利用微流体和荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝和束的组装动力学

Summary

我们提出了简单的肌动蛋白丝微流体测定方案，结合荧光显微镜，使人们能够实时准确地监测单个肌动蛋白丝，同时按顺序将它们暴露于不同的蛋白质溶液中。

Abstract

为了破译调节肌动蛋白细丝组装和拆卸的复杂分子机制，在良好控制的条件下监测单个反应是一项重要资产。为此，在过去的20年中出现了实时单丝实验，主要使用全内反射荧光（TIRF）显微镜，并提供了大量关键结果。2011年，为了进一步扩大这些实验的可能性并避免反复出现有问题的伪影，我们在这些测定中引入了简单的微流体。本研究详细介绍了我们的基本方案，其中单个肌动蛋白细丝由一端锚定在钝化的盖玻片表面上，与流动对齐，并且可以连续暴露于不同的蛋白质溶液中。我们还介绍了特定应用的协议，并解释了如何施加受控的机械力，这要归功于流动溶液的粘性阻力。我们强调了这些实验的技术警告，并简要介绍了基于该技术的可能发展。这些方案和解释，以及当今易于使用的微流体设备的可用性，应该允许非专业人员在其实验室中实施该测定。

Introduction

肌动蛋白长丝和肌动蛋白丝网络的组装和拆卸由几种生化反应控制，并取决于机械环境。为了深入了解这些复杂的机制，能够观察单个细丝上的单个反应（足够大的数量）是非常宝贵的。在过去的几十年中，实时观察动态肌动蛋白丝，主要使用全内反射荧光（TIRF）显微镜，已成为一项关键技术，并提供了令人印象深刻的结果列表，这些结果无法通过本体溶液生化测定¹获得。

为了实现这一点，需要将荧光标记的肌动蛋白丝保持在显微镜盖玻片表面附近，同时将它们暴露于肌动蛋白结合蛋白（ABP）的溶液中，这些溶液也可以进行荧光标记。这样做提供了一种在良好控制的生化条件下监测单个细丝上发生的事件的方法，从而量化反应速率。但是，应考虑一些具体的限制。人为地保持细丝靠近表面，通常由于多个锚定点或使用拥挤剂如甲基纤维素，可以改变它们的行为（例如，导致其聚合和解聚的暂停²）。跟踪每根灯丝的轮廓可能具有挑战性，特别是如果新的灯丝或灯丝碎片随着时间的推移在视野中积聚。反应发生在有限的体积中，其中肌动蛋白单体和ABP的浓度会随时间变化，可能难以获得准确的速率常数。最后，更新或改变ABP的溶液很难在不到30秒的时间内实现，并且通常会导致样品中的蛋白质含量不均匀。

10多年前，受到已经完成的单个脱氧核糖核酸（DNA）链³的启发，我们引入了一种基于....

Protocol

1. 微流控室制备

1. 选择具有多个腔室图案的SU-8主模具。典型的腔室是十字形的，有三个入口和一个出口，高20μm，宽800μm（图1）。这种母模可以从外部公司购买或在学术实验室制造（例如，Gicquel，Y.等^人5）。
2. 将胶带放在模具边缘周围。
   1. 将约50厘米长，19毫米宽的标准透明办公胶带（见 材料表）放在长凳上，粘性面朝上。将模具垂直放置在胶带的一端和中线。
   2. 将模具卷到胶带的另一端，在模具周围形成一个1厘米的边框。将胶带折叠在模具底部。
3. 制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。
   1. 在一次性称重盘中，直接倒入25-30克PDMS底座（材料表）。用一次性塑料巴斯德移液器加入10%重量/重量的PDMS固化剂（材料表）。
   2. 用塑料棒手动彻底混合。确保固化剂充分掺入PDMS基质中，即使搅拌会产生大量气泡。
4. 在室温（RT）下将PDMS溶液在真空干燥器（材料表）中脱气至少5分钟。气泡会膨胀，上升到表面，并在真空被打破时破裂。
5. 将 PDMS 溶液倒在 SU....

Results

对于上述所有实验，荧光标记的肌动蛋白丝应清晰可见，具有良好的对比度，表明表面的背景荧光较低（图4，请参阅 补充文件1 以解决常见问题）。肌动蛋白细丝也不应粘附在表面上:当显性流速较低时，当观察它们活着时，肌动蛋白丝的横向波动应该是可感知的，并允许人们清楚地确定它们仅由其末端之一锚定。同样，当使用TIRF成像时，它们的垂直波动应该通过其长度和时间的强度变化可见。根据施加的流速，可能需要调整TIRF穿透深度，以优化TIRF获取的肌动蛋白丝的图像质量。

当长丝暴露于聚合条件（见第8节）时，长丝伸长率应规则（即，细丝末端的伸长率不受表面相互作用或永久粘附的阻碍）。此外，根据管^内肌动蛋白浓度1^，20测量的细丝倒钩端伸长率应与预期值相匹配，表明管溶液已正确流向微流控室（图4A）。同样，当暴露于缓冲溶液中时，灯丝应以反映其ADP.......

Discussion

与标准的单丝方法相比，肌动蛋白细丝沿其长度通过多个点锚定在表面上或通过甲基纤维素等拥挤剂保持靠近表面，微流体具有许多优点。由于与表面的相互作用很小，因此避免了在伸长和解聚过程中这些相互作用可能引起的人为停顿。灯丝按流动对齐，彼此平行，便于监控和测量长度。细丝周围的溶液不断更新，使它们暴露于恒定的蛋白质浓度。能够在细丝暴露的不同蛋白质溶液之间快速（<1秒， 图3D，E）切换，可以进行时间控制的序贯实验，这通常有助于动力学研究。最后，可以利用流动溶液对灯丝施加的粘性阻力，在灯丝上施加受控的机械应力（代表性结果部分）。应该注意的是，中等流体流动（中流 压力设置）使细丝足够接近表面（〜250nm），以便用TIRF有效地成像它们，同时产生最小的张力（<1 pN）¹⁴。

然而，与经典的单丝测定相比，微流体将需要更大体积的蛋白质溶液:通常为几100μL，而标准实验可以用少于10μL完成。当使用珍贵的蛋白质时，这可能是一个限.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-酪蛋白	Merck	C6905	用于 8 mg/mL
活检穿刺器（带柱塞）	Ted Pella	15115-2	内径 0.75 mm，外径 1.07 mm
生物素-BSA	Merck	A8549	用于 1 mg/mL
BSA	Merck	A8022	用于 50 mg/mL
盖玻片 Mini-Rack Teflon 支架	Invitrogen	C14784	用于 8盖玻片
盖玻片 22x40mm 厚度 #1.5	Menzel Gläser	631-1370
DABCO	Merck	D27802	成分在 f 缓冲液中
DTT	Euromedex	EU0006-D	成分在 f 缓冲液中
NHS Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000	荧光团，用于 Lys328 上的肌动蛋白标记。
EZ-Link Sulfo-NHS-生物素	Thermo Scientific	21338	在 Lys328 上生物素化肌动蛋白
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507	玻璃清洁剂
ImageJ	NIH	N/A	开源软件
Laboport	KNF	811kn.18	真空泵（极限真空：240 mbar）
魔术隐形胶带	Scotch	7100024666	标准透明办公胶带
Micrewtube	Simport	T341-6T	2 mL 微流体储液管
微流体装置 第 1 部分：流量装置 S	Fluigent	FLUIGENT FLU-S-D-PCKB	流量计
微流体装置 第 2 部分：Fluiwell-4C-2 mL	Fluigent	14002001PCK	储液器支架
微流体装置 第 3 部分：MFCS-EZ	Fluigent	EZ-11000001 EZ-00345001	压力控制器
42 型 - UVO-Cleaner	Jelight Inc.	42-220	紫外线清洁剂
N6-（6-氨基己基）-ATP-ATTO-488	Jena Bioscience	NU-805-488	ATP-ATTO 用于标记肌动蛋白
中性亲和素	Thermo Scientific	31000
PLL-PEG	SuSoS	PLL（20）-g[3.5]-PEG（2）	在 PBS 中使用浓度为 1 mg/mL。
聚二甲基硅氧烷 （PDMS） Sylgard 184 硅弹性体	道康宁	1673921	含有 PDMS 基础和固化剂
聚醚醚酮 （PEEK） 管	默克	Z226661	"蓝色"： 内径 = 0.25 毫米
安全吹尘枪	Coilhose 气动	700-S	过滤空气
硅管	VWR	228-0701P	将 ELITE 连接到耦合器
不锈钢导管耦合器	Prime Bioscience	SC22/15	插入 PDMS 入口和出口，以连接到 PEEK 管
热塑性薄膜	Sigma Aldrich	PM996	标准"封口膜"
超纯乙醇	VWR	64-17-5
超声波清洗槽	VWR	USC200TH	可容纳 1 L 烧杯
真空干燥器	SP Bel-Art	F42022-0000	对 PDMS 或溶液进行脱气