一种通过透析液和导管建立的具有临床相关性的小鼠腹膜纤维化模型

摘要

严重的腹膜纤维化患者具有较高的发病率和死亡率。腹膜纤维化的机制尚不明确。在本研究中，我们描述了一种通过注射腹膜透析液诱导的简单的小鼠腹膜纤维化实验模型。

摘要

腹膜纤维化可发生于接受腹膜透析（PD）的患者，严重腹膜纤维化患者的发病率和死亡率较高。腹膜炎、高葡萄糖腹膜透析液以及长期进行腹膜透析均会诱发腹膜纤维化的发生。由于人体和细胞研究存在局限性，开展腹膜纤维化的动物研究十分必要。 体外 研究。然而，大多数动物模型无法模拟临床状况。为了研究腹膜纤维化，我们开发了一种具有临床相关性的小鼠模型，通过植入腹膜导管，并在21天内每天向腹腔内注射2.5%高葡萄糖腹膜透析液联合20 mM甲基乙二醛（MGO）。腹膜导管的植入避免了穿刺针引起的腹膜损伤，并更贴近临床腹膜透析患者的情况。免疫荧光染色显示，肌成纤维细胞在纤维化的腹膜中积聚。实验组的小鼠超滤量降低，腹膜膜转运功能（腹膜平衡试验）受损。本文中，我们提供了该模型的详细操作方案。

引言

腹膜透析（PD）是终末期肾病（ESRD）患者接受的一种肾脏替代治疗方式，约有11%的ESRD患者采用该疗法¹。研究表明，接受PD治疗的患者可发生腹膜纤维化²。包裹性腹膜硬化症（EPS）是腹膜纤维化的一种严重形式，具有较高的发病率和死亡率³。腹膜纤维化的危险因素包括腹膜炎、高葡萄糖腹膜透析液、长期PD治疗以及遗传因素⁴。腹膜纤维化的机制涉及腹膜微环境的复杂变化以及不同类型细胞之间的相互作用。体外实验和临床观察在揭示腹膜纤维化机制方面存在局限性，因此需要动物模型。在人类疾病研究中，通常使用狗、兔、猪、大鼠和小鼠等实验动物⁵，其中小鼠因体型小、成本低且易于操作而成为最常用的实验动物。此外，利用谱系示踪技术可在小鼠疾病模型中对特定细胞进行研究。

建立合适的动物模型有助于理解腹膜纤维化的病理生理学机制。理想的模型应具备成本低廉、易于复制的特点，并能为腹膜纤维化的临床治疗提供依据。

目前可用的腹膜纤维化动物模型是通过每日腹腔注射高葡萄糖透析液持续28天、每周三次注射氯己定葡糖酸盐（CG）持续3周，或单次注射次氯酸钠建立的^6,7,8。然而，这些模型存在局限性。尽管高葡萄糖透析液注射与临床实践高度相关，但仅能诱导轻度腹膜纤维化，无法重现重度腹膜纤维化（如腹膜硬化性包裹综合征，EPS）的临床状况。CG或次氯酸盐可通过化学损伤诱导出类似EPS的重度腹膜纤维化⁹。然而，CG和次氯酸盐诱导腹膜损伤和纤维化的机制可能与高葡萄糖透析液不同。

本研究描述了建立小鼠腹膜纤维化模型的实验方案。在此模型中，首先插入腹膜透析导管，随后连续21天每日注射高葡萄糖腹膜透析液联合甲基乙二醛（MGO）。MGO是腹膜透析液中一种有毒的葡萄糖降解产物，可促进晚期糖基化终末产物的形成，从而诱导炎症反应和血管生成^10,11。在高葡萄糖腹膜透析液中添加MGO可诱导肌成纤维细胞积聚，并促进腹膜纤维化。因此，该模型能够模拟临床病理状态。

方案

实验经中国台湾大学医学院与公共卫生学院机构动物照护及使用委员会（IACUC）批准并依照其规定进行。所有小鼠均在标准护理条件下饲养。

1. 动物实验

1. 使用11周龄以上的雄性和雌性C57BL/6野生型（WT）小鼠。
2. 准备手术材料，包括小鼠用4法式硅胶套管、手套、手术巾、导管、缝线和针头。
3. 按以下步骤植入小鼠套管：
   1. 通过皮下注射给予小鼠氯胺酮/赛拉嗪（100/10 mg/kg体重）进行麻醉。
      1. 在手术过程中监测小鼠的呼吸频率和麻醉深度，以确保麻醉状态。
         注意：若小鼠呼吸变得急促而浅表，应追加先前剂量的20%。
   2. 将小鼠置于俯卧位，在左侧背部剃毛并清洁一块2 cm × 3 cm的区域，用聚维酮碘对皮肤进行消毒。
   3. 在左侧背部皮肤上做一个1.5 cm长的切口。
   4. 仔细分离左侧背部皮肤与肌肉之间的组织，创建一个1 cm × 2 cm的空间用于植入套管。
   5. 在左侧背部肌肉上穿刺一个小孔。
   6. 将小鼠套管的4法式远端部分完全插入腹腔内。
   7. 使用4-0尼龙缝线将套管根部固定于背部肌肉上。
   8. 将套管头部置于皮肤与背部肌肉之间。
   9. 用回形夹（7 mm）闭合皮肤。
      注意：由于小鼠常会啃咬伤口，回形夹优于缝线。
   10. 在套管植入7天后开始实验，将小鼠随机分为实验组和对照组。
   11. 注射液体前，用聚维酮碘对穿刺部位皮肤进行消毒。
   12. 实验组每日腹腔注射2.5%腹膜透析液（PDF）并含20 mM MGO，总体积为2 mL，持续21天；对照组注射生理盐水（NS）。

2. 腹膜功能测试（腹膜平衡试验）

1. 配制2.5%腹膜透析液（2 mL），并测定腹膜透析液的葡萄糖浓度，定义为初始葡萄糖浓度（D0）。
2. 将腹膜透析液注入小鼠腹腔导管端口。
3. 30分钟后，通过过量异氟烷（100%）麻醉处死小鼠。
4. 用注射器收集腹腔内液体，测定液体体积，定义为超滤量。
5. 测定腹腔内液体的葡萄糖浓度，定义为最终葡萄糖浓度（D）。
6. 计算腹膜平衡或腹膜功能¹²。
   ​注意：腹膜平衡试验¹² = 腹膜透析液最终葡萄糖浓度（D）/ 腹膜透析液初始葡萄糖浓度（D0）。葡萄糖浓度采用己糖激酶法，通过生化分析仪检测¹³。

3. 组织制备与组织学分析

1. 收集腹膜组织：右上腹壁（1 cm x 1 cm）和肝脏。用4%多聚甲醛固定腹膜组织2小时，然后在18%蔗糖溶液中过夜。⁷.
2. 制备4 µm厚的腹膜组织冰冻切片，并按照先前发表的方法进行组织学分析⁷.
3. 进行免疫荧光染色。
   1. 使用以下蛋白的一抗进行免疫标记：α-平滑肌肌动蛋白（SMA；2 h，1:200）用于检测肌成纤维细胞，细胞角蛋白（2 h，1:200）用于检测间皮细胞，以及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（5 min，1:1000）用于检测细胞核。
4. 以适当的形式展示所获得的数据。
   注意：本研究中数据以均值 ± 标准误表示。统计分析采用适当的统计分析软件进行。材料表），统计学显著性通过单因素方差分析或 t 检验进行评估。

结果

对腹膜组织的组织学进行检查，结果显示，腹透液联合MGO（PDF）组成功诱导了腹膜纤维化。对肝脏表面脏层腹膜进行免疫荧光染色，显示PDF组损伤腹膜中肌成纤维细胞的积聚较对照组更多。图1）。如图所示 图2A，PDF组的超滤量低于对照组。如图所示 图2BPDF组的腹膜平衡试验结果较对照组有所降低。这些结果表明，连续21天每日注射2.5% PD液联合MGO可成功诱导腹膜炎症与纤维化。

讨论

腹膜分为脏层腹膜和壁层腹膜，分别覆盖腹腔器官和腹壁。腹膜由单层间皮细胞、间皮下层、浆膜、成纤维细胞、淋巴细胞以及分泌的蛋白质组成¹⁴。腹膜纤维化表现为间皮细胞的丢失和剥脱、间皮下层增厚，以及大量炎性细胞（如肌成纤维细胞和巨噬细胞）的积聚^4,14。

腹膜纤维化的动物模型采用腹膜透析来诱导急性和慢性腹膜炎症。既往的急性腹膜炎症模型通过Staphylococcus epidermidis 无细胞上清液、细菌性腹膜炎以及含脂多糖的腹膜透析液来建立^6,15,16。研究表明，在腹膜透析液中添加脂多糖可诱导炎症细胞浸润，并增加腹膜细胞因子的产生和溶质转运¹⁵。既往的慢性腹膜...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
广谱细胞角蛋白抗体	abcam	ab9377
贝克曼库尔特	Beckman Coulter	AU5800	生化分析仪
DAPI，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚抗体	Sigma-Aldrich	98718-90-3
手术巾			任意
FITC标记山羊抗兔抗体	Jackson ImmunoResearch 二抗	111-095-144
手套			任意
GraphPad Prism	GraphPad Software	GraphPad Software 9.0
凯利钳			任意
甲基乙二醛（MGO）	Sigma-Aldrich
Mini-UTE 小鼠套管	Access Technologies	MMP-4S 061108B	小鼠4-French硅胶套管
单克隆抗肌动蛋白，α-平滑肌-Cy3抗体	Sigma-Aldrich	C6198
针头			任意
7 mm 反折夹			任意
4-0 尼龙缝线			任意