培养与遗传操作昆虫病原线虫

摘要

昆虫病原线虫与细菌共生，二者共同作用，通过破坏昆虫的先天免疫系统成功感染宿主。为了促进对线虫感染遗传基础的研究，本文描述了昆虫病原线虫的保种及遗传操作方法。

摘要

异小杆线虫属（Heterorhabditis）和斯氏线虫属（Steinernema）中的昆虫病原线虫是生活在土壤中、专性寄生昆虫的线虫。其生命周期的主要特征是分别与发光杆菌属（Photorhabdus）和类志贺氏杆菌属（Xenorhabdus）细菌形成互利共生关系。这些线虫寄生体能够定位并侵入合适的昆虫宿主，抑制昆虫的免疫反应，并高效繁殖，产生下一代主动寻找并感染新昆虫猎物的线虫。由于其生命周期的特性，昆虫病原线虫被广泛用作生物防治制剂，常与杀虫剂联合使用以控制农业上具有破坏性的害虫。同时，这些寄生性线虫也作为一种研究工具，用于分析线虫的致病性以及宿主对线虫的防御反应。近年来发展的遗传学技术和转录组学方法有助于揭示线虫在感染过程中分泌分子的功能，推动了相关研究。本文提供了一套详细的实验方案，用于维持昆虫病原线虫的培养，并实施基因沉默操作。这些方法进一步促进了对昆虫病原线虫感染因子的功能鉴定。

引言

近年来，由于昆虫病原线虫（EPN）在综合害虫管理策略中的应用价值及其在基础生物医学研究中的作用，相关研究日益深入^1,2。最近的研究已确立EPN作为模式生物，用于研究在感染过程不同阶段被激活的线虫遗传组分。这些信息为寄生虫分泌的、用于改变宿主生理状态并破坏昆虫先天免疫反应的分子的性质和数量提供了关键线索^3,4。同时，这些知识通常还结合了关于昆虫宿主免疫信号通路类型及其所调控功能的新发现，以限制病原体的侵入与扩散^5,6。理解这些过程对于全面认识EPN与其昆虫宿主之间动态相互作用的两个方面至关重要。对EPN与昆虫宿主关系的深入理解，无疑将促进对哺乳动物寄生性线虫的类似研究，从而有助于鉴定和表征干扰人类免疫系统的感染相关因子。

嗜菌性线虫 Heterorhabditis sp. 和 Steinernema sp. 可感染多种昆虫，其生物学特性此前已被广泛研究。这两种寄生性线虫的繁殖方式不同：Heterorhabditis 为自体受精，而 Steinernema 通常进行两性繁殖，尽管最近研究表明 S. hermaphroditum 可通过雌雄同体的自体受精或孤雌生殖进行繁殖^7,8,9。Heterorhabditis 与 Steinernema 线虫的另一区别在于它们分别与两种不同的革兰氏阴性细菌属——Photorhabdus 和 Xenorhabdus——形成共生互惠关系，这两种细菌对昆虫均具有强致病性。这些细菌存在于嗜菌性线虫的自由生活、不取食的感染期幼虫（IJ）阶段。感染期幼虫能够识别易感宿主，侵入昆虫血腔，并释放其携带的细菌；这些细菌迅速增殖并定植于昆虫组织中。嗜菌性线虫及其共生细菌均产生毒力因子，以破坏昆虫的防御机制并干扰其稳态。在昆虫死亡后，线虫的感染期幼虫发育为成虫，并完成其生命周期。由于昆虫尸体内部食物匮乏和种群密度过高，新一代感染期幼虫最终从尸体中逸出进入土壤，以寻找合适的宿主^9,10,11,12。

本文描述了一种高效维护、扩增及进行遗传操作EPN线虫的实验方案。具体包括共生性H. bacteriophora和S. carpocapsae感染性幼虫（IJs）的复制、无菌线虫IJs的制备、用于显微注射的H. bacteriophora雌雄同体的培育、dsRNA的制备，以及显微注射技术。这些方法对于理解线虫致病性的分子基础以及宿主抗线虫免疫机制至关重要。

方案

1. 共生线虫感染性幼虫的制备

1. 在培养皿（10 cm）中铺一张滤纸，并放入约 10–15 条 Galleria mellonella 幼虫（图 1A）。
2. 使用移液器将 2 mL 含有约每 10 µL 悬液 25–50 条感染性幼虫（IJs）的水溶液滴加到蜡虫上。将培养皿置于室温下的柜子中保存。
3. 根据滤纸的湿润程度，每隔 2 天添加 1–2 mL 水。被 IJs 感染的蜡虫通常在 48 小时内死亡。
4. 在蜡虫感染 IJs 约 10 天后，准备 White 氏水诱捕装置⁸（图 1B、C）。小心地将死亡的昆虫转移到滤纸上未浸湿的部分。用自来水注满底部的培养皿，并将一个 15 mL 离心管的盖子倒置作为支撑物，以提供通风间隙。
5. 使用塑料镊子缓慢从滤纸上提起柔软且脆弱的蜡虫，小心转移。请使用自来水而非去矿物质水或去离子水，后者会导致线虫聚集。
   1. 确保水诱装置中的水位达到培养皿高度的大约一半。注意水位会随房间内的温度和湿度条件随时间发生变化。
6. 当小培养皿中的水因存在线虫而变得浑浊时，使用移液器将新一代的 IJs 转移至 T25 或 T75 细胞培养瓶中。
7. 加入自来水至总体积的约 40%，直至达到适当密度（图 1C）。避免线虫过度聚集，并将细胞培养瓶水平放置储存。
8. 向底部培养皿中补充更多水，并重复步骤 1.6 和 1.7，直到约 3–5 天后昆虫尸体不再有 IJs 逸出为止。

2. 无菌线虫感染性幼虫的制备

注意：使用无菌线虫是因为在线虫-细菌复合体进入昆虫体内解离后，每种共生伙伴都会引发宿主不同的免疫反应⁵。选用Photorhabdus temperata的突变株Ret16是因为该菌株能够支持H. bacteriophora的生长，但无法定植于线虫肠道^13,14。

1. Heterorhabditis bacteriophora 感染性幼虫
   1. 使用无菌的移液器吸头或刮勺，刮取数片冷冻培养物的碎片 P. temperata 将Ret16接种到麦康凯平板上，并划线分离单菌落。将平板在28 °C培养2-3天。
   2. 在50 mL离心管中，将1个菌落接种至10 mL LB肉汤中，于28 °C摇床培养箱中过夜培养。仅使用在MacConkey琼脂上呈红色的原相菌落；次相菌落在MacConkey琼脂上呈乳白色。
   3. 用 1.5 mL 微型离心管将 100 µL 过夜培养物与 900 µL 1× PBS 混合，于 17,900 × g 离心洗涤 g倾去上清液。用1×PBS将培养物稀释10倍。将试管置于冰上。
   4. 将大蜡螟幼虫浸入70%乙醇溶液中，用纸巾擦干昆虫，然后放入50 mL离心管中。
   5. 将试管置于冰上20分钟，以固定蜡虫。
   6. 使用滤纸覆盖培养皿（10 cm）的上下两部分。将覆盖有滤纸的培养皿盖用作注射时的底部支撑。润湿培养皿底部的滤纸，并将其置于冰上，以帮助注射后的蜡虫恢复。
   7. 在一块石蜡膜上用移液器吸取50 µL预冷的细菌，准备好22 G针头注射器。轻轻推动推杆，排出针尖处的空气。
   8. 在体视显微镜下将一只蜡虫保持在靠近后端的位置（图2).
   9. 向蜡虫胸部背侧注入50 µL细菌培养物，优先选择两个体节交界处进行注射。为尽量减少内部损伤，应将针头刺入角质层下方，并尽可能与蜡虫体轴平行。刺破蜡虫时，有少量血淋巴渗出属于正常现象。
   10. 将注射后的昆虫转移至恢复用培养皿中。
   11. 重复步骤 2.1.7–2.1.9，直至所有昆虫均注射了细菌。为麻醉昆虫，将其置于冰上 5 分钟。
   12. 将培养皿置于黑暗处（例如抽屉或柜子中），若滤纸看起来干燥，则加入自来水。蜡虫在注射后2天内会死亡，大约3-4天后呈现砖红色。若昆虫呈现棕色，则表明细菌感染未成功。
   13. 感染后7天，将呈现特征性砖红色的昆虫转移至铺有新鲜滤纸的培养皿中，并继续后续操作。 "共生线虫感染性幼虫的制备" 如果使用共生线虫，则使用第一轮产生的新感染性幼虫，从步骤2.1开始重复操作。
   14. 表面灭菌 H. bacteriophora IJs
       1. 收集足够的共生体 H. bacteriophora 通过离心将候选无菌感染性幼虫浓缩，在1.5 mL离心管中形成100 µL的沉淀。
       2. 向每根微量离心管中的沉淀加入 500 µL 5% 次氯酸钠溶液，颠倒混匀。孵育 10 分钟。在 17,900 x g 1 分钟后去除上清液。
       3. 用1 mL无菌水洗涤沉淀，重复离心。弃去上清液。重复此步骤再进行四次。
   15. 验证无菌性
       1. 用移液器将400 µL无菌水加入已洗涤的共生体和候选无菌样本中 H. bacteriophora 线虫
       2. 将线虫放置于培养皿中的昆虫上方，并相应标记处理组。
       3. 将装有感染昆虫的培养皿置于黑暗环境中，并定期检查蜡虫是否变为红色。
          注意：感染的蜡虫 H. bacteriophora 共生线虫在感染后2天内会变为红色。蜡虫的变色是由于共生菌分泌的多种化合物所致。 Photorhabdus 感染过程中细菌的情况。感染后4天，被感染的蜡虫体内缺乏红色，表明 H. bacteriophora 是无菌的。这是因为 P. temperata Ret16 细菌不存在于线虫肠道中。
   16. 验证无菌性的替代方法
       1. 表面灭菌共生体 H. bacteriophora IJs 和候选无菌 H. bacteriophora 如步骤2.1.14所述的IJs。
       2. 在微量离心管中，使用无菌研杵将约500条感染性幼虫（IJs）在500 µL无菌1×PBS中匀浆。离心收集匀浆液，倾去上清液，将沉淀物涂布于LB琼脂平板。将平板在28 °C培养24小时。
       3. 计数每块平板上的菌落形成单位（CFU）。来自无菌 H. bacteriophora 不会形成任何共生菌落 P. luminescens 细菌
2. 斯氏线虫（Steinernema carpocapsae） 感染性幼虫
   1. 脂质琼脂平板的制备（300 mL 溶液可制备约20个分装平板）
      1. 称取2.4 g营养肉汤、4.5 g酵母提取物和1.5 g琼脂，加入267 mL去离子水中。将溶液高压灭菌。
      2. 加入3 mL 1 M MgCl₂₂1.2 mL 玉米油和 28.8 mL 7% 玉米糖浆。
      3. 加入300 µL浓度为30 mg/mL的卡那霉素和300 µL浓度为50 mg/mL的氨苄青霉素（经0.2 µm滤膜除菌）至溶液中并混匀。
      4. 将混合物倾注至分隔培养皿/分体平板的一侧。
   2. 制备 X. nematophila 菌株 ΔrpoS) 细菌菌苔
      1. 培养 X. nematophila (Xn) ΔrpoS 从冻存的细菌菌种直接接种于2 mL LB/kan/amp溶液中，30 °C摇床过夜培养。
      2. 在含有30 µg/mL卡那霉素和50 µg/mL氨苄青霉素的5 mL LB培养基中接种250 µL过夜培养物，并在摇床中过夜培养细菌。
         注意： Xn 细菌从冷冻保存菌种直接划线接种到选择性脂质琼脂培养基上时，生长状况通常不佳。如有必要，可进行初代和次代培养 Xn 可在NBTA培养基（营养琼脂添加25 mg溴百里酚蓝/L）上初步确认⁻¹ 和40 mg氯化三苯基四氮唑 l⁻¹在开始新的液体培养之前。
      3. 用移液器吸取100 µL培养物，接种于脂质琼脂平板上，并用无菌接种环涂布至整个平板表面。将平板在30 °C条件下培养24 h。
   3. 表面灭菌 S. carpocapsae IJs
      1. 将含有感染性幼虫（IJs）的锥形瓶倾斜放置，使 IJs 沉降至瓶的一角。用移液器吸取 1 mL 沉降后的 IJs 至微量离心管中。在 17,900 x g 10 秒。弃去上清液。
      2. 加入1 mL 1%的新鲜配制次氯酸钠溶液。倒置离心管充分混匀。孵育1分钟（延长次氯酸钠孵育时间将导致感染性幼虫死亡）。再次离心10秒。弃上清液。
      3. 为去除漂白剂残留，用1 mL无菌蒸馏水清洗线虫，离心10秒，弃上清液。重复清洗四次。
      4. 在体视显微镜下计数洗涤后的10-20 µL IJs，估算每毫升IJs数量，并相应调整IJs浓度。
   4. 饲养 S. carpocapsae IJs
      1. 用移液器将约1000条IJs转移至脂质琼脂分装平板上（图3，左图）。将培养板置于湿润的柜子或抽屉中，使用湿润的纸巾增加湿度。在室温（22–25 °C）下保存培养板。
      2. 每隔一天检查一次纸巾，确保其保持湿润。必要时，每隔一天向纸巾加水，以维持柜子或抽屉内的湿度。或者，可在柜子底部放置一个水浴装置以增加湿度。
      3. 当仅出现感染性幼虫（IJs）时，在培养皿的另一侧加水，并在培养皿中间放置一层滤纸（水分陷阱， 图3，右图）。将含有第一轮IJs的水收集到T75细胞培养瓶中。这些即为第一轮IJs S. carpocapsae 线虫
      4. 再次用漂白剂进行表面灭菌（步骤 2.2.3），并从第 2.2 步开始使用第一轮重复该过程 S. carpocapsae 线虫。结果将进入第二轮 S. carpocapsae 线虫
      5. 每隔几天在体视显微镜下观察，以追踪线虫的发育情况。
   5. 验证无菌状态 S. carpocapsae IJs
      1. 对第一轮、第二轮及共生体进行表面灭菌 S. carpocapsae 按照步骤2.2.3中所述，使用漂白剂处理IJs。
      2. 使用无菌塑料研杵在微量离心管中匀浆约400–700条IJs。离心匀浆液，倾去上清液，将沉淀物涂布于LB琼脂平板。将琼脂平板置于28 °C培养箱中孵育24小时。
      3. 统计每块平板上菌落形成单位（CFU）的数量。无菌线虫样品不会产生任何细菌生长。
   6. 验证无菌状态 S. carpocapsae 通过PCR检测IJs
      1. 对第一轮、第二轮及共生体进行表面灭菌 S. carpocapsae 用漂白剂处理IJs，具体步骤如2.2.3所述。
      2. 从匀浆中提取DNA。详细的提取步骤见下文第4.1.2节。
      3. 使用 XptA2 引物进行 PCR 扩增，退火温度为 61 °C：
         XptA F：5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′。
         XptA R：5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′。
         注意：这些引物扩增杀虫基因 XptA2 的 X. nematophila， 扩增产物大小为231 bp。扩增程序如下：95 °C预变性2 min，共34个循环，每个循环包括95 °C变性30 s、61 °C退火1 min、73 °C延伸1 min，最后72 °C终延伸10 min。
      4. 通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段进行观察。无菌表面消毒样本不会形成任何条带。

3. 用于显微注射的H. bacteriophora两性个体的培养

1. 准备含有NA+chol的6 cm培养皿（1.5倍浓度营养肉汤，1.5%琼脂，以及10 µg/mL胆固醇）。
2. 在10 mL培养管中加入3 mL PP3溶液（2%蛋白酶蛋白胨#3，PP3）。
3. 使用无菌的20 µL枪头刮取保存在-80 °C的P. luminescens甘油菌种（25% vol/vol无菌甘油）表面，并将其滴入培养管中。
4. 将培养管置于温度控制摇床中，在28 °C、200 rpm条件下过夜培养。
5. 次日，菌液将呈现淡红色。取50 µL菌液接种至6 cm NA+chol培养皿上，使用细菌涂布棒以环形方式均匀涂布。
6. 将培养皿放入28 °C培养箱中培养。P. luminescens菌苔将在24–36小时后形成，呈淡红色。
7. 在平板上接种50–100条经过表面灭菌的IJs，并将平板置于28 °C培养。
8. 健康的L4期雌雄同体线虫将在接种后约48–54小时开始出现。注射实验需使用健康且未饥饿的晚期L4期H. bacteriophora雌雄同体线虫。

4. 双链RNA的制备

1. 引物设计
   1. 设计针对 H. bacteriophora DNA 中约 500 个碱基对的外显子区域的双链 RNA（dsRNA）引物。
      1. 可使用 Primer3（https://primer3.ut.ee）或类似程序确定目标区域的引物，选择最优产物长度为 500 个碱基对，退火温度（Tm）为 60 °C，引物长度为 22 个核苷酸。
      2. 在每条正向引物的 5′ 端添加 T7 启动子序列（TAATACGACTCACTATAGGG），以实现体外转录。
2. 基因组 DNA 提取
   1. 使用从约 50,000 条 H. bacteriophora 感染性幼虫（IJs）冷冻沉淀中提取的基因组 DNA 进行 dsRNA 合成。
   2. 将 IJ 沉淀重悬于 50 µL 裂解缓冲液（50 mM KCl，0.05% (w/v) 明胶，10 mM Tris-HCl pH 8.2，0.45% Tween 20，60 µg/mL 蛋白酶 K，2.5 mM MgCl₂）中，并置于 −80 °C 至少 30 分钟。
   3. 使用小型管状研杵充分匀浆沉淀。
   4. 将溶液升温至室温，随后在 60 °C 孵育 2 小时，每 15 分钟涡旋混匀一次。
   5. 将匀浆组织在 95 °C 孵育 15 分钟，以灭活蛋白酶 K。
   6. 将样品冷却至 4 °C，并在 3,400 x g 离心 1 分钟。
   7. 取上清液作为后续 PCR 反应的模板。
   8. 使用商业预混液建立 50 µL 的 PCR 体系，包含 200 ng 模板 DNA、0.2 µM 正向和反向引物，并按照制造商推荐的循环条件进行扩增。
   9. 在 1.2% 琼脂糖凝胶上分析 PCR 产物，验证反应是否产生预期大小的单一条带。
3. 双链 RNA 合成
   1. 使用商业转录试剂盒。
   2. 取 5 µL PCR 产物用于体外转录，操作步骤遵循制造商说明书。
   3. 在 37 °C 孵育反应体系 16 小时。
   4. 使用商业纯化试剂盒，通过乙酸铵/乙醇沉淀法纯化体外转录产物，以浓缩 dsRNA。
   5. 将沉淀的 dsRNA 溶解于 10 µL 无 RNase 水中。
   6. 使用分光光度计测定 RNA 浓度。
   7. 通过 1.2% 琼脂糖凝胶电泳评估 dsRNA 质量。

5. 显微注射

注意：注射垫是指在中心位置覆盖有一层2%（w/v）琼脂糖的玻璃盖玻片。当需要注射的线虫被转移至这些垫上时，琼脂糖层将固定它们以进行操作。通常，额外的注射垫会放置在显微镜附近以供常规使用。

1. 准备注射垫
   1. 将0.2 g琼脂糖加入10 mL水中，煮沸制成2%琼脂糖溶液。
   2. 取1–4滴（约50 µL）溶液置于50 mm × 70 mm的薄玻璃盖玻片中央。
   3. 用另一块盖玻片将液滴压平。
   4. 让盖玻片干燥2–3分钟，然后横向滑动移除上层盖玻片。
   5. 在朝上的盖玻片右侧标记“R”以标识右侧。
   6. 让载片在室温下干燥1天后再使用。
2. 注射针的制备
   1. 使用内含细丝的1.0 mm玻璃毛细管。这种毛细管可实现针头的高效填充。
      注意：可使用任何商用拉针仪（例如Narishige PB-7）。
   2. 打开拉针仪电源。
   3. 确保加热器设置为最大值，电磁阀设置为8.40，以保证针头所需的锐利度和适当长度。
   4. 将毛细管通过细丝插入顶部旋钮的凹槽中，并拧紧顶部旋钮。毛细管顶端应与拉针仪顶部齐平，加热丝应位于毛细管中央。
   5. 移动底部单元至顶部，然后拧紧底部旋钮。确保毛细管牢固固定。
   6. 关闭拉针仪盖子并按下启动键。绿灯将亮起。数分钟后，毛细管被加热并拉断成两半。
      注意：两个分离的针头长度不同，但均可用于注射。优先使用较长的针尖。
   7. 使用一小块塑型黏土将针头垂直放置，针尖朝下。或者，将针头置于培养皿中，并用两条塑型黏土固定。
3. 装载针头
   注意：核酸溶液必须在20,784 × g 条件下离心至少10分钟，以沉淀悬浮液中可能存在的杂质。离心去除杂质可防止其堵塞注射针头的液体流动。
   1. 采用以下两种方法之一将核酸装入针头。
   2. 方法1
      1. 使用移液器将约0.5 µL离心后的DNA样品转移至注射针未拉伸的一端。样品将表现为毛细管顶端的一小滴液体。
      2. 静置5至7分钟，使液体样品充满针尖末端。最终产物应为充满液体且无气泡的针头。
      3. 使用解剖显微镜在注射前确认针尖内有溶液存在。
   3. 方法2
      1. 使用微注射仪的专用加样头。
      2. 用此加样头吸取5 µL核酸溶液。
      3. 当拉制好的针头仍在拉针仪上时，松开顶部旋钮，将上部拉制针头略微向上移动，然后重新拧紧旋钮。
      4. 小心地将加样头尖端插入毛细管，并伸入至注射针底部。
      5. 将核酸溶液注入注射针中。
      6. 将加样头从拉制针头中取出，必要时单独保存以备后续加样。更换不同核酸混合物时，务必更换加样头。
4. 准备注射显微镜
   注意：使用带有底座漫射照明的倒置显微镜进行线虫准备、显微注射和恢复观察。本方案描述使用配备10x和40x物镜的高分辨率倒置显微镜。显微镜配备针头操纵器，用于固定针头并将其定位至注射位置。微注射油用于防止线虫在注射垫琼脂层上快速脱水。推荐使用Halocarbon Oil 700。
   1. 打开光源，通过控制面板调节亮度。
   2. 检查聚光镜沃拉斯顿棱镜上的编号，应与所用物镜（40x）对应。
   3. 确认标有"DIC"的微分干涉（DIC）转盘处于正确位置。
   4. 确保物镜上的调节旋钮设置为零（0）。
   5. 将Ph环向右旋转到底。
   6. 调整偏振器，使箭头处于水平位置。
   7. 在载物台上放置一张纸，以观察焦点（光线）。
   8. 关闭视场光阑，直至纸上出现一个光斑。
   9. 使用左侧旋钮上下移动聚光镜，直至在纸上看到一个非常清晰的光斑。
   10. 缓慢打开视场光阑，直至可见一个小的光圈。
   11. 移走纸张。
   12. 确保光斑位于物镜中心。否则，通过调节聚光镜顶部的银色螺丝将光斑与物镜中心对齐。
   13. 完全打开视场光阑。
   14. 检查分析器ICT/P是否已完全压入。
5. 将注射针安装到显微镜上
   1. 打开氮气流向微注射针。针头的气体压力约为20 psi。
   2. 检查显微操作器旋钮（显微镜中移动针头的部分）是否位于中心位置，以便在安装针头后获得最大的移动范围。
   3. 拧下固定金属杆的组件，将其从针头夹中取出。
   4. 将新针头插入显微镜上部，然后安装橡胶垫圈以固定针头位置。
   5. 将针头夹的底部部件安装到位并固定。
   6. 将针头放入显微操作器的凹槽中，并适当拧紧螺丝以保持稳定。确保螺丝距离显微操作器末端约1英寸。
   7. 使用显微操作器的旋钮和粗调控制，将针尖以约45°角置于视野中央，相对于载物台平面。关键是要将针尖保持足够高的位置，以防意外折断。
6. 打断针头
   1. 将针头置于显微操作器中，使其针尖通常在该位置断裂，以便核酸溶液能够顺利流出。
   2. 打断一根毛细管，并将其放置在载有微注射油液滴的玻璃载片上。
   3. 将载片置于显微镜下并调焦。
   4. 使用显微镜的微调控制，将针尖移至与毛细管侧面同一水平位置（图4）。
   5. 使用脚踏开关短暂开启氮气流，确认针尖尚未断裂。快速开启关闭即可。
   6. 轻轻移动针头，使其轻微接触毛细管侧面。
   7. 轻敲显微镜侧面，使针尖断裂。
   8. 将针头从毛细管移开，并开启氮气流检查针尖是否已正确断裂。
   9. 针头将形成一个约比针尖大五倍的小注射液滴（图4）。若注射液滴较小，需进一步打断针尖；若液滴过大，建议更换新针头。

6. 显微注射

1. 在注射垫上用移液器滴加一滴显微注射油。
2. 将火焰灭菌的挑针浸入显微注射油滴中，从培养皿中挑取一条年轻的 H. bacteriophora 成虫线虫。
3. 从培养皿上远离细菌菌苔的区域挑取线虫，以避免将大量细菌细胞带入注射垫。同时，应选择生殖腺发育良好的线虫进行采集。
4. 将线虫转移至注射垫，并使其呈垂直方向放置，使生殖腺朝向注射针。确保阴门朝向与注射针方向一致，两个远端生殖腺臂则朝相反方向并紧贴线虫体壁。
   注意：与 Pristionchus pacificus 相似，H. bacteriophora 的生殖腺从腹侧阴门位置背向迁移，随后再绕回至腹侧位置。
5. 检查油量是否充足，以防止线虫脱水，同时避免线虫在油中自由移动。
6. 使用10倍物镜，将注射针保持在载玻片上方较高位置，使线虫处于焦点范围内。在油中，线虫的生殖腺表现为虫体前部和后部附近的两个透明区域。确保生殖腺处于焦点，而非线虫其他部位。
7. 将线虫调整至与注射针呈15°至45°夹角，以便为注射针在生殖腺内留出更多操作空间。该角度还可防止注射针插入生殖腺时穿透整个线虫体。
8. 通过缓慢降低注射针，将其与线虫调整至同一焦平面，直至两者均清晰对焦（图5）。在降低注射针过程中，确保其始终位于线虫旁侧，而非位于线虫上方。
9. 切换至40倍物镜，对准线虫的合胞体生殖腺臂进行聚焦。
10. 使用微调装置上下移动注射针，直至针尖与线虫合胞体生殖腺臂同时清晰对焦。
11. 使用滑动载物台缓慢将线虫向注射针方向移动，然后轻轻推动生殖腺，使注射针紧贴线虫体壁，以实现注射针高效穿入线虫体内。
12. 短暂踩下脚踏控制器，启动核酸溶液的流动。快速开启并关闭即可。若注射针位于生殖腺内，生殖腺将充满溶液并膨胀。
13. 确认注射针位置正确后，继续注入核酸溶液，直至生殖腺的两个臂均被完全填充。注意避免液体从注射针穿刺处溢出体外。
14. 使用滑动载物台，小心地将线虫从注射针上移开。
15. 抬起注射针并逆时针旋转。
16. 在线虫上方滴加一滴1×PBS缓冲液，使其漂浮起来。
17. 使用火焰灭菌的挑针将线虫提起，并转移至另一块新鲜接种了 P. luminescens 的培养皿上的M9液滴中，以去除线虫表面多余的油。
18. 将线虫从M9液滴中取出，放置于细菌菌苔的远端区域。
19. 可使用同一块培养皿转移多条已注射的线虫。
20. 2至3天后，观察第一代（F1）线虫的转基因表型。将具有转基因表型的F1代线虫分别转移至独立培养皿中，以筛选能够建立稳定转基因品系的个体。

结果

为了评估经过无菌化处理的 H. bacteriophora 线虫的状态，检测了感染性幼虫（IJs）中是否存在 P. luminescens 细菌菌落。具体操作如下：收集约500条经表面消毒并已在PBS中匀浆的IJs形成的沉淀。阳性对照组为含有共生 P. luminescens 细菌的线虫培养物中获取的约500条IJs所形成的沉淀。将无菌化处理组和阳性对照组的沉淀物在1×PBS中进行匀浆，随后将匀浆液用移液器接种至琼脂平板上，并涂布均匀以促进单个菌落的生长。琼脂平板在28 °C条件下培养24小时。次日观察 P. luminescens 菌落（CFU）的出现情况。结果如预期所示，来自保种培养物的 H. bacteriophora 携带共生的 P. luminescens 细胞；而那些不携带相关 P. luminescens 细菌的线虫则为无菌状态，并被单独保存以供后续实验使用（图6）。

以敲低n...

讨论

要理解昆虫病原线虫感染的分子基础以及昆虫对线虫的免疫防御机制，必须将线虫寄生体与其共生细菌分离开来^13,15,16。H. bacteriophora 和 S. carpocapsae 这两种昆虫病原线虫分别与革兰氏阴性菌 P. luminescens 和 X. nematophila 共生¹⁷。先前研究表明，这两种细菌均编码能够靶向昆虫组织并在感染过程中抑制先天免疫系统的致病因子^18,19。这阻碍了人们识别线虫在与昆虫宿主相互作用过程中所进化出的适应策略。因此，通过构建无菌线虫（axenic worms），有助于鉴定并进行功能表征——特别是对参与感染过程的线虫组分进行基因敲低分析。本文提供了高效制备无菌昆虫病原线虫以及...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1333
氨苄青霉素	Fisher Scientific	611770250
细胞培养瓶 T25	Fisher Scientific	156367
细胞培养瓶 T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq 预混液	Denville Scientific	C775Y42
玉米油	VWR	470200-112
玉米糖浆	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
10 mL 培养管	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips 微量加样尖端	Eppendorf	E5242956003
乙醇	Millipore-Sigma	E7023
50 mL Falcon 管	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet 微注射仪	Eppendorf	5252000021
滤纸	VWR	28320-100
大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫	Petco	-
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-553-464	50 × 24 mm
卤碳油 700	Sigma	H8898
接种环	VWR	12000-806
卡那霉素	VWR	97062-956
Kwik-Fil 硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB 琼脂	Fisher Scientific	BP1425-500	LB 琼脂 Miller 粉末 500 g
LB 肉汤	Fisher Scientific	BP1426-500	LB 肉汤 Miller 粉末 500 g
Leica DM IRB 倒置研究显微镜	Microscope Central	-
麦康凯培养基	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear 转录纯化试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1908
微量离心管	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
针头注射器	VWR	BD305155	22G
营养肉汤	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm 封口膜	VWR	52858-076
分区培养皿	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	PBS 缓冲液片剂 生物技术级 200 片
PCR 引物	Azenta	-
研杵	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art 一次性研杵
6 cm 培养皿	VWR	25384-092	60 × 15 mm
10 mm 培养皿	VWR	10799-192	35 × 10 mm
蛋白胨 #3	Thermo Fisher Scientific	211693
酵母提取物	Millipore-Sigma	Y1625