方法文章

测定放射性标记抗体与固定化抗原结合亲和力（KD）

DOI：

10.3791/63927

⸱

2022年6月23日

 ,  ,  , 
1Department of Radiology and Biomedical Imaging, Yale University

本文内容

摘要

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本文描述了一种测定放射性标记抗体与固定化抗原结合亲和力（KD）的方法。KD 是平衡解离常数，可通过饱和结合实验测定，即在不同浓度下测量放射性标记抗体与其抗原的总结合、特异性结合和非特异性结合。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

测定结合亲和力（KD）是放射性标记抗体（rAb）表征中的一个重要方面。通常，结合亲和力以平衡解离常数 KD 表示，其数值等于在平衡状态下一半抗体结合位点被占据时的抗体浓度。该方法可推广应用于任何放射性标记抗体或其他蛋白质和多肽支架。与基于细胞的方法相比，使用固定化抗原的方法特别适用于验证抗体长期储存后的结合亲和力、区分双特异性抗体结构中抗原结合片段（Fab）臂的结合亲和力，以及判断不同细胞系之间抗原表达是否存在差异。该方法包括将固定量的抗原固定在可拆分的96孔板的指定孔中，随后用牛血清白蛋白（BSA）封闭所有孔中的非特异性结合位点。然后，将放射性标记抗体（rAb）以浓度梯度形式加入所有孔中。所选的浓度范围应能使 rAb 达到饱和状态，即所有抗原均持续被 rAb 结合的抗体浓度。在未固定抗原的指定孔中，可测定 rAb 的非特异性结合。通过从固定抗原孔中的总结合信号中减去非特异性结合信号，即可确定 rAb 与抗原的特异性结合。rAb 的 KD 值由所得的饱和结合曲线计算得出。例如，本研究以放射性标记的阿米万他单抗（amivantamab）为例测定其结合亲和力，该抗体为一种针对表皮生长因子受体（EGFR）和细胞质间充质-上皮转化因子（cMET）蛋白的双特异性抗体。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

放射性标记抗体（rAb）在医学领域具有多种用途。尽管大多数应用于肿瘤学作为成像和治疗剂，但也存在用于风湿病相关炎症、心脏病学和神经病学成像的应用1。放射性标记抗体成像对病灶检测具有高灵敏度，并有望辅助患者治疗方案的选择2,3,4,5。由于其对相应抗原的高度特异性，这些抗体也被用于治疗。在一种称为“诊疗一体化”（theranostics）的策略中，同一种放射性标记抗体被同时用于成像和治疗6。

理想情况下，用于放射性标记的抗体应是那些已通过非放射性标记方法证实具有高结合亲和力和特异性的抗体。抗体的放射性标记可通过将放射性核素直接化学修饰抗体，形成稳定的共价键（例如放射性碘标记），或通过与螯合剂偶联后再结合放射性金属的间接方法实现7,8。直接放射性标记（如放射性碘标记）会特异性修饰抗体上的酪氨酸和组氨酸残基。如果这些残基对与抗原的结合至关重要，则此类放射性偶联可能改变抗体的结合亲和力。相反，目前已有多种成熟的抗体偶联及间接放射性标记方案。例如，常用于抗体正电子发射断层成像（PET）中结合锆-89（89Zr）的螯合剂为对异硫氰酸苄基去铁胺（p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, DFO），该螯合剂随机与抗体的赖氨酸残基发生偶联9,10。如果抗原结合区域存在赖氨酸残基，则在这些位点的偶联可能在空间位阻上干扰抗原结合，从而影响抗体与抗原的结合能力。因此，用于抗体直接或间接放射性标记的不同放射性偶联方法均可能影响免疫反应活性，即放射性标记抗体（rAb）与其抗原结合的能力7,11。位点特异性偶联技术可克服这一局限，但这些方法需要对抗体进行工程改造以引入额外的半胱氨酸残基，或需具备针对碳水化合物残基的酶促反应专业技术12,13,14,15,16。一旦完成抗体的放射性标记，检测其是否保留免疫反应活性是rAb表征过程中的重要环节。评估免疫反应活性的一种方法是测定rAb的结合亲和力。

本实验方案的目的是描述一种利用已建立的放射性配体饱和结合实验来测定单克隆抗体（rAb）结合亲和力的方法，以量化rAb与抗原的结合。结合趋势如图1所示。当向固定量的固定化抗原中逐渐增加rAb的量时，结合的抗原量将随之增加。一旦所有抗原结合位点被完全占据，结合量将达到平台期，继续添加rAb将不再影响结合抗原的总量。在此模型中，平衡解离常数（KD）是指占据一半抗原受体结合位点所需的抗体浓度17。KD值反映抗体与其靶标结合的能力，KD值越低，表示结合亲和力越高。先前有报道指出，理想的rAb其KD应为1纳摩尔或更低18。然而，近年来开发的一些rAb其KD处于低纳摩尔范围，已被认为适用于无创成像应用19,20,21,22。在rAb的放射性配体饱和结合实验中还可确定另一参数Bmax，其代表抗原最大结合容量。如有需要，可通过Bmax计算抗原分子的数量。

结合亲和力曲线；抗体-抗原相互作用，Kd，Bmax，浓度，饱和曲线。
图 1：典型的饱和结合曲线。结合抗原的百分比随加入抗体浓度的增加而变化，抗原量保持恒定。插图展示了在不同点的结合情况。图中分别标出了对应于 KD 和 Bmax 的浓度与结合量。本图使用 BioRender.com 制作。请点击此处查看此图的放大版本。

该检测对于放射性标记的双特异性抗体构建体尤为重要，可用于测定放射性标记双特异性抗体的每个抗原结合片段（Fab）臂与其相应抗原结合时的KD值。本方案可用于在固定化的抗原上分别测定每个Fab臂的KD，以独立评估放射性标记化后各Fab臂对其相应抗原的结合亲和力是否受到影响。本方案以放射性标记的阿米凡妥单抗（amivantamab）为例进行演示，该抗体为靶向表皮生长因子受体（EGFR）和细胞质间充质-上皮转化因子（cMET）蛋白的双特异性抗体19。同时，也以放射性标记的单臂抗体作为示例，其中一臂结合EGFR（α-EGFR）或cMET（α-cMET），另一臂为同型对照19。本方案同样适用于任何可被固定的、具有已知抗原的放射性标记抗体。在本方案中，将放射性标记抗体（rAb）的系列稀释液分别加入特定孔中，这些孔内含有固定量的、针对rAb各Fab臂的固定化抗原。同时，也将rAb加入仅用牛血清白蛋白（BSA）封闭但不含抗原的孔中，以测定非特异性结合。通过从总rAb结合量中减去非特异性结合量，得到特异性结合量。随后利用所得的饱和结合曲线确定KD值，具体方法如上所述。

与使用细胞系作为抗原来源相比，使用纯化抗原的这一方法具有更高的可重复性，因为抗原表达水平可能在细胞培养过程中受到影响，且不同细胞系的抗原表达水平存在差异。对于放射性标记的双特异性抗体，可能无法获得仅表达其中一种抗原而不表达另一种抗原的细胞系，这将使得对各个Fab片段结合亲和力的表征变得非常困难。值得注意的是，放射性配体饱和结合实验方法相较于非放射性方法的一个关键优势在于，能够特异性地表征rAb的结合亲和力，而不受rAb中未偶联组分的干扰。据作者所知，目前尚无纯化技术可将rAb与其未偶联的母体抗体分离。鉴于螯合剂和放射性核素的相对分子量较小，它们对rAb整体分子量的影响在尺寸排阻色谱中可忽略不计。因此，任何放射性标记技术所产生的产物几乎总是rAb与其未偶联母体抗体的混合物。采用放射性标记饱和结合实验进行结合亲和力表征，可确保被检测的产物仅为rAb本身。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：协议的图示请参见图2。

ELISA 示意图，抗原-抗体相互作用，微孔板分析，高至低浓度梯度。
图 2：实验方案示意图。 行和列标签用于指导可拆分的 96 孔板的设置。图中示例孔展示了抗原和 BSA 的预期结合情况。弯曲箭头表示预期会被洗脱的 rAb，该 rAb 仅存在于仅包被 BSA 的孔中。本图使用 BioRender.com 制作。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 缓冲液的配制

  1. 配制 50 mL 固定缓冲液（50 mM Na2CO3 水溶液；pH = 9.0）。
    1. 在称量纸上称取 191 mg NaHCO3 和 23.9 mg Na2CO3，转移至 50 mL 锥形管中。加入 40 mL 18 MΩ 水，涡旋振荡至溶解。必要时调节 pH 至 9.0，再用 18 MΩ 水定容至 50 mL。
  2. 在 250 mL 瓶中加入 200 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）和 100 µL Tween-20，配制约 200 mL 洗涤缓冲液（含 0.05% Tween-20 的 PBS）。
  3. 配制 50 mL 结合缓冲液（含 0.05% Tween-20 和 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS）。
    1. 在称量纸上称取 50 mg BSA，转移至 50 mL 锥形管中。加入 50 mL PBS，再加入 25 µL Tween-20，轻轻涡旋混匀。
  4. 配制 50 mL 封闭缓冲液（含 3% BSA 的 PBS）。
    1. 在称量纸上称取 1.5 g BSA，转移至 50 mL 锥形管中。加入 50 mL PBS，轻轻涡旋混匀。
      注意：建议所有缓冲液于 4 °C 保存，最长不超过 1 周，以获得最佳效果。

2. 抗原固定

  1. 用固定化缓冲液将抗原稀释至浓度为 5 µg/mL。
  2. 在可拆分的 96 孔平底板中，以 8 × 3 阵列形式（A-H 行的第 1-3 列）向 24 个孔的底部每孔加入 100 µL 抗原。用封板膜覆盖板孔。
    ​注意：确保微孔板表面经过处理，以最大程度吸附混合的疏水性和亲水性区域。此类预处理板可商业购得。
  3. 在 4 °C 下孵育过夜。
  4. 次日，用洗涤缓冲液洗涤板孔 3 次。
    1. 迅速将板倒置在水槽中以弃去液体，并将板轻敲在一堆纸巾上，去除残留液体。
    2. 使用多通道移液器，向含有抗原的每孔加入 300 µL 洗涤缓冲液。按步骤 2.4.1 所述方法弃去液体。总共重复洗涤三次。

3. 使用 BSA 封闭非特异性位点

  1. 使用多通道移液器，向96孔板的24个包被抗原的孔和24个空孔（A-H行的1-6列）每孔加入300 µL封闭缓冲液。
  2. 将板在室温下孵育1小时。
  3. 用洗涤缓冲液对板进行洗涤，每孔300 µL，共洗涤三次。有关板洗涤的详细说明，请参见步骤2.4。
     

4. 重组抗体溶液的系列稀释与添加

警告：以下步骤涉及放射性物质。仅允许接受过辐射安全培训的人员进行操作。研究人员应戴双层手套，并在充分屏蔽的条件下进行操作。

  1. 采用选定的方法合成待研究的重组抗体（rAb）。作为示例使用的rAb按先前所述方法合成19。
    注意：本方案重点在于放射性标记后对rAb的表征。
  2. 用结合缓冲液对rAb进行8个3倍系列稀释（分别对应于板上的A-H行）。
    注意：不同rAb的系列稀释浓度会有所不同。具体细节在讨论部分中讨论。如果稀释倍数发生变化，应重新计算每次稀释所需的体积，以确保有足够的体积用于：1）每个孔中rAb的结合；2）接种下一个稀释液；以及3）分装用于γ计数的rAb标准溶液，以测量加入各孔的总rAb放射性。
    1. 计算配制第一浓度（标记为A）1.2 mL溶液所需的rAb原液体积。
    2. 向标记为B、C、D、…、H的微量离心管中各加入800 µL结合缓冲液。向标记为A的微量离心管中加入1.2 mL减去步骤4.2.1中计算出的体积的结合缓冲液。
    3. 将步骤4.2.1中计算出体积的rAb原液加入A管中。轻轻涡旋混匀，然后使用小型微量离心机离心，使所有液体沉降至管底。
    4. 从A管中取400 µL加入B管中，涡旋混匀后离心。重复此操作，依次从B到C、C到D、…、G到H进行转移和混匀。
  3. 将每种稀释液各100 µL分别加入三个固定有抗原的孔和三个仅用BSA封闭的孔中。例如，将稀释液A加入A1-A3孔（抗原）和A4-A6孔（BSA）。
  4. 将每种稀释液各100 µL加入标记为A std - H std的微量离心管中。保存这些管作为rAb标准品，用于γ计数器检测。
  5. 在37 °C下轻轻振荡孵育板1小时。

5. 洗涤平板并检测放射活性

  1. 为每个孔（A1 至 A6、B1 至 B6……直至 H1 至 H6）标记微量离心管。如需，可使用两种不同颜色的记号笔对样品进行颜色编码——一种用于包被抗原的孔，另一种仅用于包被 BSA 的孔。
  2. 使用真空吸液器从每个孔中吸出放射性抗体（rAb）。
  3. 使用多通道移液器，向每个孔中加入 300 µL 洗涤缓冲液。吸去洗涤缓冲液。总共重复洗涤五次。
  4. 将各孔拆下，并分别放入相应的微量离心管中。
  5. 使用γ计数器测定各管中的放射性。首先测定含抗原的管（H1、H2、H3 至 A1、A2、A3），然后测定仅含 BSA 的管（H4、H5、H6 至 A4、A5、A6）。为尽量减少干扰，应在不同时间分别测定每种稀释度的标准品（H std 至 A std）。

6. 数据分析

注意：补充文件包含用于分析和绘制数据的相应电子表格和统计分析模板。

  1. 在电子表格中，计算每个样本的总结合、特异性结合和非特异性结合（参见作为补充文件附带的电子表格模板）。
    1. 将样本的每分钟计数（CPM，来自γ计数器）除以相应标准品的CPM，计算“结合活性”。将“结合活性”乘以100，计算“%结合”。
    2. 通过将“%结合率”乘以所加rAb的浓度（mol/L）来计算“总结合量，mol/L”。通过将“总结合量，mol/L”乘以所加rAb的体积（以升为单位，0.0001 L）来计算“总结合量，mol”。
    3. 通过从抗原稀释液的“总结合量，mol”中减去牛血清白蛋白（BSA）稀释液的“总结合量，mol”，计算“特异性结合量，mol”，即 A1 与 A4 配对，A2 与 A5 配对，A3 与 A6 配对，B1 与 B4 配对，依此类推。
    4. 通过从每个孔的“总结合量，mol”中减去“特异性结合量，mol”，计算“非特异性结合量，mol”。
  2. 在统计分析绘图软件中，以添加的 rAb 浓度（nmol/L）为横坐标，结合量（mol）为纵坐标作图。分别设组绘制总结合、特异性结合和非特异性结合的三复孔数据。在所用软件中选择以下参数进行非线性拟合分析：材料表；参见作为补充文件附上的统计分析模板。
    1. 选择 新分析. 在……之下 XY分析，选择 非线性回归（曲线拟合）确保选择所有数据 分析哪些数据集？ 然后选择 好的.
    2. 在 模型 标签，位于下方 结合 - 饱和，选择 单一位点特异性结合. 在 信心 标签，选择 识别“模糊”拟合保留所有其他参数为默认设置，并选择 好的.
      注意：这将计算 KD 以及总结合、特异性结合和非特异性结合的Bmax。KD 特异性结合的KD 以 nmol/L 表示的与抗原结合的 rAb 量。

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结果

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该方法用于计算结合亲和力（KD基于饱和结合实验测定rAb的亲和力，其中将不同浓度的rAb加入固定量的固定化抗原中。结合曲线应呈现对数增长特征，初始阶段上升较陡，随着抗原趋于饱和，曲线进入平台期。为确保所测定的KD 准确时，rAb 的浓度必须足够高以达到饱和。在本实验中，将放射性标记抗体与 DFO 偶联并进行放射性标记 89Zr，如前所述19. 图3 显示典型的饱和结合曲线。放射性标记的阿米万他单抗（amivantamab）是一种针对表皮生长因子受体（EGFR）和细胞质间质-上皮细胞转化因子（cMET）蛋白的双特异性抗体，其与EGFR结合（图3A）和 cMET（图3B蛋白质19饱和结合曲线还展示了单臂放射性标记的Fabs与EGFR结合的情况（图3C

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在重组抗体（rAb）的开发过程中，确保重组抗体能够以高亲和力特异性结合其靶标至关重要。通过使用固定化抗原的放射性配体饱和结合实验，可以确定结合亲和力，从而判断放射性标记是否影响重组抗体的免疫反应活性。测定重组抗体与牛血清白蛋白（BSA）的结合情况，可用于量化非特异性结合，从而更准确地测量其对固定化抗原的特异性结合。该方法通过检测不同浓度重组抗体的结合情况，绘制饱和结合曲线，进而计算解离常数（KD）并确定其结合亲和力。

进行该检测时，必须具备待研究单克隆抗体（rAb）的抗原。该抗原需要含有抗体所结合的表位。在新型抗体的结合表位未知的情况下，使用非放射性标记的方法测定结合亲和力可能更为合适。在开始实验之前，建议进行文献检索。此前已在基于ELISA的检测中成功使用的感兴趣抗原，很可能也适用于本检测。

根据放射性核素的半衰期 根据伽马计数器的灵敏度，标准品可能需要一定时间衰变至伽马计数器可准确定量的放射性水平。若预计放射性水平过高，超出伽马计数器的检测范围，可对标准品进行稀释，随后在数据分析时乘以相应的...

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢3D Imaging提供了[89Zr]Zr-草酸盐，并感谢强生制药公司的Sheri Moores博士提供了抗体。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA9647
γ计数器HidexHidex Automatic Gamma Counter
GraphPad Prism 软件GraphPad版本 9.2；本研究用于统计分析
免疫可断裂 MaxiSorp 96 孔板Thermo Scientific473768
微孔板封板膜Corning4612
Microsoft ExcelMicrosoft
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190144
碳酸氢钠JT Baker3506-01
碳酸钠Sigma-AldrichS7795
Tween-20Sigma-AldrichP7949

参考文献

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