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方法文章

自下而上法 体外 检测Septin超微结构组织、膜重塑及曲率敏感行为的方法

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DOI：

10.3791/63889

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2022年8月17日

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1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Septins 是细胞骨架蛋白。它们可与脂质膜相互作用，并能够在微米尺度上感知甚至产生膜曲率。本实验方案中，我们描述了自下而上的体外（in vitro）方法，用于分析膜形变、对曲率敏感的 septin 结合行为以及 septin 丝状结构的超微结构。

摘要

膜重塑在质膜及细胞器内持续发生。为了全面解析环境（离子条件、蛋白质与脂质组成、膜曲率）以及与特定膜重塑过程相关的不同组分在其中所起的作用，我们开展 体外 自下而上的方法。近年来，人们高度关注揭示与重大疾病相关联的septin蛋白的作用。septin是一类必需且广泛存在的细胞骨架蛋白，可与质膜相互作用，在细胞分裂、细胞运动、神经元形态发生以及精子形成等多种生物学功能中发挥重要作用。因此，理解septin如何在膜上相互作用并组装，进而诱导膜形变，以及其如何对特定膜曲率产生响应，具有重要意义。本文旨在解析septin在分子水平上的超微结构与其在微米尺度上介导的膜重塑过程之间的相互关系。为此，研究中重组表达了芽殖酵母和哺乳动物的septin复合物，并进行了纯化。结合多种技术手段 体外 随后利用这些检测方法分析了膜上 Septin 的自组装行为。通过支持性脂双层（SLBs）、巨型单层囊泡（GUVs）、大单层囊泡（LUVs）以及波状基底，研究 Septin 自组装、膜重塑与膜曲率之间的相互作用。

引言

Septins 是一类可形成细胞骨架丝状结构的蛋白质，能够与脂质膜相互作用。Septins 广泛存在于真核生物中，对多种细胞功能至关重要。它们已被确认为芽殖酵母和哺乳动物细胞分裂的主要调控因子1,2。它们参与膜重塑过程、纤毛发生3以及精子形成4。在哺乳动物细胞内，Septins 还能以 Rho GTP 酶结合蛋白（BORG）依赖的方式与肌动蛋白和微管相互作用5,6,78。在多种组织（如神经元9、纤毛3、精子10）中，Septins 被证实是膜结合组分扩散屏障的调控因子11。此外，Septins 还被证明可调控膜出泡和突起形成12。作为多功能蛋白，Septins 的异常与多种常见疾病的产生相关13，其失调与癌症14和神经退行性疾病15的发生密切相关。

根据生物体的不同，多个septin亚基（在Caenorhabditis elegans中为两个，人类中多达13个）组装形成复合物，其结构组织方式具有组织依赖性16。基本的septin结构单元由两到四个亚基组成，每个亚基包含两个拷贝，并以棒状回文方式自组装。在芽殖酵母中，septin为八聚体17,18。in situ条件下，septin通常定位于具有微米级曲率的位点，如细胞分裂收缩部位、纤毛和树突基部以及精子环状结构处19,20。在膜上，septin的功能似乎具有双重作用：参与脂双层的重塑以及维持膜的完整性21。因此，研究septin成丝蛋白和/或亚基在膜上的生物物理特性对于理解其功能至关重要。为了在高度可控的环境中解析septin的特定性质，自下而上的in vitro方法是合适的。迄今为止，仅有少数研究团队描述了septin在in vitro条件下的生物物理特性20,22,23。因此，与其他细胞骨架纤维相比，目前关于septin在in vitro条件下行为的认识仍然有限。

本方案描述了如何分析 septin 纤维的组装结构、膜形态重塑以及曲率敏感性19。为此，采用了多种光学与电子显微镜技术相结合的方法（荧光显微镜、冷冻电子显微镜 [cryo-EM] 和扫描电子显微镜 [SEM]）。利用荧光光学显微镜观察微米尺度的巨大单层囊泡（GUVs）的膜形态重塑过程。通过 cryo-EM 分析结合脂质囊泡的 septin 纤维的排列方式及其超微结构。利用 SEM 研究结合在具有不同曲率的波浪形基底上支撑的脂双层中的 septin 纤维行为，从而分析 septin 对正负曲率的敏感性。与先前的研究20,24相比，本方案提出结合多种方法，全面分析 septin 如何实现自组装、协同性地变形膜结构以及响应膜曲率的特性。该方案被认为适用于任何对膜具有亲和力的纤维状蛋白质，具有良好的实用性与可扩展性。

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方案

1. 利用巨大单层囊泡（GUVs）测定膜重塑

注意：本节中制备 giant unilamellar vesicles（GUVs）以模拟在细胞环境中可能由 septins 诱导的膜形变。事实上，在细胞中，septins 常定位于具有微米级曲率的区域。GUVs 的尺寸范围从几微米到数十微米，且可发生形变，因此适用于检测任何由 septins 引起的微米尺度的膜形变。实验中使用荧光标记的脂质以及荧光标记的 septins（通过绿色荧光蛋白 [GFP] 标记），以同时追踪脂质与蛋白质的行为。 通过 荧光显微镜技术

  1. 缓冲液与溶液的制备
    1. 配制GUV生长缓冲液（50 mM NaCl、50 mM 蔗糖和10 mM Tris [pH = 7.8]）以及观察缓冲液（75 mM NaCl和10 mM Tris [pH = 7.8]）。
    2. 使用商用渗透压计测量并调节观察缓冲液与生长缓冲液的渗透压（理论值为170 mOsmol·L-1），通过添加少量NaCl使两者的渗透压相等。使用0.2 µm滤膜过滤缓冲液。将生长缓冲液分装后于-20 °C保存以备后续使用；观察缓冲液则于4 °C保存。
      注意：两种缓冲液之间的渗透压差异不应超过5%。
    3. 在观察缓冲液中配制5 mg·mL-1的β-酪蛋白溶液。确保完全溶解（在4 °C下磁力搅拌数小时）。用0.2 µm滤膜过滤该溶液，分装后于-20 °C保存。
  2. 在氯仿中配制总脂浓度为3 mg·mL-1的脂质混合物。使用以下摩尔百分比组成：56.8% 卵磷脂L-α-磷脂酰胆碱（EggPC）、15% 胆固醇、10% 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、10% 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸（DOPS）、8% 脑L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）和0.2% Bodipy-TR-神经酰胺，以增强蛋白-脂质相互作用并促进PI(4,5)P2的掺入25。
    注意：在通风橱中使用腈类手套和护目镜操作氯仿。使用玻璃注射器移取氯仿溶液，避免使用塑料器皿，因为氯仿会溶解塑料。每次使用前后，通过反复吸取氯仿5–10次清洗注射器。为防止交叉污染，应使用专用注射器移取特定的荧光脂质。脂质可在-20 °C下保存于琥珀色玻璃瓶中，瓶口用聚四氟乙烯（Teflon）密封，使用前充入氩气并用Parafilm封口，以防止脂质氧化。
  3. 使用铂丝装置进行GUV的电形成
    注意：图1展示了实验步骤示意图及腔室照片。
    1. 彻底清洗腔室和铂丝，以去除任何脂质残留物。
    2. 将铂丝和腔室浸入丙酮中，超声处理10分钟，并用蘸有丙酮的纸巾小心擦拭。
    3. 插入铂丝组装腔室，再次浸入丙酮中超声处理10分钟，再用丙酮擦拭一次，确保铂丝完全清洁。随后将腔室浸入乙醇中超声处理10分钟，并用乙醇擦拭。
    4. 最后将腔室浸入去离子水中超声处理10分钟，并用氮气或空气流吹干。
      注意：Teflon腔室（图1B）为实验室定制加工，包含三个可分别用盖玻片从两侧密封的腔室。铂丝可通过直径1.3 mm的孔插入腔室。
    5. 清洗腔室后，在每个铂丝上每腔室滴加3–4滴（每滴约0.1 μL）3 mg·mL-1的脂质混合物。将铂丝旋转180°，在每根铂丝的另一侧每腔室再滴加3–4滴脂质液滴。确保液滴之间互不接触。整个腔室约需5 µL脂质混合物。
    6. 将生长腔室置于真空干燥箱中30分钟，以彻底去除氯仿残留。
      注意：最佳条件为高真空（0.1 mbar）。干燥后的脂质易被氧化，因此不应在空气中暴露超过数分钟。
    7. 使用注射器在腔室底部（靠近铂丝的一侧）沿三个腔室边缘涂抹高真空润滑脂，并将洁净的（22 mm × 40 mm）盖玻片压紧在润滑脂上，确保完全密封。在腔室两端（即铂丝进出位置）使用封固剂（蜡片）进行密封。同样，在腔室另一侧也涂抹真空润滑脂。
    8. 使用移液器向各腔室加入生长缓冲液（每腔室约1 mL）。避免剧烈搅拌溶液，以防脂膜从铂丝上脱落。用22 mm × 40 mm盖玻片压紧润滑脂，将腔室顶部严密密封。为避免气泡产生，应从中心向边缘轻轻按压盖玻片。
      1. 将腔室置于4 °C冰箱中，并将铂丝连接至波形发生器（正弦波，500 Hz）。根据Beber等人的研究已优化的条件25，设定有效电压为350 mV（较短生长时间，即6小时）或250 mV（较长生长时间，即12–16小时）。
    9. 移除盖玻片，擦去封固剂和润滑脂，并取出铂丝。交替使用水和乙醇（≥70%）清洗并擦拭腔室。
      注意：GUV生长的最佳电压和时间尺度取决于多种参数，包括缓冲液盐浓度和腔室几何结构（如铂丝间距和腔室尺寸）。为确保实验可重复性，每次重复实验时应使用同一腔室。铂丝靠近腔室底部，以便可通过荧光显微镜观察脂质。在每一步骤中对脂质成像（见图1C、D），以确认电形成过程成功。
  4. Septin与囊泡的孵育
    1. 使用预先剪切的移液器吸头（开口约1 mm）靠近铂丝收集GUV，沿铂丝缓慢吸取溶液。此操作可避免产生强烈层流而破坏GUV。此步骤完成后，无需再使用剪切的吸头，因为在溶液中层流不会损伤GUV。
      注意：由于脂质混合物中含有PI(4,5)P2，收集后的GUV必须在2–3小时内使用完毕。因为PI(4,5)P2会迅速溶解，数小时后septin将无法再结合到膜上。然而，一旦septin结合到膜上，可在膜上稳定结合数天。
    2. 仅使用10 mM Tris缓冲液（pH 8）稀释septin储备液，使其渗透压与生长缓冲液相等；必要时，进一步用观察缓冲液稀释septin溶液。加入预定体积的收集GUV（总体积200 µL时加入50–100 µL）。在β-酪蛋白钝化处理后的观察腔室中直接进行孵育（见下文）。需等待20–30分钟以达到平衡。
      注意：人源或芽殖酵母septin八聚体复合物的表达与纯化已在其他文献中详细描述17。简而言之，septin在Escherichia coli中表达，通过亲和层析、尺寸排阻层析和离子交换层析在实验室中纯化，并在含50 mM Tris-HCl（pH 8）、300 mM KCl和5 mM MgCl2的水溶液中以约1 mg·mL-1（3 µM）浓度于-80 °C保存。高盐浓度用于防止septin聚集。不应使用滤膜离心装置浓缩septin复合物，因其会导致聚集并降低蛋白得率。
  5. 使用共聚焦和/或旋转盘显微镜成像
    1. 为防止GUV粘附表面或破裂，将观察腔室与5 mg·mL-1的β-酪蛋白溶液孵育30分钟，以完成表面钝化处理。
    2. 移除β-酪蛋白溶液，使用移液器将septin-GUV混合液（步骤1.4.2）转移至观察腔室中。让GUV沉降至腔室底部，静置10–15分钟。
      注意：GUV内部与外部缓冲液之间的组成差异导致密度和折射率失配。由于折射率失配，GUV可在透射光光学显微镜下被观察到。
    3. 使用共聚焦显微镜观察脂质的荧光信号，以评估GUV的质量和膜的层状状态。通过适当的校准25，记录septin的荧光信号以评估其在GUV上的结合密度。以0.4 µm的空间间隔进行Z轴扫描，以分析和可视化由septin与膜相互作用引起的囊泡三维形变。
      注意：使用60倍或100倍油浸物镜。分别使用像素尺寸为250 nm和110 nm的标准共聚焦或旋转盘显微镜（材料表）。应根据具体设备调整成像条件。溶液中未添加任何抗光漂白剂。

脂质膜水合过程示意图，包含实验装置及用于结构分析的显微图像。
图1：GUVs的电致形成。（A）使用铂丝进行电致形成过程的示意图。（B）用于通过电致形成法制备GUVs的自制聚四氟乙烯装置装配铂丝的实物图。铂丝直径为0.5 mm，间距为3 mm。（C）在生长过程中通过透射光学显微镜观察到的GUVs（球形物体）。图像底部的不透明区域为铂丝。（D）在铂丝上生长过程中通过荧光显微镜观察到的GUVs（圆形荧光物体）。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 利用冷冻电子显微镜分析 Septin 纤维的超微结构组织

注意：囊泡不适合使用标准电子显微镜方法进行成像。实际上，采用标准负染色法处理样品时会经历干燥过程。在脱水过程中，囊泡可能发生非特异性形变，常导致脂质突起的形成。因此，冷冻电子显微镜（cryo-EM）是观察囊泡特异性形变的更优策略。在冷冻电镜中，样品被包埋于一层薄冰（约100–200 nm）中，从而使其保持接近天然状态。然而，巨大单层囊泡（GUVs）尺寸过大（数十大微米），无法包埋于薄冰层中，因而不能通过透射电子显微镜成像。因此，需制备直径在约50–500 nm范围内的大单层囊泡（LUVs），以研究肌动蛋白相关蛋白 septins 如何引起囊泡形变及其在囊泡上的排列方式。

  1. 制备大单层囊泡（LUVs）
    1. 在玻璃小瓶中准备50 µg溶于氯仿的脂质混合物，其摩尔组成为57% EggPC、15% 胆固醇、10% DOPE、10% DOPS 和 8% 脑源 PI(4,5)P2，该组分优化用于增强膜上肌动蛋白结合蛋白（septin）与膜的相互作用。
    2. 在氩气流下干燥溶液，使小瓶内形成干燥的脂质薄膜。将小瓶置于真空环境中30分钟，以彻底干燥脂质。
    3. 将脂质膜重新溶解于50 µL水相溶液（50 mM Tris-HCl [pH 8]；50 mM KCl；2 mM MgCl2）中，获得终浓度为1 mg·mL-1，涡旋振荡10秒后转移至离心管中。
      注意：LUVs必须立即用于与septin孵育，否则由于PI(4,5)P2的溶解，蛋白-脂质相互作用将减弱。此粗略的再溶解过程会产生直径范围为50 nm至500 nm的异质性囊泡群体，因此可同时检测多种直径及相应曲率。
  2. 将septin与溶解的脂质在高盐缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8]，300 mM KCl，2 mM MgCl2）中孵育，终浓度分别为0.1 mg·mL-1（约300 nM）和20 nM。室温孵育1小时。
  3. 快速冷冻使样品玻璃化
    1. 使用等离子体发生器设备对多孔碳载网（300目）的碳面进行辉光放电处理30秒（电流5 mA），并将载网置于潮湿环境中的冷冻投入仪内。
    2. 取4 µL样品（步骤2.2）吸附于经辉光放电处理的载网碳面上。在吸附样品前立即向溶液中加入5–10 nm的金颗粒，以便后续通过冷冻断层成像生成倾斜系列图像。
      注意：金颗粒的密度需根据供应商情况通过实验筛选和调整，优化密度为视野中10–15个金颗粒。
    3. 从载网无碳膜一侧用滤纸吸干，使样品液滴在对侧被吸附。
      注意：通常吸滤时间为4秒，滤纸位置和吸滤力度需通过测试不同位置进行经验性调整，以优化冰层质量（厚度）和样品密度。
    4. 将载网转移至显微镜中或保存于液氮容器中。
      注意：使用多孔碳载网对于适应囊泡尺寸的多分散性至关重要。从对侧吸滤有利于提高生物样品在载网上的吸附效率。
  4. 冷冻电子显微镜成像
    1. 将载网插入配备冷冻电镜观测功能的电子显微镜（EM）中。在低倍率（通常为120倍）下对整个载网进行扫描，生成样品分布图，选择冰层质量较好（即薄且充分玻璃化）的区域。
    2. 进行冷冻电镜二维数据采集时，以约每像素2 Å的像素尺寸采集图像，以评估样品质量，确保septin纤维和脂双层均清晰可见。
    3. 进行冷冻电子断层成像数据采集时，选择显示有形变囊泡的感兴趣区域，并确保视野中有足够数量的金颗粒（至少10个）。
    4. 根据用于倾斜系列数据采集的软件，选择远离感兴趣区域的聚焦和追踪位置。以-60°至+60°范围改变倾转角度，每隔2°–3°采集一幅图像。
      注意：总电子剂量应约为或低于100 electrons/Å2。像素尺寸根据所用显微镜不同在1.3 Å至2.1 Å之间变化。理想情况下，优先采用角度对称的数据采集方案：0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°。然而，侧插式显微镜的测角台机械稳定性不足，难以实现此类对称方案。替代方案为：先从0°采集至34°，再进行第二序列从-2°至-60°，最后以36°至60°结束。此策略旨在最低倾角下采集初始图像（此时辐射损伤最小）。此外，若仅需观察囊泡超微结构及结合的septin纤维，可使用标准冷冻电镜（200 kV，六硼化镧（LaB6）灯丝，样品侧插入口）。但若计划进行后续图像处理（如子断层平均），则最好使用配备直接探测器的最新一代场发射枪（FEG）显微镜。本方案仅描述三维重构的获取过程，不涉及子断层平均。
  5. 基于冷冻断层成像的三维重构与分割
    1. 使用IMOD软件套件（材料表）进行倾斜系列图像的对齐与三维重构26,27。在IMOD中，基于标记物（金颗粒）位置进行倾斜系列图像对齐。如有需要，可在IMOD中进行对比度传递函数（CTF）测定与校正26。最后，严格按照各步骤完成IMOD中的三维重构。
    2. 使用IMOD软件套件中的3Dmod27手动分割脂双层和septin纤维，用于可视化展示。

使用扫描电镜分析 Septin 对曲率的敏感性

注意：为了理解肌动蛋白结合蛋白（septins）如何对微米级曲率敏感， 体外 该方法已被用于将 septin 微丝复合物与沉积在微米级波浪状图案化固相支持脂双层上进行孵育。

  1. 从波浪形聚二甲基硅氧烷（PDMS）图案设计波浪形NOA（Norland光学粘合剂）复制品
    1. 使用振幅为250 nm的PDMS波状图案 2 µm 侧向周期性或其他用于检测目标蛋白适用曲率的尺寸参数。
      注：PDMS 皱褶图案的设计与制备方法参见 Nania 等人的研究。28,29.
    2. 在洁净室环境中，沉积 5 µL 在直径为1 cm的圆形玻璃盖玻片上滴加液态NOA，将PDMS模板置于液滴上。用320 nm紫外光照射5 min，使液态NOA光聚合形成一层薄的聚合物膜。随后，轻轻将PDMS模板从盖玻片上剥离，得到新聚合的NOA薄膜。
      注意：NOA 是一种常见的光学透明胶水，适用于光学显微镜成像。此外，NOA 能耐受扫描电子显微镜（SEM）成像前进行的化学固定和染色过程。NOA 71 和 NOA 81 树脂均可使用，且结果相似。初始的 PDMS 模具可多次用于制备 NOA 复制品。所获得的 NOA 复制品可在室温下保存于容器中，保存时间可达数月。
  2. 支撑脂双层的制备及蛋白质孵育
    1. 使用空气等离子清洗机处理NOA薄膜5分钟，以使表面具有亲水性。
    2. 制备摩尔组成为57% EggPC、15% 胆固醇、10% DOPE、10% DOPS 和 8% 脑磷脂酰肌醇(4,5)P的小单层囊泡（SUVs）溶液2 在总脂质浓度为 1 mg·mL 的条件下-1通过将干燥的脂质膜在观察缓冲液中重新悬浮来制备小单层囊泡（SUVs），具体步骤如2.1.3所述。使用水浴超声仪轻轻超声处理溶液5-10分钟，直至溶液透明。
      注意：SUV 溶液可在 -20°C 冻存数周20 °C.
    3. 将承载 NOA 图案的盖玻片插入细胞培养板的孔中。加入 100 µL 1 mg·mL⁻¹-1 将 SUV 溶液加入 freshly glow-discharged 的 NOA 图案（步骤 3.2.1）上，室温孵育 30 分钟。此步骤可诱导 SUV 与 NOA 图案表面融合，形成支撑脂质双层。
    4. 用 septin 缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8]，50 mM KCl，2 mM MgCl₂）将载玻片彻底冲洗 6 次2）以去除未融合的 SUV。每次清洗后，切勿让样品完全干燥。
    5. 将八聚体 septin 原液用 septin 高盐缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8]，300 mM KCl，2 mM MgCl₂）稀释2) 使用 septin 缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8]，50 mM KCl，2 mM MgCl2) 至终浓度为 10 nM 到 100 nM，体积为 1 mL。将蛋白溶液加入载玻片中，室温孵育约 1 小时。
      注意：体积足够大，因此无需担心蒸发问题。
  3. 用于扫描电镜分析的样品制备
    注意：已开发出多种电子显微镜技术用于分析蛋白质结构及其组装方式。本方案采用源自 Svitkina 等人的固定方法，以保持 septin 纤维的结构组织。30 易于实施。此外，该方案优化了高分辨率扫描电镜（SEM）观察。
    1. 试剂与储备液的配制
      注意：本实验方案需要多种试剂和溶液，可提前或在孵育前立即配制。请遵循所提供的操作说明，以避免产生干扰物质或化学反应不充分的情况。
      1. 0.2 M 二甲胂酸钠储备液：为配制此双倍浓度溶液，将 2.14 g 二甲胂酸钠粉末溶于约 40 mL 蒸馏水中，磁力搅拌至完全溶解。溶解完成后，缓慢加入 0.1 M HCl（约 1 mL 可调节 50 mL 溶液至 pH 7.4）调节 pH 至 7.4，再用蒸馏水定容至最终体积。该溶液可在 24–48 小时内保存于 4°C.
      2. 2% 戊二醛（GA）在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中的溶液（固定液）：使用前将高纯度电镜级戊二醛用 0.2 M 二甲胂酸钠溶液（见上文）稀释配制。建议采用 25%-50% 的市售戊二醛储备液，因其具有优化的储存稳定性 4 °C配制10 mL固定液：将0.8 mL 25%市售戊二醛溶液与4.2 mL蒸馏水和5 mL 0.2 M二甲胂酸钠缓冲液混合稀释。
      3. 1% 四氧化锇（OsO₄）4) 在 0.1 M 二甲胂酸钠中：使用前立即配制该第二固定剂溶液，通过将市售的 4% OsO4 储备液，含 0.2 M 戊二酸钠（见上文）。用于 4 mL OsO4 固定液，将1 mL 4%市售OsO₄溶液稀释4 用1 mL蒸馏水和2 mL 0.2 M二甲胂酸钠溶液配制。
        注意：使用市售的4% OsO4 由于可裂解玻璃安瓿瓶具有良好的储存和操作特性，因此将储备液存放于其中。请注意，OsO4 具有高反应性。确保其颜色为微黄色而非深色。
      4. 1% 鞣酸（TA）水溶液：使用前立即配制。将TA溶解于蒸馏水中，室温下配制成终浓度为1%的TA溶液。取10 mg TA溶于1 mL蒸馏水中，涡旋振荡数分钟。TA溶液不可储存，必须用 0.2 µm 使用前过滤。
      5. 1% 醋酸铀（UA）水溶液 配制 UA 溶液，使醋酸铀在蒸馏水中的终浓度为 1%。将 10 mg 溶解于 1 mL 蒸馏水中，在室温下涡旋或振荡至少 30 分钟至 1 小时。该溶液可在室温下保存 1 个月 4 °C 但容易析出沉淀，因此必须用滤器过滤 0.2 µm 使用前过滤。
      6. 梯度浓度乙醇溶液的配制 配制50%、70%、95%和100%的乙醇水溶液。最终浴液应使用新开封的100%乙醇试剂，或使用经分子筛（标称孔径 = 4 Å）脱水至少24小时的100%乙醇，以彻底去除可能干扰样品干燥和镀膜的微量水分。操作时避免摇动该溶液，以防硅酸盐颗粒重新悬浮。
        注意：操作本方案中使用的化学试剂时需格外小心。戊二醛、四氧化锇、二甲胂酸钠和醋酸铀酰均具有高毒性，其中醋酸铀酰还具有放射性。所有试剂及其废弃物的处理操作必须根据实验室特定规程，采取个体防护措施（手套、实验服、护目镜）和集体防护措施（通风橱和有机玻璃屏蔽装置）。
    2. 样品固定
      1. 用 PBS 清洗样品（即带有融合支撑脂双层并已孵育蛋白的 NOA 载玻片）。弃去 PBS，加入预热的 GA 固定液 37 °C 反应继续进行15分钟。随后样品可在 4 °C.
      2. 去除固定液，用 0.1 M 二甲胂酸钠溶液洗涤固定后的样品 3 次（每次 5 分钟），期间轻柔振荡。
      3. 将样品置于 OsO₄ 溶液中孵育4 用固定液避光保护10分钟，以固定膜结构并提高样品的导电性。移除固定液，用蒸馏水洗涤样品3次（每次5分钟），轻柔振荡。
      4. 将洗涤后的样品置于过滤后的TA固定液中孵育，时间不超过10分钟。移除TA溶液，用蒸馏水洗涤样品3次（每次5分钟），期间轻轻振荡。
      5. 将洗涤后的样品置于新鲜过滤的UA固定剂溶液中避光孵育10分钟。移除UA溶液，用蒸馏水洗涤样品3次（每次5分钟），期间轻轻振荡。
    3. 样品脱水与临界点干燥
      注意：为避免样品在由液态转变为气态时因产生非预期的表面张力而受损，不得采用空气干燥法。在电子显微镜技术中已建立两种方法：一种是通过物理手段使CO₂达到超临界状态的方法，2 并绕过其临界点（31 °C，74 bar）或采用六甲基二硅氮烷（HMDS）化学干燥法，后者是一种可降低表面张力的干燥剂。CO2 HMDS 与水互溶性差。因此，必须用过渡溶剂（乙醇）完全替换所有残留的水分，以避免在后续干燥过程中造成损伤。
      1. 将样品依次放入50%至100%（无水）乙醇溶液中，每种浓度乙醇溶液中孵育2-3分钟。
        注意：由于乙醇在更换溶液过程中蒸发迅速，必须快速处理样品，以避免任何空气干燥。
      2. 将载玻片转移至已预装乙醇的临界点干燥仪中，并按照制造商的说明进行操作。
        注意：本方案中使用了自动装置，但也可使用其他任何系统。不同装置的操作步骤可能有所差异，但必须优化以彻底去除乙醇（本方案中为25次浸泡），并在不同溶剂交换步骤（如CO2 入口和乙醇/CO2 出口）以及最终的减压过程（本方案中约需1小时）。
      3. 临界点干燥结束后，立即将样品存放在干燥器中，直至进行装样和镀膜。由于干燥后的样品具有很强的吸湿性，应尽快进行镀膜处理（见下文）。
        注意： alternatively，HMDS 可提供一种更廉价且快速的方法。尽管 HDMS 尚未在我们的样本上进行测试，但该方法在观察细胞膜内侧蛋白质时已获得良好的结果31,32.
    4. 样品安装与镀膜
      注意：由于生物样品的导电性能较差，因此在进行扫描电镜观察前需在其表面镀上一层导电金属膜。本实验采用等离子体-磁控溅射法进行镀膜。
      1. 将盖玻片固定在用于后续扫描电镜（SEM）观察的载物台（stubs）上。使用银漆，因其相较于碳导电盘具有更优的导电性。在盖玻片上表面涂上一条银漆，并确保其与载物台之间的连接良好。避免出现漆料团聚。
        注意：使用高分辨率（即短工作距离）时，银漆条必须尽可能薄，以避免样品与扫描电镜物镜之间发生接触。
      2. 等待溶剂完全蒸发。
        注意：此步骤所需时间可能因银漆涂覆量和厚度而异。可使用钟罩或镀膜仪配合初级真空处理10–30分钟以缩短时间。
      3. 使用配备等离子体-磁控溅射头和旋转-行星式样品台的设备，并遵循制造商提供的标准操作规程。此处，设备被抽真空至2.5 × 10⁻⁴ Pa。-5 毫巴，用高纯度氩气吹扫1次，然后调节至8.0 × 10-3 mbar
      4. 进行预溅射（120 mA，60 s）以去除表面氧化层。然后，在膜厚监测仪辅助下沉积1.5 nm的钨（90 mA，工作距离 = 50 mm）。
        注意：必须对镀膜设备进行彻底清洁，以确保薄膜蒸发的可重复性。一旦达到目标厚度，即应停止镀膜。最终的薄膜厚度将在镀膜完成后进行计算和校正。使用本设备时，约1.5 nm的薄膜平均校正值为0.7 nm。由于该校正值接近目标值，需进行一系列预镀膜实验以确定此校正值，并从目标值中扣除。
      5. 将样品在真空条件下保存，以保护其免受环境空气的影响，直至并贯穿整个扫描电镜分析过程。
        注意：用于溅射的金属材料性质至关重要。尽管铂（Pt）是一种常见材料，但在适配于 septin 丝状结构的铂膜厚度（1.5 nm）条件下，所得镀层质量较差。在高分辨率下，1.5 nm 的铂膜缺乏连续性，铂簇的尺寸与 septin 丝状结构相近，导致在丝状结构分割过程中产生误判。33 （参见 图2A，插图）。钨是铂的一种良好替代材料，因其晶粒尺寸更小，在高分辨率扫描电镜下几乎不可见（参见 图2B，插图）。然而，纯钨容易被氧化，如果未严格遵循步骤3.3.4中所述程序，将在SEM观察过程中导致严重的充电效应伪影。
  4. 使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）获取图像。
    注意：扫描电子显微镜（SEM）技术最近已升级以提高分辨率，且该技术取决于制造商（例如., 电子光学、束流减速、磁透镜）。这一分辨率的提升（多家厂商可提供），尤其是在低加速电压下（1 kV 时接近纳米级），对于解析类似 septin 网络的纳米级结构至关重要。
    1. 使用以下设置，通过“镜内”探测器检测一次二次电子（SE1），实现高分辨率成像。
    2. 将加速电压设为 3 kV。用束流调节器固定束流。 20 μm 光圈（适用于 Zeiss Gemini I 柱，或相当于 34 pA）或使用 15 μm 光圈（适用于 Zeiss Gemini I 柱体，或相当于 18.5 pA），若需抑制充电效应。
    3. 观察时采用 21.25 nm/像素至 1.224 nm/像素的分辨率，数据分析时采用约 5.58 nm/像素的分辨率（根据 Polaroid 545 标准对应 20,000 倍放大）。
    4. 将工作距离设置在1 mm至2 mm之间以进行高分辨率观察，若需要增大景深，则设置为约3 mm。持续调节扫描速度和线积分，以确保信噪比稳定，每幅图像的采集时间约为30–45秒。

扫描电子显微镜图像、植物表面的血细胞、科学分析。
图 2：沉积材料对波浪形 PDMS 模式中菌丝蛋白丝状结构的影响。 通过溅射涂覆的菌丝蛋白丝状结构的扫描电子显微镜图像，分别使用 (A) 1.5 nm 铂，显示出典型的“干旱开裂土壤”图案，表明铂核团之间缺乏内聚性；或 (B) 1.5 nm 钨，表面覆盖一层光滑且具有内聚性的薄膜。比例尺 = 200 nm。白色方框表示右下角的放大视图。球形小体为与菌丝蛋白相互作用的小型脂质囊泡。请点击此处查看本图的放大版本。

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结果

巨型囊泡（GUVs）的形变
在分裂酵母 septin 蛋白能够发生聚合的条件下，经 septin 孵育后发生形变的 GUVs 的典型共聚焦荧光图像如图3所示。裸露的 GUVs 呈完美的球形（图3A）。当与浓度超过 50 nM 的分裂酵母 septin 纤维孵育后，囊泡出现形变。当分裂酵母 septin 八聚体浓度达到 100 nM 时，囊泡呈现多面体状，且形变保持静态，无明显波动（图3B）。当分裂酵母 septin 浓度高于 200 nM 时，膜上 septin 达到饱和，此时观察到周期性形变（图3C）。使用分裂酵母 septin 时，观察到的突起结构周期在 2 µm 到 6 µm 之间，振幅约为 1 µm。因此，septin 以一种特异性的方式显著重塑膜结构。所观察到的形变振幅及其相应的曲率，惊人地反映了 septin 对细胞中微米级曲率的亲和性。由于 GU...

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讨论

如上所述，已使用一种脂质混合物，该混合物可增强PI(4,5)P2在脂双层中的掺入，从而促进septin与膜的相互作用。事实上，我们已在其他研究中表明25，出芽酵母的septin以PI(4,5)P2特异性方式与囊泡相互作用。该脂质组成是通过筛选多种组分后经验性优化确定的，目前已被作者广泛采用。PI(4,5)P2脂质需谨慎操作。储备液必须分装成小体积，确保每个小瓶用于移液操作不超过两次。此外，脂质分装样品应保存在氩气环境中，以防止脂质氧化。最后，一旦脂质混合物溶于水溶液，必须立即使用，不可保存用于后续实验。值得注意的是，在GUV重构或支撑脂双层融合后，septin与脂质之间的相互作用在2小时后显著减弱。

本文介绍了利用八聚体酿酒酵母分裂素复合物（包含Cdc10、Cdc11、Cdc12和Cdc3）所获得的部分结果；然而，分析其他物种分裂素复合物行为所采用的实验步骤应完全相同。

为了制备GUVs，我们更倾向于使用铂丝的电形...

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致谢

感谢 Patricia Bassereau 和 Daniel Lévy 提供的有益建议和讨论。本工作得到了法国国家研究署（ANR）对项目 "SEPTIME"（ANR-13-JSV8-0002-01）、ANR SEPTIMORF（ANR-17-CE13-0014）以及项目 "SEPTSCORT"（ANR-20-CE11-0014-01）的资助支持。B. Chauvin 的研究由巴黎大区物理博士学院 "ED564: Physique en Ile de France" 和法国医学研究基金会资助。K. Nakazawa 获得索邦大学（AAP Emergence）的支持。G.H. Koenderink 获得荷兰科学研究组织（NWO/OCW）通过“BaSyC-构建合成细胞”引力计划（024.003.019）的资助。我们感谢 Labex Cell(n)Scale（ANR-11-LABX0038）和巴黎科学与文学大学（Paris Sciences et Lettres，ANR-10-IDEX-0001-02）的支持。我们感谢居里研究所细胞与组织成像平台（PICT-IBiSA）的支持，该平台是法国国家研究基础设施法国生物成像（France-BioImaging，ANR10-INBS-04）的成员单位。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺Avanti Polar Lipids850725
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸Avanti Polar Lipids840035
浴式超声仪ElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-神经酰胺invitrogen, Thermo Fischer scientific11504726
化学试剂：NaCl、Tris-HCl、蔗糖、KCl、MgCl₂、B-酪蛋白、氯仿、二甲胂酸钠、单宁酸、乙醇Sigma Aldrich
共聚焦显微镜nikon转盘式或共聚焦显微镜
临界点干燥仪Leica microsystemsCPD300
去离子水发生器MilliQF1CA38083BMilliQ integral 3
蛋黄 L-α-磷脂酰胆碱Avanti Polar Lipids840051
场发射扫描电子显微镜（FESEM）Carl ZeissGemini SEM500
25% 戊二醛水溶液Thermo Fischer scientific50-262-19
高真空润滑脂，Dow corningVWR
IMOD 软件https://bio3d.colorado.edu/imod/用于倾斜系列图像配准和三维重建的软件套件
Lacey Formvar/碳支持膜电镜载网Eloise01883-F
脂质Avanti Polar Lipids
L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸Avanti Polar Lipids840046
金属蒸发仪Leica microsystemsEM ACE600
NOA（Norland 光学胶），NOA 71 和 NOA 81Norland ProductsNOA71, NOA81
4% 四氧化锇delta microscopies19170
渗透压仪Löser15 M
等离子清洗仪Alcatelpascal 2005 SD
等离子体发生器Electron Microscopy Science
冷冻投入仪leica microsystemsEMGP
透射电子显微镜ThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
醋酸铀酰Electron Microscopy Science22451该产品已不再提供购买
石蜡板，VitrexVWR

参考文献

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自下而上法 体外 检测Septin超微结构组织、膜重塑及曲率敏感行为的方法
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