自下而上法 体外 检测Septin超微结构组织、膜重塑及曲率敏感行为的方法

摘要

Septins 是细胞骨架蛋白。它们可与脂质膜相互作用，并能够在微米尺度上感知甚至产生膜曲率。本实验方案中，我们描述了自下而上的体外（in vitro）方法，用于分析膜形变、对曲率敏感的 septin 结合行为以及 septin 丝状结构的超微结构。

摘要

膜重塑在质膜及细胞器内持续发生。为了全面解析环境（离子条件、蛋白质与脂质组成、膜曲率）以及与特定膜重塑过程相关的不同组分在其中所起的作用，我们开展 体外 自下而上的方法。近年来，人们高度关注揭示与重大疾病相关联的septin蛋白的作用。septin是一类必需且广泛存在的细胞骨架蛋白，可与质膜相互作用，在细胞分裂、细胞运动、神经元形态发生以及精子形成等多种生物学功能中发挥重要作用。因此，理解septin如何在膜上相互作用并组装，进而诱导膜形变，以及其如何对特定膜曲率产生响应，具有重要意义。本文旨在解析septin在分子水平上的超微结构与其在微米尺度上介导的膜重塑过程之间的相互关系。为此，研究中重组表达了芽殖酵母和哺乳动物的septin复合物，并进行了纯化。结合多种技术手段 体外 随后利用这些检测方法分析了膜上 Septin 的自组装行为。通过支持性脂双层（SLBs）、巨型单层囊泡（GUVs）、大单层囊泡（LUVs）以及波状基底，研究 Septin 自组装、膜重塑与膜曲率之间的相互作用。

引言

Septins 是一类可形成细胞骨架丝状结构的蛋白质，能够与脂质膜相互作用。Septins 广泛存在于真核生物中，对多种细胞功能至关重要。它们已被确认为芽殖酵母和哺乳动物细胞分裂的主要调控因子^1,2。它们参与膜重塑过程、纤毛发生³以及精子形成⁴。在哺乳动物细胞内，Septins 还能以 Rho GTP 酶结合蛋白（BORG）依赖的方式与肌动蛋白和微管相互作用^5,6,78。在多种组织（如神经元⁹、纤毛³、精子¹⁰）中，Septins 被证实是膜结合组分扩散屏障的调控因子¹¹。此外，Septins 还被证明可调控膜出泡和突起形成¹²。作为多功能蛋白，Septins 的异常与多种常见疾病的产生相关¹³，其失调与癌....

方案

1. 利用巨大单层囊泡（GUVs）测定膜重塑

注意：本部分通过制备大单层脂质体（GUVs）来模拟细胞环境中可能由 septins 诱导的膜形变。事实上，在细胞中，septins 常出现在具有微米级曲率的区域。GUVs 的尺寸范围为数微米至数十微米，且具有可变形性，因此适用于检测任何微米尺度下 septins 所诱导的膜形变。实验中使用荧光标记的脂质以及荧光标记的 septins（通过绿色荧光蛋白 [GFP] 标记），以同时追踪脂质与蛋白质的行为。 通过 荧光显微镜技术

1. 缓冲液和溶液的制备
   1. 配制GUV生长缓冲液（50 mM NaCl、50 mM 蔗糖和10 mM Tris [pH = 7.8]）以及观察缓冲液（75 mM NaCl和10 mM Tris [pH = 7.8]）。
   2. 使用商用渗透压计测量并调节观察缓冲液和生长缓冲液的渗透压（理论值为170 mOsmol·L^-1），通过添加少量NaCl使两者的渗透压相等。使用0.2 µm滤膜过滤缓冲液。将生长缓冲液分装后于-20 °C保存以备后续使用。观察缓冲液则于4 °C保存。
      注意：两种缓冲液之间的渗透压差异不应超过5%。
   3. 在观察缓冲液中配制浓度为5 mg·mL^-1的β-酪蛋白溶液。确保完全溶解（在4 °C下磁力搅拌数小时）。用0.2....

结果

巨型囊泡的形变
在分裂蛋白能够发生聚合的条件下，经分裂蛋白孵育后发生重塑的巨型囊泡（GUVs）的典型共聚焦荧光图像如图3所示。裸露的GUVs呈完美的球形（图3A）。当与浓度超过50 nM的芽殖酵母分裂蛋白丝孵育后，囊泡出现形变。当芽殖酵母分裂蛋白八聚体浓度达到100 nM时，囊泡表面呈现多面体状，且形变保持静态，无明显波动（图3B）。当芽殖酵母分裂蛋白浓度超过200 nM，膜上分裂蛋白趋于饱和时，可观察到周期性形变（图3C）。使用芽殖酵母分裂蛋白时，可观察到具有周期性（2 µm至6 µm）且振幅约为1 µm的突起结构。因此，分裂蛋白能以特定方式强烈重塑膜结构。所观察到的形变振幅及其对应的曲率，显著反映了分裂蛋白对细胞中微米级曲率的亲和性。由于GUVs具有可变形性，因此非常适合用于检测蛋白质如何重塑膜结构。

讨论

如上所述，已使用一种脂质混合物，该混合物可增强PI(4,5)P₂在脂双层中的掺入，从而促进septin与膜的相互作用。事实上，我们已在其他研究中表明²⁵，出芽酵母的septin以PI(4,5)P₂特异性方式与囊泡相互作用。该脂质组成是通过筛选多种组分后经验性优化确定的，目前已被作者广泛采用。PI(4,5)P₂脂质需谨慎操作。储备液必须分装成小体积，确保每个小瓶用于移液操作不超过两次。此外，脂质分装样品应保存在氩气环境中，以防止脂质氧化。最后，一旦脂质混合物溶于水溶液，必须立即使用，不可保存用于后续实验。值得注意的是，在GUV重构或支撑脂双层融合后，septin与脂质之间的相互作用在2小时后显著减弱。

本文介绍了利用八聚体酿酒酵母分裂素复合物（包含Cdc10、Cdc11、Cdc12和Cdc3）所获得的部分结果；然而，分析其他物种分裂素复合物行为所采用的实验步骤应完全相同。

为了制备GUVs，我们更倾向于使用铂丝的电形.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺	Avanti Polar Lipids	850725
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸	Avanti Polar Lipids	840035
浴式超声仪	Elma		Elmasonic S10H
Bodipy-TR-神经酰胺	invitrogen, Thermo Fischer scientific	11504726
化学试剂：NaCl、Tris-HCl、蔗糖、KCl、MgCl₂、B-酪蛋白、氯仿、二甲胂酸钠、单宁酸、乙醇	Sigma Aldrich
共聚焦显微镜	nikon		转盘式或共聚焦显微镜
临界点干燥仪	Leica microsystems		CPD300
去离子水发生器	MilliQ	F1CA38083B	MilliQ integral 3
蛋黄 L-α-磷脂酰胆碱	Avanti Polar Lipids	840051
场发射扫描电子显微镜（FESEM）	Carl Zeiss		Gemini SEM500
25% 戊二醛水溶液	Thermo Fischer scientific	50-262-19
高真空润滑脂，Dow corning	VWR
IMOD 软件	https://bio3d.colorado.edu/imod/		用于倾斜系列图像配准和三维重建的软件套件
Lacey Formvar/碳支持膜电镜载网	Eloise	01883-F
脂质	Avanti Polar Lipids
L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸	Avanti Polar Lipids	840046
金属蒸发仪	Leica microsystems		EM ACE600
NOA（Norland 光学胶），NOA 71 和 NOA 81	Norland Products	NOA71, NOA81
4% 四氧化锇	delta microscopies	19170
渗透压仪	Löser		15 M
等离子清洗仪	Alcatel		pascal 2005 SD
等离子体发生器	Electron Microscopy Science
冷冻投入仪	leica microsystems		EMGP
透射电子显微镜	Thermofischer		Tecnai G2 200 kV, LaB6
醋酸铀酰	Electron Microscopy Science	22451	该产品已不再提供购买
石蜡板，Vitrex	VWR