基于磁性纳米颗粒免疫分析的交错限制微流控亚克力装置的计算机数控微铣削

摘要

微流体是开发诊断测试的强大工具。然而，通常需要昂贵的设备和材料，以及费力的制造和处理技术。在这里，我们详细介绍了在低成本和易于使用的环境中用于磁性微粒和纳米颗粒免疫测定的丙烯酸微流体装置的制造方案。

摘要

微流体系统极大地改进了免疫测定技术。然而，许多微细加工技术需要专门、昂贵或复杂的设备，这使得制造成本高昂且与大规模生产不兼容，这是在资源匮乏的环境中采用即时检测 （POCT） 的最重要先决条件之一。这项工作描述了使用计算机数控（CNC）微铣削技术进行纳米颗粒偶联酶免疫测定测试的丙烯酸（聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA）装置的制造过程。微流体装置的功能通过执行免疫测定来显示，以使用溶菌酶作为偶联到100nm磁性纳米颗粒的模型抗原来检测商业抗体。该设备集成了高度仅为 5 μm 的物理交错限制，用于通过放置外部磁铁来捕获构成磁阱的磁性微粒。这样，共轭纳米颗粒免疫载体上的磁力足以捕获它们并抵抗流动阻力。这种微流体装置特别适用于低成本的大规模生产，而不会损失免疫测定性能的精度。

引言

近年来，微流体在免疫^{测定技术中}发挥了重要作用1。与传统免疫分析相比，小型化技术具有许多突出的优势，例如减少样品和试剂消耗、缩短孵育时间、高效的溶液交换以及更高的集成度^{和自动化程度}2。

此外，免疫测定中的微流体系统与磁性纳米颗粒作为免疫支持物相结合，大大减少了孵育时间，由于增加了表面^体积比3，实现了高检测灵敏度。颗粒的布朗运动改善了抗原-抗体复合物^4，5形成过程中的反应动力学。此外，纳米颗粒的磁性提供了集成到不同微流体器件配置中的多功能性，使其成为小型化片上生物^{传感系统中信号}传导和分子捕获的理想候选者5。然而，由于高表面^体积比6，磁力明显弱于纳米尺度的阻力。因此，捕获纳米颗粒用于关键的免疫测定步骤（如洗涤和检测）可能具有挑战性，而传统的磁铁是不够的⁴.

操纵纳米颗粒的一种有效方法是使用由铁微粒形成的微流体磁阱，铁微粒包装在微流体结构³中。因此，当外部磁铁接近时，在磁化多孔介质内....

方案

1. 微铣

1. 平面磨削
   1. 打开微铣床和压电控制器。启动各自的控制软件¹².
   2. 选择所需的立铣刀钻头（直径 200 μm 和 800 μm）。将它们放在铣床的适当隔间中（图1）。
   3. 用 800 μm 立铣刀钻头切割 9 mm x 25 mm 矩形的 1.3 mm 厚 PMMA。用双面胶带小心地将这些矩形之一连接到压电平台上（图2）。
      注意: 确保始终将亚克力矩形放置在相同位置，以便其中一个角与加工的 x 轴和 y 轴上的原点坐标重合。
   4. 连接 z 传感器并将其放置在 PMMA 矩形的表面上。选择检测引脚并将其移到传感器表面上。在不接触传感器的情况下手动降低引脚。激活 Z0感应 模式（图3）。
   5. 选取 200 μm 立铣刀钻头并将其移动到 x， y 原点。卸下 z 传感器。小心地降低钻头，不要接触丙烯酸表面。
   6. 以 14，500 rpm 的速度旋转 200 μm 立铣刀钻头。慢慢将其降低到 z 轴上的原点坐标 （z = 0）。将 z 轴重置在原点下方 30 μm。将此坐标设置为新的 z 原点。
      注:如果钻....

结果

有可能建立一个高度可重复的制造方案，以提高传统微铣削技术的分辨率。使用该协议，可以实现在200μm高通道中作为交错限制运行的低至5μm高度的通道的制造。交错限制的简单设计可捕获直径为 7.5 μm 的铁微粒，当在微通道中压实时，当外部磁铁接近设备时，可以创建磁阱。该装置允许使用与目标分析物偶联的纳米颗粒作为免疫学支持物进行免疫测定。在这项工作中，进行了具有基于酶标记抗体的检测的非竞争性间接免疫测定。模型抗原（Ag）是与直径为100 nm的纳米颗粒（NPs）偶联的溶菌酶蛋白。以兔抗溶菌酶IgG为一抗（AbI），使用兔辣根过氧化物酶偶联二抗（HRP-AbII）进行检测。

通过将HRP-AbII与荧光底物在通过陷阱与包埋的纳米颗粒时相互作用后获得的荧光信号强度的变化相关联来进行检测。为了进行测量，确定了疏水阀之前的区域和之后的区域。图7A-D显示了给定荧光底物流速（3 μL/h）下不同浓度抗溶菌酶AbI的荧光强度增加:0 ng/mL、10 ng/mL、100 n.......

讨论

使用微铣削技术制备了一种使用纳米颗粒作为免疫载体的用于免疫测定的丙烯酸微流体装置。在基材上直接制造的方法具有避免使用母模以及这意味着时间和成本的优点。但是，它仅限于快速原型制作和大批量设备制造。

在这里，我们使用了先前报道的铣床¹²的附件压电平台。该平台通过3D打印制造，以创建垂直分辨率优于传统微铣床10μm分辨率的可变深度通道。我们实现了高达5μm高的通道的铣削，这些通道在200μm的微流体通道中形成交错限制。

制造微流体装置只需要两个直径为 200 μm 和 800 μm 的立铣刀钻头，无需手动更换钻头。所使用的铣床型号自动执行位交换，这有助于时间优化。此外，"Z0感应"模式允许通过接触传感器和铣床中包含的销，在z轴上自动高精度地确定原点。

该装置的设计很简单，仅由被 5 μm 交错限制中断的主通道和一个用作微粒吹扫和入口的附件通道组成。然而，这种结构的高精度对于捕获直径为7.5μm的铁微粒的限制是必需的。较大的限制允许.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.008 立铣刀	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 立铣刀	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
羰基铁微粒	Sigma-Aldrich	44890	7 μM
氯仿	Fermont	6201	健康危害：中等 可燃性：无 反应性：无 接触危害：中等
CMOS 相机 Moment	Teledyne 光度传感器		技术：CMOS 量子效率：73% 像素大小：4.5 µM x 4.5 和微型;m 支持的接口： USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	罗兰DGA公司		设计和创建表面雕刻路径的雕刻软件
抽气罩	未知	未知 未知
柔性塑料管	Tygon	AAD04103	ID = 0.020， OD = 0.060
荧光显微扫描	蔡司	Axio Vert.A1
高精度点胶针头	Loctite	98612
自制压电控制器应用	LabView		有关更多详细信息，请参阅参考文献 12。
乐泰 495 速干胶	汉高	49503	使用微量移液器吸头或分配针头涂抹
MagJET 分离架	thermoscientific		12 x 1.5 mL
机械压力机	自制
铣床	Roland	MDX-50
压电平台	自制		参见参考文献 12
聚甲基丙烯酸甲酯 - 片材 - PMMA，丙烯酸	Goodfellow	ME303018/1	厚度：1.3 毫米，透明度：透明/透明
PVCamTest 软件	Teledyne Photometrics	版本 3.10.107	图像采集软件
立体显微镜	尼康	SMZ 7457
SuperMag 羧基微珠	Ocean NanoTech	KSC0100 100	nm
注射泵	kd Scientific	KDS200	最多可容纳两个注射器
Utrasonic 浴	Branson	2800
VPanel 软件	Windows作系统	版本 1.0.3.0	用于控制微铣床的软件