4.5 和 4.6 中引入任何湿气都会影响最终寡核苷酸 5′-三磷酸的产率。
  5. 向前室加入 250 µL TBAP 溶液，并按照步骤 3.3 将其加载至合成柱上。反应 20 分钟，每 5 分钟振荡一次。随后按照步骤 3.4 移除并弃去 TBAP 溶液。
  6. 用 0.5 mL DMF 洗涤柱子，然后用 0.5 mL ACN 洗涤，每次加入后均按照步骤 3.3 和 3.4 移除溶剂。
  7. 向前室加入 250 µL 氧化剂溶液（0.1 M 碘溶于四氢呋喃（THF）/吡啶/水，体积比 88:10:2），并按照步骤 3.3 将其加载至合成柱上。反应 30 分钟，每 10 分钟振荡一次。随后按照步骤 3.4 移除并弃去氧化剂溶液。
  8. 用 0.5 mL ACN 洗涤柱子，并按照步骤 3.3 和 3.4 移除溶剂。
  9. 拆卸反应装置。用 5 mL ACN 洗涤合成柱，并将柱子干燥。

5. 从固相载体上切割、脱保护及纯化

  1. 将干燥的固相树脂从合成柱中取出，转移至带有硅胶O型圈的1.5 mL聚丙烯螺口密封管中。
  2. 将树脂悬浮于 1 mL 氨水（28%-30%）与甲胺水溶液（40%）按 1:1 混合的 AMA 溶液中，密封管体。于 65 °C 轻轻倒置并间歇混匀，持续10分钟39对于长度超过40 nt的寡核苷酸，采用室温下较温和的处理方式，持续2 h。
    警告：加热 AMA 溶液会使管内产生高压。如果管子密封不严或未使用耐氨（硅胶）O 型圈，可能导致气体逸出或溶剂泄漏，从而影响安全性或最终产物的产率。切勿在管内温度高于室温时打开，因为高温的 AMA 溶液可能剧烈释放气体。
  3. 将离心管置于冰上冷却，并短暂离心（6,000-12,000 × g 10秒）。移除树脂上的上清液，使用配备有滤器的注射器过滤 0.2 µm 过滤后转移至新的无菌聚丙烯管中。使用配备氨中和化学捕集装置的真空离心浓缩仪将溶液蒸发至干燥。
    注意：如果合成的寡核苷酸不含带有2′-硅基保护基的RNA核苷酸，则跳至步骤5.8。
  4. 通过将干燥物料溶解于1 mL含1 M四丁基氟化铵（TBAF）的四氢呋喃（THF）溶液中，并加热以去除硅基保护基团 55 °C，必要时轻轻振荡以充分溶解寡核苷酸，并在室温下孵育16–24小时40,41.
  5. 用1 mL 1 M Tris缓冲液（pH 7.5）淬灭TBAF溶液，并使用真空离心浓缩仪除去THF。
  6. 使用一次性尺寸排阻柱，按照制造商说明去除TBAF盐。对于长度短于15 nt的寡核苷酸，通过分步收集洗脱液，并在紫外-可见分光光度计上检测260 nm处的吸光度，以确认目标产物的洗脱峰并鉴定主要产物所在的洗脱组分。
  7. 若RNA寡核苷酸小于15个核苷酸，则通过冻干或真空离心浓缩；若大于15个核苷酸，则通过乙醇沉淀浓缩。
  8. 根据寡核苷酸大小、玻璃板规格和电泳槽型号，按照相应操作步骤配制制备级10%-20%聚丙烯酰胺/8 M尿素/1×TBE凝胶，使用19:1单体:双丙烯酰胺储备液。将凝胶玻璃板安装至电泳槽中，电泳槽内加入1×TBE缓冲液，以35 W（或根据凝胶板规格调整适当功率）预电泳至少30分钟。
  9. 将固态寡核苷酸溶解于尿素凝胶上样缓冲液（8 M 尿素，10% 蔗糖，50 mM Tris，pH 8，1 mM EDTA，含溴酚蓝和二甲苯蓝氰醇电泳指示染料）中，并加热至 80 °C将样品加入聚丙烯酰胺凝胶，于25–35 W（或根据凝胶板规格和寡核苷酸大小适当调整）电泳运行1–2小时。
    注意：如果溴酚蓝或二甲苯蓝腈与产物共迁移，则对于短于15个核苷酸的寡核苷酸，凝胶上样缓冲液中应避免使用这两种染料，因为若无乙醇沉淀步骤，很难从洗脱的寡核苷酸中去除这些染料。
  10. 凝胶电泳完成后，从电泳装置上取下凝胶板，拆开凝胶板，并用聚氯乙烯薄膜包裹凝胶。使用254 nm紫外光背照法识别产物条带，用刀片切下主要产物条带。
  11. 通过压碎和浸泡法从切下的凝胶中提取寡核苷酸42.
    1. 通过塑料注射器挤出或机械方式将切下的凝胶碾碎。
    2. 对于长度超过15 nt的寡核苷酸：
      1. 用洗脱缓冲液（300 mM NaCl；10 mM Tris，pH 8；1 mM EDTA）以3倍柱体积进行洗脱，振荡或摇动至少12小时。
      2. 通过装有针头的注射器过滤溶液，以去除固体凝胶碎片 0.2 µm 通过乙醇沉淀法过滤并浓缩寡核苷酸。
    3. 对于长度短于15个核苷酸的寡核苷酸：
      1. 在无核酸酶水中加入3倍体积的样品，振荡或摇动至少12小时进行洗脱。
      2. 用装有针头的注射器过滤溶液，以去除固体凝胶碎片 0.2 µm 过滤并通过冷冻干燥浓缩。
      3. 使用一次性尺寸排阻柱去除残留盐分和溶质，步骤同5.6。通过冷冻干燥进行浓缩。
  12. 将纯化的三磷酸化寡核苷酸储存于 -20 °C 在TE缓冲液（10 mM Tris，pH 8；1 mM EDTA）或类似的寡核苷酸储存缓冲液中。
    1. 使用紫外-可见分光光度计在260 nm处测量吸光度，以确定寡核苷酸的浓度。
      注意：寡核苷酸的估计消光系数不应受其5′-磷酸化状态的影响，可根据其序列使用寡核苷酸消光系数计算器进行计算。
    2. 通过质谱法验证三磷酸化，检测相对于5′-羟基寡核苷酸预期增加的质量为+239.94 Da。
      注意：使用针对核酸优化的实验方案时，基质辅助激光解吸/电离或电喷雾电离质谱法（MALDI-MS 或 ESI-MS）均可用于鉴定寡核苷酸的三磷酸化状态。然而，由于电喷雾电离质谱法的离子碎裂率较低，其结果更为一致；一种具有代表性的商业服务见于 材料表.

6. 三磷酸化寡核苷酸作为核酶自我复制的底物

警告：32P 是一种放射性同位素，操作以下步骤时，必须由经相关环境健康与安全部门认证可使用放射性物质的研究人员，在实验室中遵循处理放射性材料的标准安全规程进行。作为替代方案，可人工合成带有 5′-荧光素标记的自复制核酶底物 A14，并在第 7.9 步中通过荧光成像检测。

  1. 将自复制核酶 E 与 5′-32P标记的RNA底物A14 至浓度 0.30 µM 和 30 µM分别制备B-转录和B-合成溶液 15 µM 三磷酸化RNA底物B，由制备 体外 转录14 或如上所述，在75 mM EPPS缓冲液（pH 8.5）和37.5 mM MgCl条件下进行化学三磷酸化2将两种溶液均调整至 42 °C.
    注意：所有 RNA 组分均列于下文 材料表.
  2. 为启动自我复制，需快速混合 5 µL 溶液A的 10 µL B转录或B合成溶液，使其终浓度为 0.1 µM E, 10 µM A, 10 µM B，25 mM MgCl2，以及 50 mM EPPS 缓冲液（pH 8.5）。将反应混合物在 42 °C.
  3. 定期取样 0.5 µL 分装并淬灭 9.5 µL 甲酰胺上样缓冲液（95% 甲酰胺；10 mM EDTA，pH 8）
  4. 根据凝胶板和电泳装置的相应操作规程，配制含8 M尿素的1x TBE丙烯酰胺分析凝胶。将制备好的凝胶与凝胶板安装至电泳装置中，向上下储液槽加入1x TBE缓冲液，在40 W（或根据不同凝胶板和电泳装置调整适当功率）条件下预电泳30分钟。
  5. 将淬灭的反应样品加热至 80 °C，加载 5 µL 每个孔中样品的上样量，并以40 W的功率电泳约40分钟（或根据不同的凝胶板和电泳槽调整至适当时间）。
  6. 从凝胶支架上取下凝胶板，拆卸后用聚氯乙烯薄膜包裹凝胶。将磷屏覆盖在凝胶上，曝光1小时（或根据实际情况调整曝光时间） 32P cpm）；使用荧光/磷光凝胶扫描仪扫描屏幕。
  7. 使用凝胶图像定量软件量化反应产物的产量。
    1. 使用软件打开凝胶图像 分析工具箱，选择 分析 | 形态定义，选择 区域 | 矩形形状，并为每个时间点及两个反应中对应未反应的A和产物E的条带绘制相同大小的矩形。
    2. 选择 分析 | 背景扣除，选择 区域 | 矩形形状，并在凝胶图像的空白区域绘制一个相同大小的矩形。将所有矩形的背景扣除方法更改为 图像矩形.
    3. 选择 窗口 | 双区域窗口，然后 编辑 | 导出至 Excel 将定量的条带像素体积导出至电子表格文件。
  8. 绘制产物 E 的浓度随时间变化曲线，并将数据拟合至逻辑斯蒂增长方程（Eq1）使用统计数据分析软件：
    [E] = 生长曲线模型方程；a/(1+b∙e^(-ct))，用于生长速率分析。 (1)
    其中，a 为反应的最大程度，b 为S形曲线的陡峭程度，c 为指数增长速率。
    1. 在导出的电子表格中，将产物 E 的体积除以底物 A 与产物 E 体积之和，以计算每种反应在各个时间点的产物分数产率。再乘以底物 A 的初始浓度（10 µM) 以确定产物E的产率随时间的变化。
    2. 在统计数据分析拟合软件中，选择 文件 | 新建 | 新建项目文件，选择 XY 在……下方 新表格 & 图表，然后单击 创建输入两个反应的反应时间及产物E的产率至相邻列中，并相应地标注各列（例如，“时间”、“转录的B”、“合成的B”）。
    3. 选择 插入 | 新建分析，选择 XY 分析 | 非线性回归（曲线拟合） 然后点击 好的选择 生长曲线 | 逻辑斯蒂增长 并点击 好的；不要调整其他参数。在下方观察拟合参数及其置信区间 结果 数据点与拟合曲线的图示 图表.

7. 手性交叉复制 L-RNA

  1. 准备 10 µL 含有RNA溶液的 20 µM D-RNA 27.3t 跨手性聚合酶 2 µM 5′-荧光素标记的L-RNA引物， 4 µM 生物素标记的L-RNA锤头状模板，以及 20 µM L-RNA pppCUG、pppAUG、pppAGG 和 pppCGC 各组分 10 µL 50 mM Tris（pH 8.3）中，通过加热使RNA退火 90 °C 1 分钟，然后冷却至 23 °C 在 0.2 °C/s，在PCR扩增仪中进行。参见 材料表 有关聚合酶、引物和模板的详细信息。
  2. 将RNA溶液孵育于 17 °C 并加入以启动反应 10 µL 2×起始缓冲液（400 mM MgCl₂）2，500 mM NaCl 和 50 mM Tris（pH 8.3）。确保反应中所有组分的终浓度为 10 µM 聚合酶， 1 µM 引物， 2 µM 模板， 10 µM 每种三核苷酸5′-三磷酸，200 mM MgCl₂2，250 mM NaCl 和 50 mM Tris，pH 8.3。
  3. 随着反应的进行，取 10 µL 分装并淬灭 5 µL 0.5 M EDTA，pH 8
  4. 向每个淬灭反应样品中加入0.1 mg链霉亲和素包被的磁珠（20 pmol生物素-寡核苷酸结合容量），悬浮于 10 µL 含0.05%中性去垢剂的TE缓冲液中的1 M NaCl，用于捕获三聚体延伸引物 通过 生物素标记的模板，并在室温下振荡孵育30分钟。
  5. 将珠子置于磁力架上捕获，移除并弃去上清液，然后加入 50 µL 加入洗涤液（含0.05%中性去污剂的TE缓冲液配制的250 mM NaCl溶液）。混匀磁珠，再次捕获磁珠并移除洗涤液。重复此步骤一次。
  6. 从磁珠中洗脱延伸引物，加入 50 µL 加入洗脱液（25 mM NaOH，含0.05%中性去垢剂），混匀珠子。重新捕获珠子，移除洗脱液，用100 mM Tris（pH 7.5）淬灭，并用乙醇沉淀。
  7. 根据凝胶板和电泳槽的相应操作规程，配制含8 M尿素的1x TBE聚丙烯酰胺分析胶。将制备好的凝胶连同凝胶板安装至电泳槽中，向上下储液槽加入1x TBE电泳缓冲液，在40 W（或根据不同凝胶板和电泳槽调整适当功率）下预电泳30分钟。
  8. 将沉淀的RNA溶解在 10 µL 甲酰胺凝胶上样缓冲液，并制备未反应的末端标记引物 0.5 µM 在甲酰胺凝胶上样缓冲液中。将样品加热至 80 °C，加载 5 µL 每个孔中样品的上样量，并以40 W的功率电泳约40分钟（或根据不同的凝胶板和电泳槽调整至适当时间）。
  9. 从支架上取下凝胶板，使用荧光/磷光凝胶扫描仪扫描以观察交叉手性L-RNA延伸产物。

结果

应使用适合磷酸亚胺键和自动化DNA/RNA合成仪的标准方案合成寡核苷酸，使产物寡核苷酸仍连接在原始塑料合成柱中的固相载体上，并去除5ʹ端二甲氧基三苯甲基以获得游离的5ʹ-羟基（第1节）。本实验中使用的所有寡核苷酸均以1,000 Å控制孔径玻璃（CPG）树脂作为固相载体，并在0.2或1 µmole规模下进行合成。合成仪柱、树脂、试剂和磷酸亚胺单体的代表性示例如材料表所示。对于更大规模的反应，后续步骤中使用的体积和时间可能需要相应调整。

三磷酸化反应在定制的反应室中进行，该反应室为柱上结构（图2，第3节）使用所列的标准化市售组件 材料表 并遵循图示方案 图1 （第4节）28在整个三磷酸化过程中必须严格保持无水条件，所有溶剂和试剂均需预先用分子筛处理，并在使用前充分干燥（第2节）。三磷酸化反应通常需要2小时完成，随后，经洗涤和干燥的柱子可按照标准的寡核苷酸脱保护与纯化程序进行处理（第5节）。

脱保护后，寡核苷酸三磷酸通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行纯化，在紫外背影显影下可见单一主产物条带，可将其切下并从凝胶中洗脱。对于短链寡核苷酸，5′-三磷酸产物可有效分离于反应副产物之外，如DNA三核苷酸5ʹ-三磷酸pppAAA和pppCCC以及L-RNA三核苷酸5ʹ-三磷酸pppGAA所示（图3A、B）。AAA和CCC DNA三聚体的5′-羟基和5′-三磷酸产物均被切下，并通过质谱鉴定，在图3A中相应标注。额外出现的条带（如AAA DNA三聚体中可见）通常所含物质不足以回收和鉴定。然而，这些条带的存在与未纯化反应产物中的额外产物质荷比相关（图3C），通常代表5′-二磷酸、单磷酸以及H-亚磷酸副产物，如下文所述。

PAGE 纯化后，可使用碾碎浸泡法洗脱较大的寡核苷酸42 以及后续的乙醇沉淀。然而，少于15个核苷酸的寡核苷酸无法有效进行乙醇沉淀，因此需要采用改良的凝胶洗脱程序（步骤5.11.3）。所列的一次性凝胶过滤层析柱在 材料表 仅适用于长度超过10个核苷酸的寡核苷酸。然而，我们发现，短至三聚体的寡核苷酸也可根据生产商推荐的方案有效进行脱盐。尽管如此，在脱盐较短的寡核苷酸时（如步骤5.6和5.11.3中所述），建议将层析柱洗脱液分段收集，并使用紫外-可见分光光度计在260 nm处通过吸光度鉴定产物组分。一种针对较短寡核苷酸优化的凝胶过滤层析柱包含在该试剂盒中 材料表 作为替代选择。最终产量来自 1 µmole 纯化后寡核苷酸合成的常规规模为 50–300 nmol。

可通过质谱法确认三磷酸化，其中三磷酸化产物的质荷比比5′-羟基寡核苷酸大+239.94 Da，但通常也会观察到对应于5′-二磷酸和单磷酸的物质（分别为+159.96 和 +79.98 Da）。还可能观察到一种5′-H-亚磷酸酯副产物，其质量比5′-OH寡核苷酸大+63.98 Da；该副产物含量较高表明三磷酸化反应过程中条件不够无水。在纯化前，脱保护的寡核苷酸通常会显示上述所有产物（图3C），而纯化后的样品则主要显示对应于5′-三磷酸产物的峰，同时伴有5′-二磷酸和单磷酸峰（图3D、E）。

仅使用质谱法通常无法准确测定5′-三磷酸的纯度，因为在电离过程中三磷酸基团的电离和碎裂速率存在差异。为测定最终产物的纯度，建议采用反相液相色谱串联电喷雾质谱法（RP-LC/ESI-MS），特别是对于较长的寡核苷酸。对D-RNA 5ʹ-三磷酸pppACGAGG和pppGAGACCGCAACUUA进行RP-LC/ESI-MS分析（分别为图4A、B）显示典型的最终产物纯度，其中含有20%的5ʹ-二磷酸杂质，因为当这两种物质存在于较长的寡核苷酸上时难以完全分离。

合成的5′-三磷酸寡核苷酸在生化研究中通常表现出与酶法制备材料相当甚至更优的性能。在第6部分中，以14个核苷酸的5′-三磷酸RNA底物为例，该底物可通过化学合成或酶法两种方式制备 体外 在RNA催化的自我复制反应中对转录进行了比较14,15,43,44,45核酶E催化底物A与B的连接，生成E的新拷贝，该自催化反应能够实现指数级增长。图5A）。E 和 32P标记的A组分通过以下方法制备： 体外 转录，且三磷酸化底物B是通过上述方法合成制备，或通过 体外 转录14通过定期取样并采用变性PAGE分析及定量，监测自复制反应的进程 通过 荧光/磷光凝胶扫描仪。将所得数据拟合至逻辑生长函数后显示，无论是转录的还是合成的B底物均能支持指数级增长，但合成B产生的产物略多图5B）。该结果可能反映了通过体外转录方法制备的RNA 5′端存在组成上的异质性 体外 转录23,24.

化学三磷酸化还能够合成那些无法通过生物学方法制备的寡核苷酸三磷酸酯 体外 或在细胞中。在第7部分中，使用了由L-RNA（天然D-RNA的对映体）组成的非生物性寡核苷三磷酸，这些底物按照第1–5部分的方法制备，用于D-RNA“交叉手性”聚合酶核酶27.3t（图6A），可催化短链L-RNA寡核苷酸5′-三磷酸在无特定序列依赖性的条件下，以模板指导的方式聚合生成更长的L-RNA产物。例如，该核酶能够合成L-RNA形式的锤头状自切割结构基序（图6B)18纯化的L-RNA三核苷三磷酸与荧光素标记的L-RNA引物和L-RNA模板混合（图6C）并与交叉手性连接酶反应。在反应过程中采集样品，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析，并使用荧光/磷光凝胶成像仪成像，以证明以模板编码的L-RNA型锤头状核酶的合成图 6D).

电泳结果、质谱数据、蛋白质分析、强度与质量关系图。
图 3：三核苷酸5ʹ-三磷酸盐的纯化。（A）DNA三核苷酸三-脱氧腺苷（AAA，蓝色）和三-脱氧胞苷（CCC，红色）的三磷酸化反应产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析（通过紫外背影显影观察），故意过载以观察少量副产物。5ʹ-三磷酸产物（ppp）和5ʹ-羟基（OH）起始原料均被切下，并通过基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）鉴定。（B）L-RNA三核苷酸GAA的三磷酸化产物的制备型PAGE，主产物条带被切下，并通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）鉴定为5ʹ-三磷酸（ppp）。（C）去保护后粗反应产物的MALDI-MS图谱，以及（D）来自（A）的纯化产物。图中标注了5ʹ-三磷酸（ppp；pppAAA理论值1,119 Da，实测值1,118 Da；pppCCC理论值1,047 Da，实测值1,046 Da）、5ʹ-二磷酸（pp）、5ʹ-单磷酸（p）、5ʹ-羟基（OH）和5ʹ-H-磷酸酯（Hp）。（E）来自（B）的分离5ʹ-三磷酸产物直接进样电喷雾电离质谱（ESI-MS）的去卷积质谱图，峰已标注（理论值1,181.6 Da，实测值1,181.0 Da）。同时检测到5ʹ-二磷酸（pp）产物，以及三磷酸和二磷酸产物的钠离子峰（+22 Da）。常见污染物峰以星号标注。为便于比较，各质谱图均归一化至各自谱图中的最高强度，并以该值的百分比表示。缩写：PAGE = 聚丙烯酰胺凝胶电泳；MALDI-MS = 基质辅助激光解吸/电离质谱；ESI-MS = 电喷雾电离质谱。请点击此处查看该图的放大版本。

显示 pp、ppp 化合物分析中峰强度与保留时间关系的色谱图。
图 4：6 nt 和 14 nt D-RNA 寡核苷酸三磷酸的分析型反相液相色谱（RP-LC）。 （A）5ʹ-pppACGAGG-3ʹ 和 （B）5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ。串联电喷雾电离质谱（ESI-MS）鉴定出两个样品中的主峰（约 70%）为 5ʹ-三磷酸（ppp），另有少量 5ʹ-二磷酸（pp）。缩写：RP-LC = 反相液相色谱；nt = 核苷酸；ESI-MS = 电喷雾电离质谱。 请点击此处查看该图的放大版本。

RNA二级结构图与动力学分析用浓度-时间曲线图
图5：化学合成与酶法合成寡核苷酸5ʹ-三磷酸底物的比较 体外 转录 (A自复制核酶 E 连接 RNA A 与 5′-三磷酸化 RNA B。B) 使用自复制反应的比较 10 µM A 和 10 µM B，无论是合成的（空心圆圈）还是 体外 转录的（实心圆）。(B数据拟合至逻辑生长方程：[E] = a / (1 + be-ct），其中 a 为最终产量，b 为S形曲线的弯曲程度，c 为指数生长速率。两种反应的生长速率相同，均为 1.14 h-1，而使用合成 B 的反应最终程度高出 10%。 请点击此处以查看此图的放大版本。

RNA二级结构、转录过程示意图以及实验设置中的电泳结果。
图6：核酶介导的跨手性L-RNA聚合反应。 （A）D-RNA 27.3t聚合酶核酶，可催化依赖模板的L-RNA连接反应。（B）由27.3t合成的L-RNA产物构成锤头状内切酶结构的一部分。（C）27.3t利用生物素标记的L-RNA模板（棕色）、末端标记的L-RNA引物（品红色）以及四种化学合成的L-RNA三核苷三磷酸（青色）催化L-RNA聚合反应。（D）在4小时和24小时后对（B）中延伸产物进行的PAGE分析，显示每次三核苷酸的逐步加入直至全长产物（黑点）。未反应的L-RNA引物作为参照标记。缩写：PAGE = 聚丙烯酰胺凝胶电泳；M = 参照标记。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

此处描述的三磷酸化方法广泛适用于采用标准亚磷酰胺化学法的寡核苷酸合成。核苷亚磷酰胺单体应带有碱不稳定的保护基团，这些保护基团需能与AMA39中的快速脱保护相兼容，包括亚磷酸基团上的标准β-氰乙基，以及核碱基环外氨基上的异丁酰基、二甲基甲酰胺基、乙酰基、苯氧乙酰基或4-异丙基苯氧乙酰基。核糖2'-羟基应由硅基保护基团保护，如t-丁基二甲基硅基（TBDMS）或三异丙基硅氧甲基（TOM）40,41。据报道，碱不稳定的匹伐酰氧甲基（PivOM）保护基也与化学三磷酸化反应相兼容30。

已报道多种用于合成寡核苷酸化学三磷酸化的方法28,29,30,31,32,33,34,35我们使用Ludwig-Eckstein试剂发现了三磷酸化现象37 是最易实施的方法之一，无需特殊试剂合成，也无需专用设备。通过该方法制备的寡核苷酸5′-三磷酸盐已被常规用作RNA连接酶核酶的底物，包括使用酶法难以获得的L型RNA寡核苷酸三磷酸盐，以实现该类分子的模板依赖性合成与复制 "镜像" 核酸14,16,17,18该方法也适用于制备小的5′-三磷酸化茎环RNA，这类RNA是脊椎动物先天免疫反应的有效激活剂6,7.

Ludwig-Eckstein试剂，即亚磷酰氯水杨酸酯37，对水具有高度反应性，在将该试剂溶解并加载到寡核苷酸柱之前，可有效清除引入的任何水分。然而在此之后，5′-亚磷酰化的寡核苷酸将优先与体系中引入的水反应，而不是与焦磷酸反应，后处理后会生成5′-H-亚磷酰酸酯副产物28,37,38。通过仔细制备三磷酸化试剂和三磷酸化反应腔室，可确保不产生该副产物。对于溶剂干燥，4 Å分子筛通常由大多数寡核苷酸合成试剂公司以特氟龙袋预包装形式出售，在多种品牌下均适用于大多数有机溶剂。通常无需采取额外预防措施，例如在无水气氛的手套箱中进行三磷酸化反应。

5′-磷酸化的寡核苷酸与TBAP反应生成环状5′-三磷酸亚磷酸中间体，随后使用寡核苷酸合成氧化液（碘/水/吡啶/四氢呋喃）将其氧化为环状5′-三磷酸。需要注意的是，市售氧化液中碘的含量各不相同，必须使用高浓度（0.1 M）的碘溶液，以确保完全氧化为三磷酸。该环状产物在同一溶液中水解生成最终的线性5′-三磷酸37；若希望使用除水以外的其他亲核试剂实现开环，则必须采用无水氧化体系（见下文应用部分）33。然而，任何残留的环状三磷酸亚磷酸盐在后续寡核苷酸的碱性去保护过程中也会被线性化。环状5′-三磷酸亚磷酸盐的水解仅生成线性而非支链的三磷酸产物37,46。

寡核苷酸脱保护通常无需针对5′-三磷酸化进行修改，但应采取一些预防措施。三磷酸基团对短时间的碱性条件相对稳定，但应避免将其暴露于AMA中的时间超过必要时长。应避免使用那些需要在65 °C下于氨水或AMA中处理超过10分钟才能去除的保护基团。当与其他磷酰胺保护基团相容时，较为温和的处理方式（例如室温下在氨水中处理2小时）是可以接受的。一种常见的快速脱保护方法用于硅基保护的合成RNA寡核苷酸，该方法使用三乙胺三氢氟化物并结合高温处理47；然而，在制备RNA 5′-三磷酸时应避免使用此法，因为长时间的酸性条件会加速三磷酸的水解31,32。

制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）已被证明是脱保护后纯化5′-三磷酸化寡核苷酸最简单且最可靠的方法（图3 和 图4）。然而，也可使用制备型反相高效液相色谱法（HPLC）纯化三磷酸化产物。在通过质谱验证三磷酸化时，通常会观察到5′-二磷酸以及少量5′-单磷酸副产物的存在。我们发现，在化学合成或转录法制备的高纯度样品中，尤其是在仪器未针对寡核苷酸分析进行优化的情况下，质谱检测过程中常发生5′-三磷酸基团的断裂。尽管如此，反相液相色谱（RP-LC）分析通常显示，在较长的5′-三磷酸化寡核苷酸中，约有10%–20%的5′-二磷酸副产物存在（图4）。市售的四丁基铵焦磷酸盐（tributylammonium pyrophosphate）可能被高达20%的单磷酸盐污染，这将在三磷酸化反应中产生5′-二磷酸作为副产物30,31。在实验室中仔细制备该试剂可获得纯度更高的TBAP储备液31。然而，我们发现，使用市售TBAP进行三磷酸化的寡核苷酸在作为底物参与酶促反应时，其反应活性仍与体外转录（in vitro transcription）制备的材料相当甚至更高（图5B）。

利用Ludwig-Eckstein试剂对寡核苷酸进行三磷酸化的另一个重要应用，是基于其生成的环状三偏亚磷酸中间体33。若后续氧化步骤采用1 M t-丁基过氧化物的己烷溶液进行——该条件常用于无水环境下的寡核苷酸氧化——则亚磷酸基团的氧化可在不发生环打开水解的情况下进行，从而生成环状三偏磷酸酯中间体。该中间体可进一步与伯胺或醇类亲核试剂反应，生成在γ-磷酸基团上带有修饰的5′-三磷酸化产物。这些修饰包括通过磷酰胺酯键连接疏水性标签，从而实现通过反相液相色谱（RP-LC）对三磷酸化产物进行快速特异性纯化，随后通过酸性水解将标签从三磷酸基团上切除33。此外，也可在γ-磷酸位置引入荧光修饰，用于核酶催化的连接反应的实时荧光检测15,33。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 Greg Springsteen、Natasha Paul、Charles Olea, Jr.、Jonathan Sczepanski 和 Katrina Tjhung 就化学三磷酸化反应最佳实践提供的有益讨论，并感谢 Gerald Joyce 提出的宝贵意见。本工作由美国国家科学基金会资助，项目编号为 MCB 2114588。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 聚醚砜注射器滤器MilliporeSigmaSLMP025SS用于去除破碎的聚丙烯酰胺凝胶颗粒的注射器滤器（第5节）
0.22 µm PTFE 注射器滤器MilliporeSigmaSLLG013SL用于去除CPG树脂的注射器滤器（第5节）
1 mL 塑料注射器赛默飞世尔科技14-823-434（BD 309659）三磷酸化装置的组成部分（第2节）–4)
1,4-二噁烷，无水MilliporeSigma296309三磷酸化溶剂（第2节）–4)
2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮，水杨酸亚磷酸氯（SalPCl）MilliporeSigma324124三磷酸化试剂（第2节–4)
30 mL 玻璃瓶MilliporeSigma23232用于配制三磷酸化溶剂和TBAP溶液的瓶子（第2节）
三通旋塞阀，聚碳酸酯/聚丙烯材质伯乐生命科学公司7328103三磷酸化装置的组成部分（第2节）–4)
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，19:1伯乐生命医学产品（上海）有限公司1610144用于PAGE（第5节）–7)
乙腈，无水，100 mL格伦研究公司40-4050-50三磷酸化溶剂（第2节）–4)
氨中和捕集器赛默飞世尔科技ANT100 和 ANS121与 Speedvac DNA130 配合使用（第 5 节）
过硫酸铵（APS）伯乐生命科学公司1610700用于PAGE的丙烯酰胺聚合催化剂（第5节–7)
氨水，28%MilliporeSigma338818用于制备AMA去保护试剂（第5节）
40% 水合甲胺TCI AmericaTCI-M0137用于制备 AMA 去保护试剂（第 5 节）
自动化DNA/RNA寡核苷酸合成仪PerSeptive BiosystemsExpedite 8909 DNA/RNA合成仪任何基于柱的合成仪均可接受（第1节）
磁珠捕获磁铁赛默飞世尔科技12320D用于链霉亲和素磁珠捕获（第7节）
溴酚蓝伯乐生命科学公司1610404用于PAGE尿素上样缓冲液（第5节）
深真空油泵赛默飞世尔科技VLP200-115用于冻干机（第5节）
Drierite 干燥剂，10-20 目MilliporeSigma737828用于储存三磷酸化化学品和设备的干燥剂（第1节）–2)
D-RNA 27.3t 跨手性聚合酶自行制备185′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′用于手性交叉核酶反应（第7节）
D-RNA CPG 固相载体，1,000Å，预包装 1 µ摩尔合成柱Glen Research20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E代表性，用于D-RNA寡核苷酸合成（第1节）
D-RNA TOM保护的亚磷酰胺ChemGenesANP-3201, 3202, 3203, 3205代表性，用于D-RNA寡核苷酸合成（第1节）
空的快速合成柱，1µmGlen Research20-0021-01用于Expedite DNA/RNA合成仪的合成柱（第1节）
EPPS，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙烷磺酸)，固体MilliporeSigmaE1894核酶反应缓冲液组分（第6节）
乙二胺四乙酸（EDTA），固体MilliporeSigmaEDS用于各种缓冲液的二价金属离子螯合剂（第5节）–7)
用于加速合成柱的滤器Glen Research20-0021-0FExpedite型合成柱过滤器，用于空合成柱（第1节）
荧光/磷光凝胶扫描仪CytivaAmersham Typhoon RGB，29187193用于可视化分析性PAGE（第6节）–7)
甲酰胺，去离子VWR生命科学97062用于PAGE甲酰胺凝胶上样缓冲液（第6节–7)
凝胶图像定量分析软件CytivaImageQuant TL用于定量分析扫描的凝胶图像（第6节）
玻璃干燥器MilliporeSigmaCLS3121150三磷酸化溶剂储存（第2节）
L-RNA CPG 固相载体，1,000Å，大量ChemGenesN-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10L-型RNA寡核苷酸合成（第1节）
L-RNA 锤头状模板自行制备185′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′用于交叉手性核酶反应（第7节）
L-RNA 引物自行制备185′-fluorescein-GGCUCGA-3′用于交叉手性核酶反应（第7节）
L-RNA TOM保护的亚磷酰胺ChemGenesOP ANP-5201, 5202, 5203, 5205L-型RNA寡核苷酸合成（第1节）
冻干机/冷冻干燥器VirTis台式K用于寡核苷酸的浓缩（第5节）
六水合氯化镁，固体MilliporeSigmaM2670核酶反应（第6节）–7)
N,N-二甲基甲酰胺，无水MilliporeSigma227056三磷酸化溶剂（第 2 节）
NAP-25 脱盐柱（Sephadex G-25 树脂）赛默飞世尔科技45000150一次性重力流凝胶过滤层析柱，内含 Sephadex G-25 树脂（第 5 节）
非穿刺型不锈钢针头，20 G赛默飞世尔科技14-815-410用于穿刺橡胶隔垫的针头（第2节）–4)
寡核苷酸消光系数计算器Integrated DNA Technologies寡核苷酸分析工具最近邻模型短寡核苷酸260 nm消光系数计算器（第5节）
氧化剂溶液，0.1 M 碘/四氢呋喃/吡啶/水ChemGenesRN-1456三磷酸化试剂（第 4 节）
PAGE 胶板Timberrock/CBSNGP-250-BO 和 NO用于PAGE（第5节–7)
PAGE 电源供应器伯乐生命科学公司PowerPac HV 1645056用于PAGE（第5节–7)
PAGE 垫片和梳子（分析型）Timberrock/CBSVGS-0725 和 VGC-0714用于PAGE（第6节）–7)
PAGE 垫片和梳子（制备型）Timberrock/CBSVGS-3025R 和 VGC-3001用于PAGE（第5节）
PAGE 凝胶支架Timberrock/CBSASG-250用于PAGE（第5节–7)
Parafilm M赛默飞世尔科技13-374-12（Bemis PM999）三磷酸化装置用石蜡密封膜（第2节）–4)
PCR扩增仪伯乐生命科学公司C1000 Touch 梯度PCR仪用于交叉手性核酶反应（第7节）
PD-10 脱盐柱（Sephadex G-10 树脂）MilliporeSigmaGE17-0010-01一次性重力流凝胶过滤层析柱（含 Sephadex G-10 树脂），用于寡核苷酸分离 < 15 nt（第5节）
磷光屏Cytiva28956480用于可视化 32P标记的RNA（第6节）
亚磷酰胺合成试剂Glen Research30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62代表性，用于标准 RNA/DNA 合成（第 1 节）
聚丙烯螺口密封管MilliporeSigmaBR780752带螺口盖和硅胶O型圈的1.5 mL微量离心管，用于安全的AMA去保护反应（第5节）
吡啶，无水MilliporeSigma270970三磷酸化溶剂（第2节）
反相液相色谱/电喷雾电离质谱法（RP-LC/ESI-MS）Novatian/a专注于寡核苷酸的液相色谱/质谱商业服务（第5节）
橡胶隔垫（内径 × 外径 7.9 mm × 14 mm），白色MilliporeSigmaZ564702用于制备三磷酸化溶剂和TBAP的隔膜（第2节）
自我复制核酶 E自行制备145′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′用于自复制核酶反应（第6节）
自复制底物A自行制备145′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH用于自复制核酶反应（第6节）
自复制底物 B，转录产物自行制备145′-pppGAGACCGCAACTTA-3′用于自复制核酶反应（第6节）
小型干燥陷阱，4 个 Å 分子筛ChemGenesDMT-1975用于DNA/RNA合成仪的亚磷酰胺和三磷酸化试剂的干燥捕集阱（第1节）–2)
氯化钠（NaCl），固体MilliporeSigmaS7653用于各种缓冲液的盐（第5节）–7)
氢氧化钠（NaOH），固体MilliporeSigmaS8045用于各种缓冲液的盐（第5节）–7)
统计数据分析拟合软件GraphPadPrism用于将分析型PAGE数据拟合至动力学模型（第6节）
链霉亲和素包被的磁珠赛默飞世尔科技65002用于捕获交叉手性核酶反应中的生物素标记RNA（第7节）
蔗糖MilliporeSigma84097用于PAGE尿素上样缓冲液（第5节）
TBE 电泳缓冲液，10 倍浓缩液赛默飞世尔科技AAJ62788K3用于PAGE（第5节–7)
四丁基氟化铵，1.0 M 四氢呋喃溶液Aldrich216143用于去除2′硅基保护基团（第5节）
四甲基乙二胺（TEMED）伯乐生命科学公司1610801用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的丙烯酰胺聚合（第5节）–7)
三丁胺MilliporeSigma90781三磷酸化试剂（第 2 节）
四磷酸二丁基铵（TBAP）MilliporeSigmaP8533三磷酸化试剂（第 2 节）
Tris 碱MilliporeSigmaT6666用于多种缓冲液的缓冲剂（第5节）–7)
TWEEN20 吐温-20 去垢剂MilliporeSigmaP7949用于磁珠的中性洗涤剂（第 7 节）
尿素MilliporeSigmaU5378用于PAGE和上样缓冲液（第5节–7)
紫外-可见分光光度计赛默飞世尔科技NanoDrop 2000, ND2000用于测量寡核苷酸浓度（第5节）
真空离心机赛默飞世尔科技Savant Speedvac DNA130-115 真空浓缩仪用于去除AMA和THF（第5节）
二甲苯青伯乐生命科学公司1610423用于PAGE尿素上样缓冲液（第5节）

参考文献

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