用于血管研究中功能成像的多光谱光声断层扫描技术

摘要

本方案描述了多光谱光声成像的获取方法 体内 人类皮肤血管系统。其中包括血红蛋白和黑色素的定量分析，这两种物质被视为功能分析中感兴趣的发色团。

摘要

微循环功能障碍已在多种疾病过程中被认识，这也推动了血管研究领域内这一主题的日益发展。近年来，活体成像系统的开发在基础与临床研究中引领了（分析技术）的进步方向，其目标是创建能够提供具有临床意义和应用价值的实时、可量化终点的新仪器。目前已有近红外光谱（NIRS）、正电子发射断层扫描（PET）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）等多种技术可供使用，但成本高、图像分辨率有限以及对比度不足仍是公认的技术挑战。光声断层成像（OT）为血管功能成像提供了新的视角，它结合了先进的光学吸收特性与空间分辨能力（从微米级光学分辨率到毫米级声学分辨率），并具备一定的组织穿透深度。在本研究中，我们评估了多光谱光声断层成像（MSOT）在功能成像中的适用性。该系统采用由Nd:YAG激光器泵浦的可调谐光学参量振荡器（OPO），提供激发脉冲，并通过三维探头在680 nm至980 nm波长范围内进行检测。通过基于特定生色团响应的专用算法（由制造商软件提供）对采集的人体前臂图像进行重建。该系统可用于测量最大氧合血红蛋白（Max HbO₂）、最大脱氧血红蛋白（Max Hb）、总血红蛋白（HbT）、平均氧饱和度（mSO₂）、血管密度（µVu）、单位间平均距离（ζAd）以及毛细血管血容量（mm³）。本OT系统展现出良好的应用潜力。随着软件的持续开发，该成像系统的实用性必将进一步提升。

引言

心血管疾病长期位居全球死亡原因的前列，给任何卫生系统都带来了巨大负担^1,2。技术进步极大地推动了我们对心脏和血管基本病理生理机制的理解，提供了更精确的诊断工具，实现了疾病的早期检测和更有效的管理。成像技术不仅能够评估心脏和主要血管的功能，还能在更微观的层面量化毛细血管密度、局部灌注和容积，以及内皮功能障碍等特征。这些技术首次为血管生物学提供了具有直接临床应用价值的定量研究视角。毛细血管密度的变化、局部灌注减少或闭塞通常提示缺血状态，这也解释了成像技术日益重要的作用，使其成为心血管研究与临床实践中不可或缺的工具^3,4,5。

近年来，功能成像技术在技术创新方面持续引领发展，其中超声（US）、近红外光谱（NIRS）、正电子发射断层扫描（PET）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）是一些广为人知的代表。然而，多种因素限制了这些技术的应用，包括成本、患者安全性（以及舒适性）、图像对比度和分辨率^6,7。光声断层成像（OT）最近成为基于光学的血管研究的一个新方向。该技术基于检测组织在受到超短激光脉冲作用后因热弹性膨胀而产生的超声波，这一原理已为人所知一段时间^6,8。这种热量产生与组织膨胀的物理反应会激发出声信号，并由超声换能器检测。利用从可见光到近红外波段的光脉冲，以及不存在声学背景信号的特点，有助于提高成像的分辨率和深度。所检测到的对比度主要来源于组织中最重要的生色团（如血红蛋白或黑色素）。与其他技术相比，OT具有以下优势：（1）无需外源性造影剂（可实现无标记成像）；（2）相比超声成像，具有更高的对比度和分辨率，且伪影更少；（3）成本更低，数据采集速度更快，操作更简便^6,9,10,11。

多光谱光声断层成像（MSOT）属于最新一代的光声成像设备。该系统采用由Nd:YAG激光器泵浦的可调谐光学参量振荡器（OPO），提供激发脉冲，并在680 nm至980 nm波长范围内以高达50 Hz的重复频率发射高频超声激发脉冲，通过时间分辨信号采集三维图像¹²。该光声成像平台可对不同生色团进行深度量化（最深可达15 mm）。氧合血红蛋白（HbO₂）、脱氧血红蛋白（Hb）和黑色素等变量易于获取。其他感兴趣的变量，如最大氧合血红蛋白（Max HbO₂）和最大脱氧血红蛋白（Max Hb），也可获得。制造商软件中的重建算法可进一步计算血管密度（µVu）、单元间平均距离（ζAd）和毛细血管体积（mm³）等参数。

本研究探讨了该新系统的关键操作特性，以更好地理解其在心血管临床前研究中的实际应用和潜在用途。 

方案

实验方案此前已获得该校健康科学学院伦理委员会批准（EC.ECTS/P10.21）。操作过程严格遵守针对人体研究制定的良好临床实践原则¹³。从大学社区中选取了六名健康的志愿者作为便利样本，男女各三名（n = 3 每性别），平均年龄为 32.8 ± 11.9 岁。入选参与者需为血压正常、非吸烟者，且未服用任何药物或营养补充剂。同时记录了参与者的血压、心率和体重指数。所有参与者在研究开始前均被告知研究目的和持续时间，并签署了知情同意书。

注意：本研究使用 MSOTAcuity（见材料表）进行，下文简称为光声成像平台。

1. 采集前准备

注意：在以下实验描述中，屏幕命令以粗体显示。

1. 加载受试者信息：打开光声成像设备。在设备预热的同时，输入受试者信息。软件的主欢迎界面将显示在扫描概览页面。点击患者ID后输入数据（包括姓名、研究名称、个人资料以及任何相关观察记录），然后按选择完成操作。
2. 预设选择：确保设备屏幕上出现激光已就绪的提示信息。预热完成后，设备屏幕上的激光状态栏必须从激光待机变为激光已就绪。本实验方案的预设适用于血红蛋白（Hb）、氧合血红蛋白（HbO₂）和黑色素。选择正确的预设后，系统将自动测试激光功率。
3. 此时，请确保屏幕上出现提示，提醒房间内的每位参与者佩戴激光防护眼镜。踩下激光（电源）开关脚踏板，等待激光功率自检。数秒后，将弹出一个显示当前激光状态及检查报告的窗口。点击窗口中可用的确定按钮关闭该窗口。
   注意：光声成像平台采用的是Nd:YAG激光器，属于4类激光，对人眼具有高度危险性。因此，必须谨慎操作该激光器。
   ​警告：在未确保所有安全程序（包括适当的护目措施）均已到位之前，不得进行任何数据采集操作。

2. 定位与图像采集

1. 让受试者适应实验室环境（21 °C ± 1 °C；相对湿度40%-60%），选择一个舒适的体位以尽量减少不必要的移动。确保待扫描区域已预先清洁。
   注：建议按照制造商的推荐，使用70%乙醇/水溶液清洁待成像区域。此外，为获得最佳图像采集效果，建议去除毛发（如适用）。
2. 探头固定与图像稳定
   1. 在3D杯上涂抹一层薄的超声耦合剂。图像稳定需要将3D杯保持在理想的成像位置。为感兴趣区域安装并固定可锁定的支撑臂。本研究中使用的支撑臂为自制设计，采用铝型材组件（图1）。
   2. 将3D杯放置于感兴趣区域后，部分锁定稳定臂，以进行图像采集。
      注：超声耦合剂的质量及其均匀涂抹至关重要；气泡的存在可能影响图像清晰度。
3. 在检查菜单选项卡中，使用闭塞后反应性充血（PORH）操作进行动态条件下的图像采集。
   1. 采集基线对照扫描图像。在血压袖带未充气状态下找到合适的成像视野后，牢固锁定3D杯定位臂。
   2. 对成像部位施加最小压力，因为较高的压力可能影响读数准确性。按下制造商预设的默认按钮Hb, HbO₂, 和黑色素，以同时测量Hb、HbO₂和黑色素的发色团。
      警告：操作过程中必须佩戴合适的安全护目镜以保护眼睛。
      注：皮肤光型IV至VI型（深色皮肤）容易出现误读，需采集基线对照图像用于后续处理。在激光激活期间使用安全护目镜时，人眼仅能识别黄色和蓝色。颜色可在图像处理阶段进行调整。
   3. 选择用于基线图像采集的解剖区域。出于探索性目的，推荐选择前臂掌侧。通过踩下激光脚踏开关开始操作。
      注：触摸屏上标有查看 （黄色）的按钮，按下后可在屏幕上显示实时图像。图像稳定性状态以触摸屏中央的灰色条显示，表示3D探头的稳定性。
      1. 当图像稳定性达到最佳时，按下触摸屏上的快照 按钮，获取该区域的静态图像。每次扫描将在2秒的采集时间内，针对预设中定义的每个波长，在150 mm的声学深度下采集10-12帧图像。此次基线扫描共包含30-36帧图像。
         注：每种检测到的发色团（Hb、HbO₂和黑色素）各采集10帧图像，最大成像深度为15 mm。
      2. 继续踩下激光脚踏开关以进行连续视频采集，并注意触摸屏上的查看 按钮（黄色）。待图像稳定后，按下录制 （蓝色）按钮开始实时图像录制。
      3. 按下停止按钮（黑色）结束录制。光声成像平台将停止录制，并自动将视频转为预览模式。
   4. 动态测量（PORH示意图）：将压力袖带调整至患者肘部上方的上臂位置，以演示该操作。将袖带充气至高于收缩压的压力（约200 mmHg），然后按照步骤2.3.1至2.3.3.1采集受压状态下的血管图像。
   5. 为采集评估压力释放对成像血管影响的视频，在执行步骤2.3.3.2的同时打开压力释放阀。与之前相同，持续关注屏幕上的实时图像。
      注：执行此操作时，应维持高于收缩压的压力1-5分钟；需注意该压力可能在患者中引起不同程度的耐受性和不适感。实验过程中应谨慎管理这一方面。

3. 图像分析方案

1. 将记录的扫描数据复制到选定的专用文件夹中，以便在另一台计算机工作站上使用制造商专用的分析软件进行备份和进一步分析。每次扫描均按采集时间存储，并由程序在研究文件夹中按连续编号排序。
   注意：强烈建议备份一份数据副本。虽然可以直接使用记录的原始数据，但不推荐这样做，因为硬盘一旦发生故障，可能会损坏原始数据。
2. 在工作站计算机上打开分析程序。选择程序 菜单 > 开放研究 导入文件并访问备份扫描。打开研究项目并滚动至底部 文件夹（含已记录的扫描文件）以查找扩展名为 .NOD 的文件。该软件仅识别此文件类型以打开研究项目。
   注意：.NOD 文件会根据每项研究的序号自动命名，文件名中不包含任何患者信息。
3. 进行图像重建时，通过打开软件访问图像分析模块 菜单 > 高级处理.
   1. 确保程序工作流程选项卡在顶部菜单栏中可见（显示为黑色）补充图1): 菜单; 扫描概述; 重建; 光通量校正; 光谱解混; 可视化 & 分析分析过程中，任何已激活的工作流程选项卡将显示为蓝色。
      注意：如果 高级处理 未打开时，软件仅显示 扫描概述 和 可视化 & 分析.
4. 重建图像 通过 的 重建 软件的标签页。在主程序菜单的左侧选择要重建的扫描图像。已加载 扫描结果显示在屏幕右侧。保留默认的六个光声发射波长（700、730、760、800、850 和 900 nm），因为这些波长包含了 HbO 的最大光声信号。₂ 在900 nm处用于Hb，在760 nm处用于血红蛋白，在700 nm处用于黑色素。
   1. 使用右侧的图标执行扫描重建。按照程序工作流程进行选择 扫描 预设和 视野 （分辨率）。信息显示在主屏幕的左上角。调节声速以调整扫描焦点（补充图2）。该 重建 面板还显示了每次采集扫描的帧数，并允许选择需要分析的重复次数（如有必要）。
      注意：每次扫描均以默认声速 -90 加载，用户应根据需要进行调整。声速也可通过自动聚焦功能（AF）自动调节。
5. 按下按钮 重建扫描 在屏幕顶部点击以进入扫描重建。此时将出现一个临时仪表盘，显示提示信息 工作流程处理该面板也可从 菜单 > 处理状态完成重建后，必须进行图像后处理分析 光通量校正.
6. 激活 光通量校正 仪表板菜单中重建图像的。必须加载重建图像以进行通量校正。这些图像在每个扫描编号旁带有标记。加载的文件将立即显示在屏幕右侧 精选重建激活 光通量校正 通过与屏幕右侧的图标交互（补充图3）。推动 保存光通量校正 以推进。
7. 保存荧光校正后，对已获取的预设（Hb, HbO）进行光谱解混₂，以及黑色素）。选择 光谱解混 选项卡以打开列表 精选重建 用于光谱解混。所选研究的每次扫描列表将连同先前图像处理步骤的历史记录一并显示。
8. 加载先前保存的注量校正文件。加载的扫描结果将立即显示在屏幕右侧 精选重建 (补充图4)。通过点击屏幕右侧的图标来激活光谱解混功能。
   1. 观察需要解混的波长。在重建步骤（步骤 3.4）中使用的全部六个光声发射波长（700、730、760、800、850 和 900 nm）将被自动选中用于光谱解混。编辑需要处理的光谱（例如：光谱：Hb、HbO）₂，以及使用以下方法提取黑色素） XYZ 如有需要，可添加图标。
   2. 确认调整后的参数后，单击 开始光谱解混 光谱解混开始进行。此时会出现一个处理进度菜单栏，显示操作的进展情况。
      注意：在光谱解混过程中可进行多种参数调整，并存在多种解混方法。本方案中， 线性回归 该方法被用作解混血红蛋白（Hb）和氧合血红蛋白（HbO）的标准₂和黑色素。
9. 获取 可视化与分析 点击已激活的扫描项，以显示在步骤 1.1 中输入的所有受试者信息和备注补充图5).
   注意：可并行显示多个扫描结果。
   1. 推入 + 按钮以创建多扫描分析。在此窗口中，引入多扫描视图并按下 保存 按钮。保存视图名称后，将显示一个新仪表板，其中包含正在分析的研究的所有扫描图像。
   2. 选择每个需要的扫描项目 添加 （每个）添加到已保存的 分析视图. 在左上角图标处添加额外的扫描图像，它们将自动显示在 分析视图.
10. 在分析界面中，设置合适的颜色查找表，以准备进行图像分析。点击 更多图像控制选项 在顶部菜单栏中并激活 最大强度投影 通过点击图像显示界面右下角（位于2D+图像显示旁）的图标，为各图层分配颜色。
11. 选择 更多 同时编辑所有通道的颜色。此菜单显示所有未混合的发色团，并允许选择多个图层进行显示。
    注意：将鼠标悬停在软件图标上时，会以灰色显示其名称，如方案中所示。
12. 使用屏幕左下角提供的工具调整每个图层的颜色强度。
    ​注意：通常对每个通道使用最小/最大值插值进行调整可获得良好效果。

4. 感兴趣区域（ROI）分析

注意：进行数据分析时，必须选择感兴趣区域（ROI）。

1. 确定要分析的感兴趣区域（ROI）。在XY图像中使用菜单栏内的可用形状围绕该ROI，同时在XZ和YZ轴的正交视图中追踪相同的ROI（补充图6）。
   注意：当前的ROI分析使用了多边形形状。
   1. 在剩余的XZ和YZ轴中跟随ROI的形状（见图2），并利用添加插值和移除子区域功能放置多个多边形图层。在定义或选择所需ROI后，可对数据进行绘图。
   2. 点击将感兴趣区域导入量化图标，观察屏幕右侧显示的所选ROI的多光谱成分图形细节。
   3. 通过点击ROI数据图形视图底部的Excel图标导出ROI数据。所有区域的完整数据包将作为整体导出至电子表格，用于后续分析。图3展示了某一位受试者的数据，该受试者接受了200 mmHg压力袖带加压，并将其血管结构与0 mmHg静息状态下的血管结构进行了对比分析。
2. 通过执行4.1–4.1.3步骤，同时量化多个ROI对象。
3. 从同一菜单中以TIFF文件格式导出图像，图像包含所有嵌入的数据及内置的ROI轮廓（图2）。

结果

光学声成像所提供的数据可在后期处理的导出图像（图2）和绘制的数据图（图3）中进行分析。本文旨在介绍光学声功能成像的操作方法，并探讨其在较为常见的血管研究中的应用。为此，我们比较了在静息状态下以及对主要供血动脉施加200 mmHg压力阻断后所获取的图像（图2）。这些观察结果可通过感兴趣区域（ROI）分析和数据导出进行量化。在XY平面上，可观察到黑色素信号高于YZ和XZ平面，这表明了表皮的边界。对肱动脉（上臂）进行阻断后，会在OT探头放置位置前方的血管（前臂掌侧）引发一定程度的血液淤滞。因此，我们在XY、YZ和XZ轴向上均检测到总体信号的增强，表现为蓝色（Hb）和红色（HbO₂）信号的增加。在袖带持续维持200 mmHg压力期间，可通过XY平面追踪血液淤滞情况。YZ和XZ轴向显示，与正常灌注状态（无阻断）相比，阻断部位上方的血容量增加，这一变化由品红色遮罩区域突出显示。

对同一微血管区域...

讨论

本方案重点介绍操作这种新型光声成像仪器所需的实用步骤，从实现三维杯状探头稳定所必需的受试者与探头的适当定位，到图像采集、感兴趣区域（ROI）选择，以及图像重建与分析。

所提出的实验方法，采用 "瞬时的" 结合动态条件下获得的图像， acquisitions 展示了该仪器在获取信息方面的优势与实用性 体内 人类血管生理学。如图所示，在最大达15 mm的体积内采集的声学图像分辨率为150 µm³ 是其他断层扫描技术无法比拟的。

需要注意以下几点：（i）探头稳定对图像采集至关重要；使用灵活且稳固的探头架可明显改善图像采集效果；（ii）正确识别血管结构；可利用表皮-真皮交界处的黑色素等超声影像学参考标志，作为识别皮肤上层血管丛的标记；（iii）通过设备制造商提供的重建软件进行功能图像分析。

对感兴趣区域（ROI）数据的高级分析和图像导出需要深入理解专用软件及所开发的算法。当前的光声成像仪器能够重建15 mm的三维体积

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
袖带	PIC	107001
手术巾	Pajunk	021151-1501
70% 乙醇	Sigma Aldrich	EX0281
护目镜	Univet	559G.00.00.201
吸水纸	Amoos	5601856202331.00
多光谱光声断层扫描仪	iThera	MSOTAcuity
稳定臂	ITEM		自行设计并组装
超声耦合剂	Parker Laboratories	308
脱毛膏	Veet	kkdg08hagd