利用微流体和荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝和束的组装动力学

Summary

我们提出了简单的肌动蛋白丝微流体测定方案，结合荧光显微镜，使人们能够实时准确地监测单个肌动蛋白丝，同时按顺序将它们暴露于不同的蛋白质溶液中。

Abstract

为了破译调节肌动蛋白细丝组装和拆卸的复杂分子机制，在良好控制的条件下监测单个反应是一项重要资产。为此，在过去的20年中出现了实时单丝实验，主要使用全内反射荧光（TIRF）显微镜，并提供了大量关键结果。2011年，为了进一步扩大这些实验的可能性并避免反复出现有问题的伪影，我们在这些测定中引入了简单的微流体。本研究详细介绍了我们的基本方案，其中单个肌动蛋白细丝由一端锚定在钝化的盖玻片表面上，与流动对齐，并且可以连续暴露于不同的蛋白质溶液中。我们还介绍了特定应用的协议，并解释了如何施加受控的机械力，这要归功于流动溶液的粘性阻力。我们强调了这些实验的技术警告，并简要介绍了基于该技术的可能发展。这些方案和解释，以及当今易于使用的微流体设备的可用性，应该允许非专业人员在其实验室中实施该测定。

Introduction

肌动蛋白长丝和肌动蛋白丝网络的组装和拆卸由几种生化反应控制，并取决于机械环境。为了深入了解这些复杂的机制，能够观察单个细丝上的单个反应（足够大的数量）是非常宝贵的。在过去的几十年中，实时观察动态肌动蛋白丝，主要使用全内反射荧光（TIRF）显微镜，已成为一项关键技术，并提供了令人印象深刻的结果列表，这些结果无法通过本体溶液生化测定¹获得。

为了实现这一点，需要将荧光标记的肌动蛋白丝保持在显微镜盖玻片表面附近，同时将它们暴露于肌动蛋白结合蛋白（ABP）的溶液中，这些溶液也可以进行荧光标记。这样做提供了一种在良好控制的生化条件下监测单个细丝上发生的事件的方法，从而量化反应速率。但是，应考虑一些具体的限制。人为地保持细丝靠近表面，通常由于多个锚定点或使用拥挤剂如甲基纤维素，可以改变它们的行为（例如，导致其聚合和解聚的暂停²）。跟踪每根灯丝的轮廓可能具有挑战性，特别是如果新的灯丝或灯丝碎片随着时间的推移在视野中积聚。反应发生在有限的体积中，其中肌动蛋白单体和ABP的浓度会随时间变化，可能难以获得准确的速率常数。最后，更新或改变ABP的溶液很难在不到30秒的时间内实现，并且通常会导致样品中的蛋白质含量不均匀。

10多年前，受到已经完成的单个脱氧核糖核酸（DNA）链³的启发，我们引入了一种基于微流体的新技术来观察和操纵单个肌动蛋白丝⁴。它允许人们规避上述经典单丝技术的局限性。在这些微流体测定中，肌动蛋白细丝是从吸附在盖玻片上的光谱蛋白 - 肌动蛋白种子中生长的。因此，细丝仅由一端锚定在微流体室的底部，并在表面上方波动而不粘附。细丝与进料溶液的流动保持一致，从而简化了对其轮廓长度的监控，并将它们保持在可以使用TIRF的盖玻片上方的浅区域。不同的溶液同时流入腔室而不混合，并且细丝可以依次快速地暴露在它们中。

在这里，我们提出了一系列基本方案，以在实验室中建立单肌动蛋白丝微流体测定。盖玻片和微流体室可以提前（在半天内）制备，实验本身可以在不到一天的时间内完成，其中可以测试几种生化条件。

Protocol

1. 微流控室制备

1. 选择具有多个腔室图案的SU-8主模具。典型的腔室是十字形的，有三个入口和一个出口，高20μm，宽800μm（图1）。这种母模可以从外部公司购买或在学术实验室制造（例如，Gicquel，Y.等^人5）。
2. 将胶带放在模具边缘周围。
   1. 将约50厘米长，19毫米宽的标准透明办公胶带（见 材料表）放在长凳上，粘性面朝上。将模具垂直放置在胶带的一端和中线。
   2. 将模具卷到胶带的另一端，在模具周围形成一个1厘米的边框。将胶带折叠在模具底部。
3. 制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。
   1. 在一次性称重盘中，直接倒入25-30克PDMS底座（材料表）。用一次性塑料巴斯德移液器加入10%重量/重量的PDMS固化剂（材料表）。
   2. 用塑料棒手动彻底混合。确保固化剂充分掺入PDMS基质中，即使搅拌会产生大量气泡。
4. 在室温（RT）下将PDMS溶液在真空干燥器（材料表）中脱气至少5分钟。气泡会膨胀，上升到表面，并在真空被打破时破裂。
5. 将 PDMS 溶液倒在 SU-8 模具上。使用塑料棒刮擦并转移尽可能多的混合物。
6. 第二次对PDMS进行脱气（在真空干燥器中5分钟）。确保去除大多数气泡（顶部表面的一些小气泡很好）。
7. 将模具置于70°C的烤箱中至少5小时，以使PDMS网状并固化。
8. 从模具中取出固体 PDMS 腔室。
   注意:用于SU-8模具的硅晶圆非常脆弱，因此在将PDMS与晶圆分离时必须格外小心。在坚硬、平坦的表面上工作，并使晶圆在表面上保持平坦。
   1. 用剃须刀片在PDMS中做一个圆形切口，距离模具边缘约1厘米。所有图案必须在切口内至少 0.5 厘米。用轻柔的拉扯轻轻剥离中央 PDMS 块。
      注意:剥落时，请将SU-8模具平放在台面上，以防止其破裂。
   2. 将PDMS放在干净的铝箔上，模制表面面向铝箔，以保护其表面免受灰尘侵害并使图案更加明显。
9. 选择并用剃须刀片切割距离图案至少0.5厘米的腔室。由此产生的PDMS块高约0.5厘米，宽1.5厘米，长3厘米。用内径0.75毫米的活检冲头刺穿三个入口和一个出口（材料表）。
10. 用超纯乙醇清洁PDMS室（材料表），并使用安全吹气枪（材料表）风干。将图案朝上的PDMS放在干净的培养皿中，并用盖子关闭培养皿。

2. 玻璃盖玻片清洁

注意:这里详细介绍了基于一系列超声处理步骤的标准盖玻片清洁程序。其他玻璃盖玻片清洁程序已经在许多其他出版物中描述过，这些程序可以达到类似的令人满意的结果^{6，7，8，9}。

1. 将10-20个盖玻片（40毫米长）放在聚四氟乙烯（PTFE）支架上（材料表）。在1L玻璃烧杯（35°C，30分钟）中将盖玻片在0.5L的2%玻璃清洁溶液（材料表）中超声处理。
2. 处理玻璃清洁溶液，并在至少三个连续的0.5 L浴中用dH 2O广泛冲洗盖玻片。
3. 在1升玻璃烧杯中准备0.5升2 M KOH。在KOH（RT，30分钟）中超声处理盖玻片。处理KOH并用dH 2 O冲洗盖玻片，至少三个0.5升浴。
   注意:使用适当的实验室安全防护设备（手套、眼镜和实验室外套）。
4. 在0.5L超纯乙醇（RT，30分钟）中转移并超声处理盖玻片。盖玻片可以在乙醇中保存长达2周。用热塑性薄膜（材料表）关闭烧杯以防止蒸发。使用前，用气流干燥盖玻片。

3. 管腔室组装

1. 将热板预热至100°C。 将最多三个清洁的 PDMS 室和玻璃盖玻片放入干净的培养皿中。将开放的培养皿置于深紫外线（UV）清洁剂（λ = 185nm，参见 材料表）中，并将其暴露在紫外线下3-5分钟。
   注意:或者，PDMS室和盖玻片可以暴露在空气或氧气等离子体中30秒。
2. 轻轻地将 PDMS 腔室放在盖玻片上。确保接触的两个表面直接暴露在紫外线下。PDMS自动粘附在玻璃上，腔室变得清晰可见。
3. 要清除被困在 PDMS 盖玻片接口处的任何空气，请用手指轻轻按压表面。要实现更紧密的粘合，请更用力地按压角落和侧面。确保腔室的天花板不与玻璃表面接触。
4. 将玻璃底朝向100°C的热板放置室5分钟。完成此步骤后，玻璃- PDMS键合成为永久性的，腔室只能使用一次。立即使用腔室或将其存放在干净的培养皿中长达一周。

4. [可选] 直接钝化和功能化

注意:根据应用的不同，腔室可以在连接到微流体控制装置（参见 材料表）后进行钝化和功能化，或者在将溶液连接到微流体装置之前用移液管手动将溶液直接注入腔室。后者的优点是消耗更少的试剂，并通过使溶液流过微流体装置的聚醚醚酮（PEEK）管来避免潜在的污染。在以下所有步骤中，通过将移液器吸头直接插入出口来注入溶液。为了避免在腔室内产生气泡，当将吸头插入 PDMS 腔室的出口时，请确保移液器吸头中伸出一个微小的液滴。同样，在注入整个体积之前取出移液器吸头。

1. 注入20微升PLL-PEG（1毫克/毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS））。在室温下孵育至少1小时（或过夜）。为防止蒸发，请将 PDMS 室放在潮湿的箱子中（例如，下部隔室中有一个装有水的空吸头盒，而 PDMS 室位于吸头保持平台上）。
2. 注入20μL100 pM光谱蛋白肌动蛋白种子（在F缓冲液中，见 表1 和 表2）。等待不超过1分钟。调整种子浓度和时间以调整种子表面密度，高到足以进行大统计，足够低，以使细丝不重叠。
   注意:或者，如果没有光谱素 - 肌动蛋白种子，请使用生物素功能化的短丝段，这些短丝段将固定在链霉亲和素包被的盖玻片^9，10上。
3. [可选]在F缓冲液中注入20μL5%牛血清白蛋白（BSA）。在室温下放置 10 分钟。
4. [可选]在F缓冲液中注入20μL1mg / mL β酪蛋白。在室温下放置 10 分钟。
   注:按照步骤 4.3 和/或 4.4 进一步钝化腔室。钝化的选择取决于所使用的蛋白质，并且不能在所有ABP上同样有效。当单独使用肌动蛋白时，PLL-PEG或BSA就足够了。

5. 连接微流控装置

注意:使用具有多达四个通道的基于压力的微流体系统来控制微流体室中的流量（图1A，参见 材料表）。为避免微流体管中形成气泡并扰动流动稳定性，请对所有溶液进行脱气。将5 mL dH₂0和10 mL F缓冲液置于连接到真空泵的真空干燥器中（极限真空<250 mbar），并在室温下脱气至少1小时。

1. 用 dH₂O （500 μL， 300 mbar） 冲洗入口 + 出口管。
2. 用300μLF缓冲液填充所有2 mL储液管（参见 材料表）。将压力设置为 300 毫巴，让 5 到 8 滴水浪费掉。对每个通道重复上述步骤，并将压力设置为 0。
3. 连接出口并广泛冲洗腔室。
   1. 将油箱管 4（出口）的压力设置为 50 mbar。一旦液滴从管端出来，将管子连接到PDMS室的出口。液体填充在腔室中并从所有入口中流出。
   2. [可选]如果腔室已直接钝化（第4节），请将压力设置为100 mbar，以用50-100μLF缓冲液冲洗腔室（3-5分钟）。用清洁纸巾清除入口处多余的液体。
   3. 将压力设置为 20 毫巴。
4. 连接入口。
   1. 将储液管的压力设置为 1 至 50 mbar。为避免引入气泡，请确保液滴从管道和 PDMS 入口中流出。
   2. 将管子连接到入口1（连接时两个液滴合并）。将压力设置为 30 毫巴。
   3. 重复步骤 5.4.1-5.4.2 以连接入口 2 和 3。
5. 将所有入口的压力设置为 20 毫巴，将出口压力设置为 0 毫巴。确保入口处的流速大致相等（请参阅故障排除部分）。

图1:通过微流体室注射溶液 （A）用于单个肌动蛋白丝实验的标准微流体设置。放置在储液槽1-3中的蛋白质溶液通过调节气相中的压力被推入腔室。生成的流量由流量计测量。在微流体室内部，溶液不会混合并占用空间，具体取决于施加的相对压力（此处为所有入口上的相同压力）。典型尺寸:储液管含有多达 2 mL 的溶液。PEEK管（内径0.25毫米）将储液器连接到流量计（在10厘米的管道之后），然后连接到PDMS室（再连接70厘米后）。硅管和不锈钢管接头用于将PEEK管连接到PDMS入口。主微流体通道高20-60μm，宽约1毫米，长1厘米。（乙、丙）微流体腔内的流动曲线。（B）流体在腔室高度上产生抛物线轮廓:v（z） = 6z（h-z）R / h³w，其中h和w是腔室的高度和宽度，R是总流速。底部:由表面锚定的光谱蛋白肌动蛋白种子聚合而成的单肌动蛋白丝。（C）当腔室宽度大大大于其高度时，流动在腔室中几乎是均匀的，除了在PDMS表面，它变为零。请点击此处查看此图的大图。

6. 使用标准流速配置设置

注意:计算机控制的压力系统可以轻松、精确地调节连接到 PDMS 腔室的所有入口/出口的压力，从而控制输入和输出流量。只需单击鼠标即可保存和打开/关闭预设配置。以下是推荐的配置（除非另有说明，否则出口压力设置为 0 mbar）。有关这些预设配置的预期流速，请参见 表 3 。此处指示的压力必须根据腔室几何形状和系统配置进行调整。

1. 更改:更改一个或多个储液槽时使用此预设。它在感兴趣的管道中产生温和的逆流，以防止引入气泡。
   1. 将所有入口压力设置为 12 毫巴，将出口压力设置为 5 毫巴（图 2B）。
2. 高流量"全部":使用此预设可快速并行注入三种溶液。他们将在4分钟内到达房间。
   1. 将所有入口压力设置为 150 mbar。
3. 高流量"x":使用此预设可快速注入溶液。它将在3分钟内到达腔室（图3A-C）。
   1. 将入口"x"压力设置为150毫巴（~15毫升/分钟）。其他入口中的压力被调节到约100 mbar，使得这些入口处产生的流速约为500 nL / min。
4. 中流"全部":使用此预设可暂停系统。
   1. 将所有入口设置为20毫巴（图2A）。
5. 中流'x':使用此预设允许溶液"x"填充大部分主通道宽度（见 图2C，D），同时将其他入口解决方案限制在通道侧。因此，腔室中的肌动蛋白细丝将仅暴露于溶液"x"施加的生化条件下。
   1. 将入口"x"压力设置为12毫巴。设置其他入口处的压力并调整至~9 mbar，使其各自的流速为~150 nL/min。

图2:施加在每个储液罐上的压力控制微流体室内溶液的分区/空间分布。（A）在对储液器施加相等压力的情况下，每个溶液占据腔室的三分之一。（B）更换储液管（此处为储液罐3）时，有效压力降至零，产生逆流。（三、四）增加其中一个储液槽上的相对压力允许玻璃表面暴露在单个溶液中。通过在配置中流1（C）和中流2（D）之间交替，腔室中间的视野可以依次暴露于溶液1和2。请点击此处查看此图的大图。

7. 更改解决方案"x"

注意:如图3A-C所示，重要的是要记住，溶液从储液管流向腔室的主通道需要几分钟时间。这种最小的"死"时间是由管道中所含的液体体积和管道内的流动曲线施加的（图3A-C）。

1. 在新的储液管中制备200-300μL溶液。将压力设置为 更改 设置（请参阅第 6 节）。
2. 拧下入口"x"的储液管。卡套管中的溶液将缓慢地向后流动，从腔室到自由管尖。测得的流速变为负值（图2B）。
3. 一旦在管尖上形成微小的液滴，用新鲜的溶液拧入新管。一旦管子正确拧紧到压力系统，入口的流速就会恢复为正值。
4. 将压力设置设置为 高流量"x"。
5. 根据微流体配置和腔室几何形状，等待3-5分钟，使溶液完全填充管并到达腔室。
6. [可选]通过测量荧光随时间的增加来遵循此过程（图3C）。

图3:溶液从储液罐延迟到达PDMS室以及生化条件的快速变化。 （自动对照）溶液从储液罐延迟到达 PDMS 室。 （A） 根据腔室几何形状，管长和入口处施加的压力，一种溶液的更换不是即时的。将储液管更换为含有荧光溶液的储液管（0分钟）后，溶液逐渐填充管（0.4分钟）和PDMS室（1-2分钟）。对于 150 mbar 施加的压力、80 cm PEEK 管和 1600 μm 宽、20 μm 高的 PDMS 腔室，给出了指示性计时。 （B）PEEK管内的抛物线流动曲线沿管子放射状剖面和腔室内产生有效的荧光梯度（另见 图1B）。 （C）溶液的延迟到达可以通过测量腔室中的背景落射荧光信号作为时间的函数来量化。实验条件:通过流量计和80 cm PEEK管向0.5 μM 10%Alexa-568标记的G-肌动蛋白注入150 mbar。 （D，E）生化条件的快速变化。 （D） 两种 中流 条件下的进料溶液模式。 （E）背景荧光的增加作为肌动蛋白浓度的读数。时间 t = 0 设置为荧光开始增加。溶液1:0.5μM 10%Alexa-488标记的G-肌动蛋白，溶液2:F缓冲液。（C，E）PDMS腔室:高20微米，宽1600微米。通过对整个视场上的信号求平均值来量化表面以上约2μm的落射荧光强度，在没有荧光团的情况下归一化为0，在最大强度下归一化为1。 请点击此处查看此图的大图。

8. 基本单丝实验:二磷酸腺苷（ADP）-肌动蛋白倒钩端解聚

注:本节假定为非功能化腔室（仅限第 5 节）。如果腔室已直接功能化（第4节），请从步骤8.4开始。

1. 肌动蛋白长丝种子的表面功能化:
   1. 在F缓冲液中改变溶液3至200μL的50pM光谱蛋白 - 肌动蛋白种子¹¹ （参见第7节）。
      注意:或者，如果没有光谱蛋白 - 肌动蛋白种子，则可以使用生物素功能化的短丝段，这些短丝段将被固定在链霉亲和素包被的盖玻片上（有关详细信息，请参阅^9，10 ）。
   2. 用 高流量注射2分钟 3.
      注意:根据最终种子密度调整浓度和时间。
2. 表面钝化:
   1. 在F缓冲液中用300μL5%BSA更换试管3。
   2. 在 高流量3下注射5分钟，然后在 中流3下注射5分钟。在第二步中，将通道1和2中的压力降低到7-8 mbar以获得逆流〜-100 nL / min，以便整个腔室表面被BSA钝化。
      注意:由于BSA溶液粘度更高，因此需要相应地调整压力。
3. 将管3更换为F缓冲液并冲洗通道（5分钟， 高流量3）。
4. 制备以下200-300μL溶液，所有蛋白质在F缓冲液中稀释:
   入口1，聚合溶液:1μM 10%Alexa-488标记G-肌动蛋白，1μM普罗菲林（表1）。
   入口2，老化溶液:0.15μM 10%Alexa-488标记G-肌动蛋白。
   3、解聚液:仅F缓冲液。
   注意:普罗菲林在这里用于防止自发成核并保持G-肌动蛋白的恒定浓度。
5. 更换试管 1 至 3（第 7 节）。使用 高流量全部 预设注入3-4分钟。这三种溶液现在已经填充了PEEK管并到达了腔室（图3A）。玻璃表面可以暴露在任何入口溶液中，而不会出现死区时间（<1秒， 图3D，E）。
6. 打开显微镜。设置设置:150 mW 488 nm激发激光器，10%-20%功率，100-200 ms相机曝光时间，200-300 nm TIRF穿透深度，60倍物镜。这些设置在整个手稿中使用。
7. 灯丝聚合（图4A）:
   1. 将压力设置设置为 中流 1 约 10 分钟。
   2. [可选]记录聚合（1 帧/20 秒，TIRF）。细丝应以约10亚基/秒（亚/秒）^1，12聚合。
8. 灯丝老化:将压力设置设置为 中流2

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Results

对于上述所有实验，荧光标记的肌动蛋白丝应清晰可见，具有良好的对比度，表明表面的背景荧光较低（图4，请参阅 补充文件1 以解决常见问题）。肌动蛋白细丝也不应粘附在表面上:当显性流速较低时，当观察它们活着时，肌动蛋白丝的横向波动应该是可感知的，并允许人们清楚地确定它们仅由其末端之一锚定。同样，当使用TIRF成像时，它们的垂直波动应该通过其长度和时间的强度变化可见。根据施加的流速，可能需要调整TIRF穿透深度，以优化TIRF获取的肌动蛋白丝的图像质量。

当长丝暴露于聚合条件（见第8节）时，长丝伸长率应规则（即，细丝末端的伸长率不受表面相互作用或永久粘附的阻碍）。此外，根据管^内肌动蛋白浓度1^，20测量的细丝倒钩端伸长率应与预期值相匹配，表明管溶液已正确流向微流控室（图4A）。同样，当暴露于缓冲溶液中时，灯丝应以反映其ADP...

Discussion

与标准的单丝方法相比，肌动蛋白细丝沿其长度通过多个点锚定在表面上或通过甲基纤维素等拥挤剂保持靠近表面，微流体具有许多优点。由于与表面的相互作用很小，因此避免了在伸长和解聚过程中这些相互作用可能引起的人为停顿。灯丝按流动对齐，彼此平行，便于监控和测量长度。细丝周围的溶液不断更新，使它们暴露于恒定的蛋白质浓度。能够在细丝暴露的不同蛋白质溶液之间快速（<1秒， 图3D，E）切换，可以进行时间控制的序贯实验，这通常有助于动力学研究。最后，可以利用流动溶液对灯丝施加的粘性阻力，在灯丝上施加受控的机械应力（代表性结果部分）。应该注意的是，中等流体流动（中流 压力设置）使细丝足够接近表面（〜250nm），以便用TIRF有效地成像它们，同时产生最小的张力（<1 pN）¹⁴。

然而，与经典的单丝测定相比，微流体将需要更大体积的蛋白质溶液:通常为几100μL，而标准实验可以用少于10μL完成。当使用珍贵的蛋白质时，这可能是一个限...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-酪蛋白	Merck	C6905	用于 8 mg/mL
活检穿刺器（带柱塞）	Ted Pella	15115-2	内径 0.75 mm，外径 1.07 mm
生物素-BSA	Merck	A8549	用于 1 mg/mL
BSA	Merck	A8022	用于 50 mg/mL
盖玻片 Mini-Rack Teflon 支架	Invitrogen	C14784	用于 8盖玻片
盖玻片 22x40mm 厚度 #1.5	Menzel Gläser	631-1370
DABCO	Merck	D27802	成分在 f 缓冲液中
DTT	Euromedex	EU0006-D	成分在 f 缓冲液中
NHS Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000	荧光团，用于 Lys328 上的肌动蛋白标记。
EZ-Link Sulfo-NHS-生物素	Thermo Scientific	21338	在 Lys328 上生物素化肌动蛋白
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507	玻璃清洁剂
ImageJ	NIH	N/A	开源软件
Laboport	KNF	811kn.18	真空泵（极限真空：240 mbar）
魔术隐形胶带	Scotch	7100024666	标准透明办公胶带
Micrewtube	Simport	T341-6T	2 mL 微流体储液管
微流体装置 第 1 部分：流量装置 S	Fluigent	FLUIGENT FLU-S-D-PCKB	流量计
微流体装置 第 2 部分：Fluiwell-4C-2 mL	Fluigent	14002001PCK	储液器支架
微流体装置 第 3 部分：MFCS-EZ	Fluigent	EZ-11000001 EZ-00345001	压力控制器
42 型 - UVO-Cleaner	Jelight Inc.	42-220	紫外线清洁剂
N6-（6-氨基己基）-ATP-ATTO-488	Jena Bioscience	NU-805-488	ATP-ATTO 用于标记肌动蛋白
中性亲和素	Thermo Scientific	31000
PLL-PEG	SuSoS	PLL（20）-g[3.5]-PEG（2）	在 PBS 中使用浓度为 1 mg/mL。
聚二甲基硅氧烷 （PDMS） Sylgard 184 硅弹性体	道康宁	1673921	含有 PDMS 基础和固化剂
聚醚醚酮 （PEEK） 管	默克	Z226661	"蓝色"： 内径 = 0.25 毫米
安全吹尘枪	Coilhose 气动	700-S	过滤空气
硅管	VWR	228-0701P	将 ELITE 连接到耦合器
不锈钢导管耦合器	Prime Bioscience	SC22/15	插入 PDMS 入口和出口，以连接到 PEEK 管
热塑性薄膜	Sigma Aldrich	PM996	标准"封口膜"
超纯乙醇	VWR	64-17-5
超声波清洗槽	VWR	USC200TH	可容纳 1 L 烧杯
真空干燥器	SP Bel-Art	F42022-0000	对 PDMS 或溶液进行脱气