利用微流控技术与荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝及其束状结构的组装动力学

摘要

我们介绍了简单的肌动蛋白丝微流控实验方案，结合荧光显微镜技术，可实时准确监测单个肌动蛋白丝，并依次将其暴露于不同的蛋白质溶液中。

摘要

为了阐明调控肌动蛋白丝组装与解聚的复杂分子机制，在严格控制的条件下实时监测单个反应过程具有重要意义。为此，过去20年来发展出了活细胞单丝实验技术，主要采用全内反射荧光（TIRF）显微镜，获得了大量关键性研究成果。2011年，为了进一步拓展此类实验的可能性并避免反复出现的技术性伪影，我们在这些实验中引入了简单的微流控技术。本研究详细描述了我们的基本实验方案：将单个肌动蛋白丝一端锚定于经过钝化处理的盖玻片表面，在流动作用下使其定向排列，并可依次暴露于不同的蛋白质溶液中。我们还介绍了特定应用的实验方案，并解释了如何利用流动溶液的黏性拖拽力施加可控的机械力。我们强调了这些实验中的技术注意事项，并简要展望了基于该技术的可能发展方向。结合当前易于使用的微流控设备，这些实验方案与说明应有助于非专业研究人员在各自实验室中建立并实施该技术。

引言

肌动蛋白丝及其网络结构的组装与解聚受到多种生化反应的调控，并依赖于机械环境。为了深入理解这些复杂的机制，能够观察到单个肌动蛋白丝上的单个反应（在足够大的数量下）具有极其重要的价值。在过去的几十年中，利用全内反射荧光（TIRF）显微镜实时观察动态肌动蛋白丝已成为一项关键技术，获得了大量无法通过传统的溶液生化实验所取得的研究成果¹。

为实现这一点，需要将荧光标记的肌动蛋白丝维持在显微镜盖玻片表面附近，同时使其暴露于肌动蛋白结合蛋白（ABPs）溶液中，这些蛋白也可带有荧光标记。这样做可在严格控制的生化条件下监测单根肌动蛋白丝上发生的事件，从而量化反应速率。然而，需考虑若干特定限制因素。通过多个锚定点或使用甲基纤维素等拥挤剂人为地将肌动蛋白丝维持在表面附近，可能改变其行为（例如导致其聚合与解聚过程出现暂停²）。追踪每根肌动蛋白丝的轮廓可能具有挑战性，特别是当随着时间推移，视野中不断积累新的肌动蛋白丝或丝段时。反应发生在有限体积内，肌动蛋白单体和ABPs的浓度可能随时间变化，这可能导致难以准确推导反应速率常数。最后，在少于30秒内更换或更新ABPs溶液难以实现，且通常会导致样品中蛋白质分布不均。

大约10多年前，受到已有研究单个脱氧核糖核酸（DNA）链方法的启发³，我们引入了一种基于微流控技术的新方法，用于观察和操控单个肌动蛋白丝⁴。该方法能够规避上述传统单丝技术的局限性。在这些微流控实验中，肌动蛋白丝从吸附在盖玻片上的血影蛋白-肌动蛋白种子上生长出来。因此，丝状物仅一端固定于微流控腔室底部，并在表面之上自由波动而不会粘附。在流入溶液的流动作用下，丝状物会沿流动方向排列，从而便于监测其轮廓长度，并使其保持在盖玻片上方较浅的区域，以便使用全内反射荧光（TIRF）显微技术。不同的溶液可同时流入腔室但互不混合，从而使丝状物能够依次快速地暴露于不同溶液中。

本文提出了一系列在实验室中建立单根肌动蛋白丝微流控实验的基本方案。盖玻片和微流控腔室可预先制备（耗时约半天），而实验本身可在不到一天的时间内完成，期间可同时测试多种不同的生化条件。

方案

1. 微流控芯片的制备

1. 选择一个带有多个腔室图案的SU-8母模。典型的腔室为十字形，具有三个入口和一个出口，高度为20 µm，宽度为800 µm（图1）。此类母模可从外部公司购买，或在学术实验室中制备（例如 Gicquel, Y. 等人⁵）。
2. 在模具边缘贴上胶带。
   1. 将长约50 cm、宽19 mm的标准透明办公胶带（见材料表）平放在实验台上，粘性面朝上。将模具垂直放置于胶带一端，并沿胶带中线对齐。
   2. 将模具沿胶带滚动至另一端，使模具周围形成约1 cm的边框。将胶带向下折叠，覆盖模具底部。
3. 制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。
   1. 在一次性称量皿中直接倒入25–30 g PDMS基体（材料表）。使用一次性塑料巴斯德吸管加入10%（质量/质量）的PDMS固化剂（材料表）。
   2. 用塑料棒手动充分混合。确保固化剂完全混入PDMS基体中，即使搅拌过程中产生大量气泡也需继续搅拌。
4. 将PDMS溶液置于真空干燥器（材料表）中，在室温（RT）下脱气至少5分钟。当真空释放时，气泡会膨胀、上升至表面并破裂。
5. 将PDMS溶液倒入SU-8母模上。使用塑料棒刮取并尽可能转移全部混合物。
6. 对PDMS进行第二次脱气（在真空干燥器中5分钟），确保大部分气泡被去除（顶部表面残留少量小气泡可接受）。
7. 将模具放入70 °C的烘箱中至少5小时，使PDMS交联并固化。
8. 从模具上取下固化的PDMS腔室。
   警告：用于SU-8模具的硅晶圆极为脆弱，因此在将PDMS与晶圆分离时必须格外小心。操作应在坚硬、平整的表面上进行，并始终保持晶圆平放。
   1. 使用剃刀刀片在PDMS上做环形切割，切割位置距离模具边缘约1 cm。所有图案必须位于切割线内至少0.5 cm处。轻轻拉扯，小心剥离中央的PDMS块。
      警告：剥离时，应保持SU-8模具平放在实验台上，以防其破裂。
   2. 将PDMS放置在洁净的铝箔上，使成型面朝向铝箔，以保护其表面免受灰尘污染，并使图案更清晰可见。
9. 使用剃刀刀片选择并切割距离图案至少0.5 cm的腔室区域。最终得到的PDMS块高度约为0.5 cm，宽度1.5 cm，长度3 cm。使用内径为0.75 mm的活检打孔器（材料表）穿刺出三个入口和一个出口。
10. 用超纯乙醇（材料表）清洗PDMS腔室，并使用安全吹气枪（材料表）吹干。将PDMS图案面朝上放置于洁净的培养皿中，并盖上皿盖。

2. 玻璃盖玻片清洗

注意：此处详细介绍了一种基于系列超声处理步骤的标准盖玻片清洗流程。其他玻璃盖玻片清洗方法在许多已发表的文献中均有描述，亦可获得类似的满意结果^6,7,8,9。

1. 将10–20个盖玻片（40 mm长）放置在聚四氟乙烯（PTFE）支架上（材料表）。在1 L玻璃烧杯中，用0.5 L的2%玻璃清洗液（材料表）对盖玻片进行超声处理（35 °C，30 min）。
2. 弃去玻璃清洗液，并用去离子水（dH2O）至少分三次、每次0.5 L对盖玻片进行充分漂洗。
3. 在1 L玻璃烧杯中配制0.5 L的2 M KOH溶液。将盖玻片置于KOH溶液中进行超声处理（室温，30 min）。弃去KOH溶液，并用去离子水（dH2O）至少分三次、每次0.5 L对盖玻片进行漂洗。
   注意：请使用适当的实验室安全防护设备（手套、护目镜和实验服）。
4. 将盖玻片转移至0.5 L超纯乙醇中并进行超声处理（室温，30 min）。盖玻片可在乙醇中保存最多2周。使用热塑性薄膜（材料表）封住烧杯口以防止乙醇挥发。使用前，用气流将盖玻片吹干。

3. PDMS 腔室组装

1. 将加热板预热至 100 °C。将最多三个清洁的 PDMS 腔室和玻璃盖玻片放入一个洁净的培养皿中。将敞开的培养皿置于深紫外（UV）清洗仪（λ = 185 nm，参见材料表）中，紫外照射 3–5 分钟。
   注意：也可选择将 PDMS 腔室和盖玻片暴露于空气或氧气等离子体中处理 30 秒。
2. 轻柔地将 PDMS 腔室置于盖玻片上方，确保相互接触的两个表面均已直接暴露于紫外光下。PDMS 会自动粘附于玻璃表面，腔室轮廓将变得清晰可见。
3. 为排除 PDMS 与盖玻片界面间残留的空气，可用手指非常轻柔地按压表面。若需更牢固的结合，可对角落和边缘稍加用力按压。注意确保腔室的顶部不与玻璃表面接触。
4. 将腔室底部朝下放置于 100 °C 的加热板上，持续 5 分钟。此步骤完成后，玻璃与 PDMS 之间的键合即为永久性，腔室仅可使用一次。应立即使用，或将其置于洁净的培养皿中保存，最多可保存一周。

4. ［可选］直接钝化与功能化

注意：根据具体应用，可在将腔室连接至微流控控制装置（参见材料表）后进行钝化和功能化处理，也可在连接前通过移液枪直接向腔室内注入溶液完成处理。后者的优势在于可减少试剂消耗，并避免溶液流经微流控装置的聚醚醚酮（PEEK）管路时可能带来的污染。在以下所有步骤中，均通过将移液枪枪头直接插入出口处注入溶液。为避免在腔室内产生气泡，插入枪头时应确保枪头末端带有微小液滴；同样，在溶液尚未完全注入前即应拔出枪头。

1. 注入 20 µL PLL-PEG（1 mg/mL，溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中），室温下孵育至少 1 小时（或过夜）。为防止蒸发，将 PDMS 腔室置于湿盒中（例如，将水加入空的枪头盒下层 compartment，PDMS 腔室置于枪头架平台上）。
2. 注入 20 µL 100 pM 血影蛋白-肌动蛋白成核种子（溶于 F-buffer，参见 表 1 和 表 2），等待时间不超过 1 分钟。通过调整成核种子浓度和孵育时间，调控其表面密度，使其足够高以获得良好的统计量，同时足够低以避免丝状结构相互重叠。
   注意：若无血影蛋白-肌动蛋白成核种子，可选用经生物素修饰的短片段肌动蛋白丝，将其固定于链霉亲和素包被的盖玻片上^9,10。
3. [可选] 注入 20 µL 5% 牛血清白蛋白（BSA）溶于 F-buffer 的溶液，室温放置 10 分钟。
4. [可选] 注入 20 µL 1 mg/mL β-酪蛋白溶于 F-buffer 的溶液，室温放置 10 分钟。
   注意：可执行步骤 4.3 和/或 4.4 以进一步钝化腔室表面。钝化试剂的选择取决于所用蛋白，且对不同肌动蛋白结合蛋白（ABPs）的效果可能不同。若仅使用肌动蛋白，PLL-PEG 或 BSA 即可满足要求。

5. 连接微流控装置

注意：使用最多具有四个通道的压力驱动型微流控系统，以控制微流控腔室中的流体流动（图1A，参见材料表）。为避免微流控管路中产生气泡并干扰流体稳定性，需对所有溶液进行脱气处理。取5 mL的dH₂O和10 mL的F缓冲液母液，置于连接真空泵的真空干燥器中（最终真空度<250 mbar），在室温下脱气至少1小时。

1. 用去离子水冲洗进液管和出液管₂O（500 µL，300 mbar）
2. 加满所有 2 mL 储液管（参见 材料表用 300 µL F 缓冲液冲洗，将压力设为 300 mbar，弃去前五到八滴。每个通道均重复此操作，然后将压力设为 0。
3. 连接出口并彻底冲洗腔室。
   1. 将储液管4（出口）的压力设定为50 mbar。当管路末端出现液滴时，将管路连接至PDMS腔室的出口。液体将充满腔室并从所有入口流出。
   2. [可选] 如果腔室已直接钝化（第4节），将压力设为100 mbar，用50–100 µL F缓冲液冲洗腔室（3–5分钟）。用擦拭纸清除入口处的多余液体。
   3. 将压力设定为 20 mbar。
4. 连接入口。
   1. 将储液管1的压力设置为50 mbar。为避免引入气泡，确保有液滴从管路和PDMS入口处流出。
   2. 将管路连接至入口1（连接时会出现两个液滴合并的现象）。设置压力为30 mbar。
   3. 重复步骤 5.4.1–5.4.2，连接入口 2 和 3。
5. 将所有入口压力设置为 20 mbar，出口压力设置为 0 mbar。确保各入口的流速大致相等（参见故障排除部分）。

图1：通过微流控腔室注入溶液。（A）用于单根肌动蛋白丝实验的标准微流控装置。将蛋白溶液置于1-3号储液池中，通过调节气相压力将其推入腔室。流动速率由流量计测量。在微流控腔室内，溶液不会混合，其占据空间取决于所施加的相对压力（此处为所有入口施加相等压力）。典型尺寸：储液管最多可容纳2 mL溶液。PEEK管（内径0.25 mm）在经过10 cm管路后连接储液池与流量计，再经过另外70 cm后连接PDMS腔室。硅胶管和不锈钢管接头用于连接PEEK管与PDMS入口。主微流控通道高20-60 µm，宽约1 mm，长1 cm。（B,C）微流控腔室内的流动剖面。（B）流体在通道高度方向上形成抛物线型流速分布：v(z) = 6z(h-z)R/h³w，其中h和w分别为腔室的高度和宽度，R为总流速。底部：从表面锚定的血影蛋白-肌动蛋白种子聚合而成的单根肌动蛋白丝。（C）当腔室宽度远大于其高度时，除在PDMS表面流速为零外，腔室内流动几乎均匀。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 使用标准流速配置装置

注意：计算机控制的压力系统可轻松精确地调节连接到PDMS腔室的所有入口/出口的压力，从而控制流入和流出的流速。预设配置可保存，并通过单击鼠标一键开启或关闭。以下是推荐的配置（除非另有说明，出口压力设为0 mbar）。有关这些预设配置的预期流速，请参见表3。此处指示的压力需根据腔室几何形状和系统配置进行相应调整。

1. 更换：在更换一个或多个储液器时使用此预设程序。它会在目标管路中产生轻微的反向流，以防止引入气泡。
   1. 将所有入口压力设为 12 mbar，出口压力设为 5 mbar（图 2B）。
2. 高流速“全部”：使用此预设程序可快速并行注入三种溶液。溶液将在 4 分钟内到达腔室。
   1. 将所有入口压力设为 150 mbar。
3. 高流速“x”：使用此预设程序可快速注入一种溶液。溶液将在 3 分钟内到达腔室（图 3A-C）。
   1. 将入口“x”的压力设为 150 mbar（约 15 µL/min）。其他入口的压力调整至约 100 mbar，使其在这些入口中的流速约为 500 nL/min。
4. 中等流速“全部”：使用此预设程序以暂停系统运行。
   1. 将所有入口压力设为 20 mbar（图 2A）。
5. 中等流速“x”：使用此预设程序可使溶液“x”填充主通道的大部分宽度（见 图 2C,D），同时将其他入口的溶液限制在通道两侧。因此，腔室中的肌动蛋白丝将仅暴露于由溶液“x”设定的生化环境。
   1. 将入口“x”的压力设为 12 mbar。将其他入口的压力调整至约 9 mbar，使其各自的流速约为 150 nL/min。

图 2：施加到每个储液池的压力控制微流控腔室内溶液的分配/空间分布。（A）当对储液池施加相等压力时，每种溶液占据腔室的三分之一。（B）当更换某一储液池的管路（此处为储液池 3）时，有效压力降至零，从而产生反向流动。（C,D）增加某一储液池的相对压力，可使玻璃表面仅接触单一溶液。通过在中间流动 1（C）和中间流动 2（D）两种配置之间切换，可使腔室中央视野依次暴露于溶液 1 和溶液 2。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 更换溶液 'x'

注意：如图3A-C所示，需注意溶液从储液管流至芯片主通道需要数分钟时间。该最小“死区”时间由管路中液体体积及管路内的流动特性所决定（图3A-C）。

1. 在新的储液管中准备 200–300 µL 溶液。将压力设置为 Change 模式（见第 6 节）。
2. 拧下入口“x”的储液管。管路中的溶液将从腔室向管路末端缓慢回流。测得的流速变为负值（图 2B）。
3. 当管路末端形成微小液滴后，旋入装有新鲜溶液的新管。一旦管子正确拧紧至压力系统，该入口的流速将恢复为正值。
4. 将压力设置为 High Flow 'x'。
5. 根据微流控装置的构型和腔室几何形状，等待 3–5 分钟，使溶液完全充满管路并到达腔室。
6. [可选] 可通过随时间测量荧光强度的增加来监测此过程（图 3C）。

图3：溶液从储液器到达PDMS腔室的延迟，以及生化条件的快速变化。 (A-C溶液从储液器延迟到达PDMS腔室。 （A） 根据腔室几何形状、管路长度以及入口处施加的压力，一种溶液替换另一种溶液的过程并非瞬时完成。在将储液管更换为含有荧光溶液的管路后（0 分钟），溶液逐步充满管路（0.4 分钟）和 PDMS 腔室（1–2 分钟）。上述时间指示基于以下条件：施加压力为 150 mbar，PEEK 管路长度为 80 cm，PDMS 腔室宽度为 1600 µm，高度为 20 µm。 (B) PEEK 管道内的抛物线流速分布会在管道径向剖面及腔室内产生有效的荧光梯度（另见 图1B). (C通过测量样品室中背景表层荧光信号随时间的变化，可定量评估溶液到达的延迟情况。实验条件：使用流量计和80 cm PEEK管，以150 mbar压力注入含0.5 µM 10% Alexa-568标记的G-actin溶液。 (D，E生化条件的快速变化。 (D两种输入溶液的流动模式 中等流速 条件。 (E) 以背景荧光增强作为肌动蛋白浓度的检测指标。时间 t = 0 定义为荧光增强的起始点。溶液 1：0.5 µM 10% Alexa-488 标记的 G-actin；溶液 2：F 缓冲液。C,EPDMS 腔室：高 20 µm，宽 1600 µm。表面以上约 2 µm 处的落射荧光强度通过在整个视野范围内对信号取平均值进行量化，并以无荧光染料时为 0、最大强度时为 1 进行归一化。 请点击此处查看此图的放大版本。

8. 基本单丝实验：二磷酸腺苷（ADP）-肌动蛋白钝端去聚合

注意：本节假设使用未功能化的腔室（仅第5节）。如果腔室已直接功能化（第4节），请从步骤8.4开始。

1. 利用肌动蛋白丝种子进行表面功能化：
   1. 将溶液更换为 200 µL 的 50 pM 血影蛋白-肌动蛋白种子溶液¹¹ 在F缓冲液中（见第7节）。
      注意：或者，如果无法获得血影蛋白-肌动蛋白成核种子，可使用生物素修饰的短片段肌动蛋白细丝，该细丝将被固定在链霉亲和素包被的盖玻片上（参见^9,10 详情请参见）。
   2. 注射2分钟 高流量 3.
      注意：根据最终的种子密度调整浓度和时间。
2. 表面钝化：
   1. 将第3号试管更换为含有5% BSA的F缓冲液300 µL。
   2. 注射5分钟 高流量 3，随后在5分钟内 中等流速 3在第二步中，将通道1和通道2的压力降低至7–8 mbar，以产生约-100 nL/min的反向流，从而使整个腔室表面经BSA钝化。
      注意：由于 BSA 溶液黏度较高，需相应调整压力。
3. 将第3管更换为F缓冲液，并冲洗通道（5分钟， 高流量 3).
4. 配制以下 200–300 µL 溶液，所有蛋白质均用 F 缓冲液稀释：
   入口1，聚合溶液：1 µM 10% Alexa-488标记的G-肌动蛋白，1 µM 胸腺素蛋白（profilin）表1).
   入口 2，老化溶液：0.15 µM 10% Alexa-488 标记的 G-actin。
   入口 3，去聚合溶液：仅 F 缓冲液。
   注意：此处使用Profilin以防止G-actin的自发成核，并维持G-actin浓度恒定。
5. 更换1至3号管（第7节）。使用以下方法注射 高流量全部 预设时间为3-4分钟。三种溶液现已充满PEEK管路并到达腔室（图 3A）。玻璃表面可以无延迟地接触任何入口溶液（<1 s 图3D，E).
6. 打开显微镜。设置参数：150 mW 488 nm 激发激光功率为10%-20%，相机曝光时间100-200 ms，全内反射荧光（TIRF）穿透深度200-300 nm，使用60倍物镜。这些参数在全文中保持一致。
7. 丝状聚合（filament polymerization）图 4A):
   1. 将压力设定为 中等流速 1 约10分钟。
   2. [可选] 记录聚合过程（每20秒1帧，TIRF）。细丝的聚合速度应约为每秒10个亚基（sub/s）。^1,12.
8. 丝状结构老化：将压力设置调至 中等流速 2 15分钟。在临界浓度（0.15 µM G-actin）下，纤丝长度将保持不变，且纤丝会转变为 >99% ADP-F-肌动蛋白⁴.
9. 去聚合图4A):
   1. 以1帧/5秒的速率在落射荧光模式下开始采集。由于通道2和通道3的荧光背景极低，无需使用全内反射荧光（TIRF）模式。
   2. 一到两个画面后，切换至 中等流速 3丝状结构应在约 10 sub/s 时发生去聚合（参考）¹²).
10. 为了重置实验，使用激光以最大功率持续照射约 2 分钟，使所有荧光标记的细丝断裂。为测试不同条件，更换溶液 1、2 或 3，并将其注入高流量，3-4 分钟）。重复步骤 8.7–8.9。

9. 其他单丝实验

1. 测试ABP与F-actin的相互作用
   注意：微流控技术已成功用于量化多种侧向结合ABP的活性，例如cofilin、tropomyosin和Arp2/3。按照第8节中的方案：
   1. 将通道3更换为含目标荧光ABP的F缓冲液。使用高流速3模式注入，持续3分钟。
   2. 纤维聚合：设置压力为中流速1，持续10分钟。
   3. ABP结合：使用TIRF开始图像采集。根据ABP浓度调整帧率。采集1-2帧后，切换至中流速3。
      注意：根据ABP的不同，也可短暂（例如少于5秒）切换至中流速2，以在成像时进一步降低背景荧光。
   4. ABP解离：在持续采集图像的同时，切换至中流速2。
2. 在游离正端由formin介导的聚合
   注意：已证明formin可影响肌动蛋白纤维正端的聚合过程。微流控技术特别适用于测量formin的结合与解离速率及其对纤维延伸的影响。
   1. 准备以下溶液：
      通道1：含10 nM formin的F缓冲液（表1）。
      通道2：含1 µM 10% Alexa-488标记的G-actin和4 µM profilin的溶液。
      通道3：F缓冲液。
   2. 更换通道1、2和3的管路（第7节）。使用高流速全通道预设模式注入3-4分钟。
   3. 启动纤维聚合：设置压力为中流速2，持续2分钟。
   4. formin结合至纤维正端：设置压力为中流速1，持续30秒。
   5. formin介导的聚合：设置压力为中流速2。当mDia1 formin位于纤维正端时，纤维的聚合速率应约为50亚基/秒^13,14,15。
3. 由表面锚定formin介导的聚合/解聚
   注意：已发现由formin修饰的正端其聚合与解聚速率依赖于施加在纤维上的张力。在微流控系统中，流体沿纤维侧面流动产生的摩擦力会生成与纤维长度和流速成正比的张力^14,16。
   1. 采用上述第8节所述方法，将表面钝化步骤8.1、8.2和8.3替换为以下操作：
      1. 将通道3更换为含1 µg/mL抗His抗体的F缓冲液。使用高流速3模式注入2分钟。
      2. 将通道3更换为含5% BSA的F缓冲液。先以高流速3注入5分钟，再以中流速3注入5分钟。在第二步期间，将通道1和2的压力降低至7-8 mbar，以产生约-100 nL/min的反向流，确保整个腔室表面均被BSA钝化。
      3. 将通道3更换为含100 nM His标签formin的F缓冲液。使用高流速3模式注入5分钟。随后将通道3更换为F缓冲液，并再次以高流速3注入5分钟，以确保管路中无残留formin。
   2. 准备并注入以下溶液（每种200-300 µL，溶于F缓冲液）：
      通道1：1 µM 10% Alexa-488标记的G-actin。
      通道2：1 µM未标记G-actin，4 µM profilin。
      通道3：仅F缓冲液。
   3. 纤维成核：使表面锚定的formin暴露于G-actin（设置为中流速1）。
   4. 纤维聚合：使用中流速2使腔室暴露于profilin-actin混合物。
   5. 开始采集：每2秒采集1帧，使用落射荧光。当使用mDia1 formin时，纤维的聚合速率应为50-80亚基/秒，具体数值取决于纤维长度和流速¹⁴。
   6. 纤维解聚：开始采集（每4秒采集1帧，使用落射荧光）。采集1-2帧后，使纤维暴露于F缓冲液（中流速3）。当使用mDia1 formin时，纤维的解聚速率应为5-15亚基/秒，具体数值取决于纤维长度和流速¹⁴。
4. 含未标记区段的肌动蛋白纤维
   注意：肌动蛋白的荧光标记会引发多种人工假象，例如在解聚过程中出现暂停¹⁷，以及tropomyosin结合能力的改变¹⁸。克服这些假象的一种方法是利用微流控技术组装具有未标记区段的纤维。
   1. 准备并注入以下溶液（200-300 µL，溶于F缓冲液）：
      通道1：1 µM未标记G-actin，1 µM profilin。
      通道2：0.3 µM 10% Alexa-488标记的G-actin。
   2. 依次将表面暴露于通道2（5分钟）、通道1（10分钟）和通道2（15分钟），以生成两端为荧光标记、中间为ADP-actin未标记区段的纤维。
5. 通过gelsolin锚定正端的纤维
   注意：使用spectrin-actin种子时，纤维在其游离正端聚合，而负端则由spectrin-actin种子稳定。另一种方法是使用如gelsolin等正端封端蛋白将纤维锚定于表面。
   1. 在20 µL F缓冲液中配制4 µM 10% Alexa-488标记G-actin的F-actin溶液。将该溶液在室温下静置至少30分钟，使其自发成核并聚合。用铝箔包裹管子以避光。
   2. 同时，准备微流控腔室，并使用含5% BSA和1%生物素化BSA的混合物对表面进行钝化处理（参见步骤8.2）。
   3. 用F缓冲液冲洗通道3（高流速3模式下持续2分钟）。随后注入含10 µg/mL neutravidin的F缓冲液（高流速3模式下持续4分钟）。
   4. 更换各通道的溶液：
      通道1：10 nM生物素化gelsolin（表1）。
      通道2：F缓冲液。
      通道3：0.4 µM预聚合的F-actin。
   5. 使用高流速全通道模式同时注入所有溶液，持续3分钟。
   6. 使整个腔室暴露于gelsolin（中流速1，持续30秒）。
   7. 将纤维固定于表面（低流速3：通道3压力设为3 mbar，通道1和2压力约为2 mbar，持续约2分钟）。
   8. [可选] 若纤维密度过低，可重复步骤9.5.6和9.5.7。
   9. 负端解聚：开始采集（每30秒采集1帧，使用落射荧光）。采集1-2帧后，仅用缓冲液处理纤维（中流速2）。纤维的解聚速率应约为0.2亚基/秒。

10. ADF/cofilin 介导的由 Fascin 诱导的丝状体束形成与解聚

注意：为了形成肌动蛋白丝束，必须确保腔室表面具有足够高的丝状种子密度。当暴露于束蛋白（fascin）时，相邻的肌动蛋白丝因侧向波动而被束蛋白动态交联。由于束蛋白会快速从肌动蛋白丝侧面解离¹⁹，因此必须在主流动溶液中持续存在束蛋白，以维持肌动蛋白丝的束化状态。

1. 按照步骤 8.1–8.3 进行操作。
2. 配制以下溶液（在F缓冲液中，200–300 µL）：
   通道1，聚合溶液：1 µM 10% Alexa-488标记的G-actin，1 µM profilin。
   通道 2，成束溶液：200 nM fascin（表1)，0.15 µM 10% Alexa-488 标记的 G-actin。
   通道3，解聚溶液：200 nM ADF/cofilin（表1），100 nM fascin，0.15 µM 10% Alexa-488 标记的 G-actin。
3. 更换1至3号管（第7节）。使用以下方法注射 高流量全部 预设，3-4 分钟。
4. 丝状体聚合：将压力设置调至 中等流速 1 约10分钟。聚合过程可通过全内反射荧光显微镜（TIRF）进行成像。
5. 丝状体束化图 4C）：开始图像采集（1帧/5秒，落射荧光）。采集1-2帧后，将压力设置调整为 中等流速 2 并观察丝状结构的成束现象。
6. 束状物断裂：开始图像采集（1帧/5秒，落射荧光）。采集1-2帧后，将压力设定调至 中等流速 3 观察cofilin诱导的单根细丝和束状细丝的解聚过程。

11. 微流控装置清洗步骤

注意：为避免实验之间发生任何污染，每次实验后必须彻底清洁并完全干燥所有管路和流量计。

1. 断开所有与PDMS腔室连接的管路，并丢弃该腔室。
2. 为清洗PEEK管路和流量计，将管路末端用胶带固定在空的15 mL塑料离心管中，并在最大压力下依次注入以下溶液，直至储液罐几乎排空：
   400 µL F缓冲液。
   400 µL 0.5 M NaOH。
   400 µL 纯水。
   200 µL 异丙醇。
3. 更换为一个空的储液罐，吹入空气直至管路完全干燥（约2–4分钟，最大压力）。

12. 图像分析

注意：尽管本论文主要关注在微流控芯片中组装、操控和可视化单根肌动蛋白丝的方法，但此处也提供了对所获取视频进行分析的简要方法。该分析在16位图像上进行，使用ImageJ软件，具体步骤见第8节。

1. 图像处理应尽量简化：
   1. 导入聚合或解聚的图像序列。
   2. [可选] 使用 Subtract Background 功能对图像强度进行均一化处理（默认设置，即“滚动球半径” = 50 像素）。当视频过程中背景荧光发生变化，或视野内荧光照明不均匀时，此步骤尤为有用。
   3. 调整亮度和对比度（背景接近零，纤维接近最大值）。
2. 生成纤维的明场轨迹图（kymograph）：
   1. 选择一条未暂停、未断裂或未脱离的纤维。除上述条件外，不应基于其他行为进行选择。在纤维上方 1–2 像素处绘制一条直线（使用 Straight Line 工具）。保存该纤维编号（在 ROI Manager 中点击 Add）。
   2. 应用 Reslice 功能（切片数：5 像素），并计算最大强度（使用 Zprojection 功能）。
3. 测量聚合/解聚速率：
   1. 在明场轨迹图上，沿纤维的尖端（barbed end）绘制一条直线（使用 Straight Line 工具，图 4A）。测量该直线的宽度和高度（使用 Measure 功能）。
4. 在多条纤维上重复步骤 12.2–12.3，计算聚合/解聚速率（图 4A）：
   ，其中 v 为速率（单位：sub/s），w 为线宽（像素），pix 为像素尺寸（nm），h 为线高（帧数），dt 为帧间时间（秒）。此处，2.7 nm 表示一个肌动蛋白亚基对纤维长度的有效贡献。

结果

对于上述所有实验，应能清晰观察到荧光标记的肌动蛋白丝，具有良好的对比度，表明表面背景荧光较低（图4，常见问题的解决方案参见补充文件1）。肌动蛋白丝不应粘附于表面：当主导流速较低时，在实时观察下应可察觉肌动蛋白丝的横向波动，从而明确判断其仅由一端锚定。同样，在使用全内反射荧光（TIRF）成像时，应可通过其长度方向和时间上的强度变化观察到肌动蛋白丝的纵向波动。根据所施加的流速，可能需要调整TIRF的穿透深度，以优化通过TIRF获取的肌动蛋白丝图像质量。

在将肌动蛋白丝暴露于聚合条件时（见第8节），丝状结构的延伸应保持规律（即丝的末端延伸不受表面相互作用或永久性粘附的阻碍）。此外，所测得的肌动蛋白丝正端（barbed end）延伸速率应与管中肌动蛋白浓度所预期的速率相符^1,20，这表明管中溶液已正确流入微流控腔室（图4A...

讨论

Compared to standard single-filament methods where actin filaments are anchored to the surface by multiple points along their length or maintained close to it by a crowding agent such as methylcellulose, microfluidics offers a number of advantages. As interactions with the surface are minimal, the artificial pauses these interactions can induce during both elongation and depolymerization are avoided. The filaments are aligned by the flow, parallel to each other, easing their monitoring and the measurement of their length...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
β-酪蛋白	Merck	C6905	使用浓度为 8 mg/mL
活检打孔器（带推杆）	Ted Pella	15115-2	内径 0.75 mm，外径 1.07 mm
生物素-BSA	Merck	A8549	使用浓度为 1 mg/mL
BSA	Merck	A8022	使用浓度为 50 mg/mL
盖玻片迷你支架 聚四氟乙烯支架	Invitrogen	C14784	适用于 8 个盖玻片
盖玻片 22x40 mm 厚度 #1.5	Menzel Gläser	631-1370
DABCO	Merck	D27802	f-buffer 的组分
DTT	Euromedex	EU0006-D	f-buffer 的组分
琥珀酰亚胺基酯 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000	用于标记 Lys328 位点的肌动蛋白荧光染料
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	21338	用于在 Lys328 位点对肌动蛋白进行生物素标记
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507	玻璃器皿清洗剂
ImageJ	NIH	N/A	开源软件
Laboport	KNF	811kn.18	真空泵（极限真空：240 mbar）
魔力透明胶带	Scotch	7100024666	标准透明办公胶带
微量管	Simport	T341-6T	2 mL 微流控储液管
微流控装置 第一部分：Flow Unit S	Fluigent	FLU-S-D-PCKB	流量计
微流控装置 第二部分：Fluiwell-4C-2 mL	Fluigent	14002001PCK	储液池支架
微流控装置 第三部分：MFCS-EZ	Fluigent	EZ-11000001 EZ-00345001	压力控制器
Model 42 - UVO-Cleaner	Jelight Inc.	42-220	紫外清洁仪
N6-(6-氨基己基)-ATP-ATTO-488	Jena Bioscience	NU-805-488	用于标记肌动蛋白的 ATP-ATTO 探针
中性亲和素（neutravidin）	Thermo Scientific	31000
PLL-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)	在 PBS 中使用浓度为 1 mg/mL
聚二甲基硅氧烷 (PDMS) Sylgard 184 硅弹性体	Dow Corning	1673921	包含 PDMS 基料和固化剂
聚醚醚酮 (PEEK) 管	Merck	Z226661	“蓝色”：内径 = 0.25 mm
安全吹尘枪	Coilhose Pneumatics	700-S	过滤空气
硅胶管	VWR	228-0701P	连接 PEEK 管与接头
不锈钢导管接头	Prime Bioscience	SC22/15	插入 PDMS 进样口和出样口，用于连接 PEEK 管
热塑性薄膜	Sigma Aldrich	PM996	标准 "Parafilm" 封口膜
超纯乙醇	VWR	64-17-5
超声波清洗仪	VWR	USC200TH	可容纳 1 L 烧杯
真空干燥器	SP Bel-Art	F42022-0000	用于对 PDMS 或溶液脱气