使用差分动态显微镜定量细胞骨架动力学

摘要

差分动态显微镜（DDM）结合了动态光散射和显微镜技术的特点。本文介绍了利用DDM通过量化波形蛋白网络中粒子的亚扩散和受限运动，以及活性肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管复合物的弹道运动，来表征重建细胞骨架网络的过程。

摘要

细胞能够爬行、自我修复并调节其刚度，这得益于其高度动态的细胞骨架。因此，重构细胞骨架生物大分子网络可能带来一系列具有活性和适应性的材料。然而，要精确调控此类材料的性能，需要测量其动态行为如何依赖于网络组成和合成方法。由于复合网络在时间、空间和配方空间上存在变异性，对这类动态行为的量化面临挑战。本文所述方案介绍了一种傅里叶分析技术——差分动力显微术（DDM），可用于量化生物大分子网络的动力学特性，尤其适用于细胞骨架网络的研究。DDM 可应用于多种显微成像模式获取的时间序列图像，包括激光扫描共聚焦显微镜、宽场荧光显微镜和明场成像。从这些图像序列中，可以提取出在不同波矢范围内密度涨落的特征去相关时间。本文还开发了一个用户友好的开源 Python 软件包，用于执行 DDM 分析。利用该软件包，可以测量标记的细胞骨架组分或嵌入的示踪粒子的动力学行为，本文以中间丝（波形蛋白）网络和活性肌动蛋白-微管网络的数据为例进行了演示。即使没有编程或图像处理经验的用户，也能借助该软件包及其配套文档完成 DDM 分析。

引言

细胞骨架是由贯穿真核细胞细胞质的蛋白质纤维构成的网络结构，连接细胞表面与细胞核。它具有独特的材料特性，既能提供机械保护以抵抗大而反复的机械负荷，又能驱动细胞形态的动态变化¹。重建的细胞骨架网络可产生多种有趣的动态行为，从对嵌入颗粒的笼效应到由分子马达驱动的弹道运动^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}。分析此类网络动态的方法包括追踪嵌入的示踪微球的运动^6,7,12,13,14、通过图像分析追踪蛋白质密集簇大小随时间的变化⁸、动态光散射¹⁵、粒子图像测速法^{4,16,17,18,19}、计算图像时间序列的功率谱密度¹⁹，以及明场图像时空图（kymograph）分析²⁰。随着越来越多关于重建细胞骨架网络的研究开展，无论是为了理解细胞力学还是活性物质，对稳健、无偏且可重复的动态表征方法的需求日益增长。差分动态显微技术（Differential dynamic microscopy, DDM）^21,22是一种相对较新的技术，已被用于研究细胞骨架动态，该方法仅需少量用户定义参数即可高效量化动态过程。通过本文所描述的软件包，即使缺乏编程或图像分析经验的研究人员也能将其应用于自身研究工作。

DDM 是一种用于提取样品动力学信息的图像分析技术。与粒子追踪或粒子图像测速法类似，DDM 需要一系列时间序列图像（通常为数千幅图像），这些图像通常通过显微镜记录获得。与粒子追踪不同的是，DDM 不需要在图像中对单个特征或示踪微粒进行定位（甚至不要求其可被定位）。与粒子追踪和粒子图像测速法均不同的是，DDM 可以通过相对较少的用户设定参数来恢复整体动力学行为。在 DDM 中，图像在傅里叶空间中进行分析，以确定密度涨落在不同波数 q 下的衰减时间，其中 q = 2πu，u 为空间频率的幅值 。 通过 DDM 可获得类似于散射技术的信息，但所用图像是在显微镜下获取的真实空间图像^21,22,23。因此，可以充分利用显微镜的各种对比度生成方法，例如宽场荧光^22,24、共聚焦荧光²⁵、偏振光²⁶、暗场²⁷或光片荧光²⁸显微技术。此外，用于 DDM 分析的图像也可同时用于粒子追踪或粒子图像测速，以提供互补的信息。

动态光散射与光学显微镜特征的结合，使差分动态显微技术（DDM）成为一种强大且多功能的技术。自2008年Cerbino和Trappe首次描述该技术以来²¹，DDM已被用于测量73 nm胶体颗粒的扩散行为，并进一步应用于流动胶体²⁹、胶体聚集^30,31、向列型液晶的黏弹性²⁶、胶体凝胶的动力学³²、粗化泡沫³³、受限环境中纳米颗粒的运动^34,35,36,37、细菌运动性^38,39,40,41、弱散射蛋白簇的扩散⁴²、流体界面的毛细波⁴³以及其他系统。希望了解DDM应用相关更完整文献列表的读者可参考该领域的几篇全面综述论文^22,23,44,45。

DDM 还被用于研究生物网络的动力学。Drechsler 等人利用 DDM 测量了活体 Drosophila 卵母细胞中肌动蛋白的动力学过程⁴⁶。Burla 等人量化了透明质酸及透明质酸-胶原复合网络中示踪粒子的动力学行为⁴⁷。已有多个研究报道了 DDM 在以下方面的应用：研究重建细胞骨架网络中示踪粒子的动力学^9,10、DNA 分子在这些网络中的传输过程^48,49，以及活性重建网络的动力学特征^11,50,51。DDM 在测量此类系统动力学方面的一个优势在于，无需对单个粒子或分子进行定位和追踪。因此，即使在拥挤环境中难以追踪微小且非球形的分子，仍可利用 DDM 测量 DNA 分子的动力学行为。此外，结合荧光显微镜技术，可通过多色标记选择性地测量复杂复合体系中各个组分的动力学过程。

进行差分动力学显微技术（DDM）时，需随时间采集一系列图像，即 I(x,y,t)。对于给定的延迟时间 Δt，找出所有（或部分）间隔该延迟时间的图像对。计算每对图像差值的平方傅里叶变换，

进行计算并取平均。该量在动力学各向同性的前提下进行径向平均，得到差分动态矩阵（也称为图像结构函数）。此过程在图1中以图示方式展示。为了从该差分动态矩阵中确定样品的动力学行为，假设差分动态矩阵具有如下形式：

其中，A 为振幅，取决于显微镜的细节和样品的结构；B 为背景，取决于图像中的噪声；而 f(q, Δt) 为中间散射函数（ISF），包含有关动力学的信息^21,22。在简单情况下，

其中 τ 是特征衰减时间或去相关时间。这种强度自相关函数（ISF）已用于多项针对稀释胶体悬浮液等遍历系统进行 DDM 研究的工作中^{21,24,27,37,40,52}。然而，也可采用其他形式的 ISF 来模拟不同类型的动力学行为。例如，可使用累积量展开法对多分散样品的 ISF 建模如下：

其中 μ 是多分散性的一个度量^42,53；若密度涨落通过两种不同的模式衰减，则可使用类似如下的强度自相关函数（ISF）

^{26, 54, 55, 56, 57};

其他ISF也可用于游动的微生物或其他活性颗粒^{38,39,40,41,58,59}。

图 1：DDM 分析概览。 从图像时间序列中计算图像差分的傅里叶变换，以获得 DDM 矩阵。通过对 DDM 矩阵拟合模型，可确定在一系列 q 值范围内密度涨落的时间尺度。请点击此处查看该图的放大版本。

本文介绍了使用基于 Python 开发的 DDM 分析软件包 PyDDM。该软件包建立在我们研究实验室以及近年来其他已发表研究工作的基础之上。开发此软件包的主要动机包括：（1）需要跟踪和存储分析过程中使用的元数据与参数；（2）提供从头到尾完整详尽的分析文档，并附有详细示例；（3）能够便捷地采用不同数学模型（或创建新模型）对数据进行拟合（例如，添加散射强度函数（ISF）模型，如近期为活性纤丝开发的模型⁶⁰，将非常简便）。目前也存在其他用于 DDM 分析的软件包，但并非所有软件包都有良好文档支持，且使用开源编程语言编写。例如，已有基于 GPU 计算的 C++ 代码（https://github.com/peterlu/ConDDM）²⁵，使用时间域傅里叶变换以加速计算的 C++ 代码（https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro）⁶¹，MATLAB 和 Python 版本（https://github.com/MathieuLeocmach/DDM）⁴⁰，MATLAB 代码（https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html）²⁷，以及带有不确定性量化的 MATLAB 代码（https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ）⁶²。由于本 PyDDM 软件包具有完善的文档支持，并在 DDM 矩阵的计算与分析方式上提供了高度灵活性，因此有望为希望实现 DDM 分析的研究人员提供帮助，无论其是否具备编程或图像分析背景。

该方案展示了如何使用此软件包来量化动态过程 体外 重构的细胞骨架网络。该方法利用两组不同的成像数据：（1）通过明场显微镜获取的嵌入波形蛋白网络中的亚微米示踪颗粒的图像；（2）通过激光扫描共聚焦显微镜获取的含有肌球蛋白驱动活性的、交织复合网络中荧光标记的肌动蛋白与微管纤维的图像。对这两组数据的分析突显了差分动态显微技术（DDM）的显著优势，包括其能够分析多种成像模式（如明场或共聚焦荧光）所获得的图像，从嵌入的示踪颗粒或标记的纤维中提取动力学信息，以及量化多种类型的动力学行为（如亚扩散、受限运动或弹道式运动）。

方案

注意：可在以下 GitHub 仓库中找到与本方案各步骤相对应的 Jupyter Notebook 文件，https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples。该文件的 PDF 版本包含在补充文件 1中。此外，代码的详细说明以及每个函数和类的文档可在以下网站查阅：https://rmcgorty.github.io/PyDDM/。

1. 软件安装

1. 为了使用示例 DDM 分析文件，请安装 Jupyter Notebook 以运行代码。同时安装其他必需的常用 Python 包，包括 NumPy 和 Matplotlib。这些包均包含在 Anaconda 发行版中（参见 https://www.anaconda.com/products/individual）。
2. 安装 Python 包 xarray⁶³。该包对于组织和存储元数据及分析参数是必需的。如果使用 Anaconda 发行版，可使用以下命令安装 xarray（及其推荐的依赖项）：
   conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 bottleneck
3. 使用以下命令安装 PyYAML 包：
   conda install -c anaconda yaml
   该包对于读取待分析图像的元数据以及用户设置的分析和拟合参数是必需的。
4. 通过从 GitHub 仓库下载或使用 git 命令安装 PyDDM 包：
   git clone https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. 规划成像实验

1. 选择最合适的可用成像方式和光学设置。如前所述，差分动态显微技术（DDM）可与多种显微方法结合使用。
2. 为协助规划合适的物镜和图像尺寸，请根据像素大小和总图像尺寸确定将要探测的波数范围 q。基于这些计算结果，确认所选的放大倍数和视场范围是否最适合实验。在本研究分析的图像中，活性肌动蛋白-微管复合网络采用了60倍、数值孔径（NA）为1.4的物镜，图像尺寸为256 × 256像素，像素大小为0.83 µm；而在嵌入波形蛋白网络中的微球图像中，则使用了100倍、数值孔径为1.4的物镜，图像尺寸为512 × 512像素，像素大小为0.13 µm。
   注意：最小波数 q 由 2π/NΔx 决定，其中图像尺寸（假设为正方形）为 N × N 像素，像素大小为 Δx。最大波数 q 取 π/Δx 与 2π NA/λ 中的较小值，其中 NA 为成像物镜的数值孔径，λ 为光的波长（对于明场成像，可将 NA 替换为 (NA_objective + NA_condenser)/2）。
3. 接下来，考虑需要研究的时间尺度范围。通常，DDM 分析需基于至少1000帧的图像序列进行。
   1. 为确定合适的帧率，需考虑样品中特征移动约等于最小可分辨长度尺度（对应最大 q 值）距离所需的时间。
   2. 在考虑所探测时间尺度的上限时需注意，通常会对给定延迟时间 Δt 的数百个图像差分的功率谱进行平均，以获得足够的统计量从而降低噪声。因此，应采集比所探测的最大时间尺度更长的图像序列。
      ​注意：若已知预期的扩散系数 D 或速度 v，则可结合由视场和像素大小确定的 q 范围，利用 τ = 1/Dq² 或 τ = 1/vq 估算预期的特征衰减时间。在可访问的 q 范围内，预期 τ 值的范围有助于指导帧率和所需采集帧数的选择。

3. 样品制备与图像采集

注意：有关代表性结果部分所用数据的样品制备和成像设置的详细信息，请参见作者此前发表的文献^11,51,64 以及 补充文件 2。

1. 根据所探测的时间和长度尺度考虑，应获取理想情况下超过 1000 帧的图像序列。
   注意：该代码将分析图像中的方形区域或方形感兴趣区域，因此需相应调整帧的尺寸。
2. 将图像序列保存为三维灰度 TIFF 堆栈。或者，也可使用 Nikon Instruments 系统采用的 ND2 格式，所安装的软件包可读取该格式。若图像保存为其他格式，可使用 ImageJ 或其他图像处理程序将图像转换为 TIFF 堆栈。
   ​注意：若使用 ND2 文件，必须安装来自 https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader 的 nd2reader 软件包。

4. 参数设置

1. 在 PyDDM 代码仓库的 examples 文件夹中，复制示例参数文件 example_parameter_file.yml。使用如 NotePad++ 或 JupyterLab 中的文本编辑器打开该 YAML 文件。分析代表性结果部分所展示数据时所用的 YAML 参数文件示例，请参见补充文件 2。
2. 在复制的 YAML 文件中，填写待分析图像序列对应的数据目录路径和文件名。在 metadata 部分，填写像素尺寸和帧率。
3. 在 Analysis_parameters 部分，提供 DDM 矩阵计算方式的详细信息。其中部分参数为可选项。
   1. 至少需填写参数 number_lag_times 和 last_lag_time 的值。这两个参数分别表示计算 DDM 矩阵时所用的不同滞后时间点的数量，以及所用最长滞后时间（以帧为单位）。对于本研究中用于波形蛋白网络内示踪微球的数据，参数 number_lag_times 和 last_lag_time 分别为 60 和 1000。代码将从 1 帧（或若指定了可选参数 first_lag_time，则从指定的最小滞后时间）开始，以对数间隔计算至 last_lag_time 的 DDM 矩阵。
      注意：若共采集了 M 帧图像，则理论上可计算最大为 M-1 的滞后时间对应的 DDM 矩阵。但在如此大的滞后时间下，统计信息较差，数据可能噪声较大。计算 DDM 矩阵的最大滞后时间取决于数据的具体情况，但我们建议尝试约为整个图像序列总时长三分之一的值。
4. 在 Fitting_parameters 部分，提供 DDM 矩阵或中间散射函数（ISF）拟合方式的详细信息。在 model 参数下给出所选模型的名称。为所选模型中的每个拟合参数提供初始估计值、下限和上限。
   ​注意：要显示所有可用拟合模型的列表，可运行函数 print_fitting_models。这些模型也可在 PyDDM 网站的在线文档中找到。

5. 计算 DDM 矩阵

1. 初始化 DDM_Analysis 类的一个实例。为此，可通过传递包含完整文件路径的 YAML 文件名给 DDM_Analysis，以提供上述的元数据和分析参数；或者，也可以将元数据和参数作为 Python 字典数据结构传入。
2. 运行函数 calculate_DDM_matrix 以计算 DDM 矩阵。该计算可能需要数分钟或更长时间，具体取决于帧的大小和延迟时间的数量。典型的运行时间参见图2。
3. 检查返回的数据，其格式为 xarray 软件包中称为 Dataset 的数据结构。该数据结构存储在属性 ddm_dataset 下。
   注意：此数据结构不仅存储 DDM 矩阵，还包含相关变量和元数据。此外，它将以网络通用数据格式（netCDF）保存到磁盘。
4. 查看生成并显示的图表和图像。这些图表和图像也将以 PDF 文件形式保存在数据目录中。
   1. 其中一个生成的图展示了傅里叶变换图像的集合平均平方模量，即 随 q 的变化关系。默认情况下，代码使用该图来估计背景参数 B。可通过假设在 q 极大时 趋近于 B/2 来估计背景值，其中 B 为背景参数。
   2. 如果 在大 q 下未趋于平台，则应采用其他方法估计 B。为此，可在 YAML 文件中设置参数 background_method，或作为 calculate_DDM_matrix 函数的可选关键字参数传入。有关估计 B 的各种方法的更多细节见代表性结果部分。

图 2：计算 DDM 矩阵的计算时间。 在（A）和（B）中展示了计算 DDM 矩阵 所需的时间。所有情况下使用的数据均为一段包含 5000 帧、图像尺寸为 512 × 512 像素的视频。DDM 矩阵针对 30 个对数间隔的延迟时间（从 1 帧（0.01 s）到 1000 帧（10 s））进行计算。程序运行于一台配备 32 GB 内存的 Intel i7-10700 2.90 GHz 台式计算机上。在（A）中，展示了在每个延迟时间下用于计算 DDM 矩阵的图像差异数量变化的影响。为此，图像被分箱处理，使图像尺寸变为 256 × 256。对于每个延迟时间 Δt，选取相隔 Δt 的图像进行相减，并对所得矩阵进行傅里叶变换。对于给定的 Δt，可使用所有相隔 Δt 的图像对（以蓝色表示），或仅使用非重叠的图像对（例如第 1 帧与第 10 帧、第 10 帧与第 19 帧等；以棕色表示），或每个 Δt 最多使用 300 对图像。在（B）中，展示了图像尺寸变化对计算时间的影响。图像分别通过合并 2 × 2、4 × 4 或 8 × 8 像素进行分箱处理，得到的图像尺寸分别为 256 × 256、128 × 128 和 64 × 64。每种情况下，在计算每个 Δt 的 DDM 矩阵时均使用约 300 对图像。（C）从 DDM 矩阵中可提取中间散射函数（ISF）。图中展示了（A）中的三种情况。蓝色数据点（无偏移）对应于每个 Δt 使用最大数量图像对时的 ISF；棕色数据点（偏移 0.1）对应于每个 Δt 使用非重叠图像对时的 ISF；粉色数据点（偏移 0.2）对应于每个 Δt 最多使用 300 对图像时的 ISF。使用非重叠图像对得到的 ISF 在长 Δt 处表现出噪声。在这种情况下，长 Δt 时使用的图像对数量较少（例如，当 Δt 为 1000 帧时，仅使用了 4 对图像）。（D）通过将 ISF 拟合到指数函数，可确定每个波数 q 对应的特征衰减时间 τ。粉色结果显示了将原始图像按 2 × 2 分箱后（图像尺寸为 256 × 256）的结果；灰色结果显示了按 8 × 8 分箱后（图像尺寸为 64 × 64）的结果。通过对数据进行分箱处理，会丢失高波数下的动力学信息，但计算 64 × 64 图像的 DDM 矩阵比计算 256 × 256 图像快约 16 倍。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 拟合 DDM 矩阵或 ISF

1. 初始化 DDM_Fit 类的实例。为此，需将包含图像元数据和拟合参数的 YAML 文件的文件名传递给 DDM_Fit。
2. 确定用于拟合数据的 DDM 矩阵或 ISF 的模型。通过执行函数 print_fitting_models 来列出可用模型。可在 YAML 参数文件中指定所用模型，或使用函数 reload_fit_model_by_name 进行设置。
3. 在提供的 YAML 参数文件中，为所选模型的每个参数设置初始猜测值和边界范围。如需更改任意参数的初始猜测值，可使用函数 set_parameter_initial_guess；使用函数 set_parameter_bounds 设置参数的边界。例如，如 补充文件 2 所示，在波形蛋白网络中示踪微球的数据分析中，衰减时间的初始猜测值设为 1 s，该参数的边界范围设为 0.01 s 至 2000 s。
4. 使用函数 fit 执行拟合。将该函数的输出赋值给一个变量，以便于访问结果。
   ​注意：此函数可接受多个可选参数。有关这些参数的列表及其在何种情况下应设置为非默认值的说明，请参见代码文档和提供的示例。

7. 解读拟合结果

1. 使用 fit_report 函数生成用于检查拟合结果及拟合参数随 q 变化关系的图表。
   注意：该函数将生成一系列图表，并同时保存为 PDF 文件。可通过该函数的可选参数修改所生成的图表。
2. 生成的图表中将包含一个 2×2 子图，显示在四个 q 值（作为 fit_report 的可选参数指定）下的 DDM 矩阵或 ISF（取决于所选的拟合模型），以及利用模型和最佳拟合参数计算得到的 DDM 矩阵或 ISF。若要在交互式环境中绘制 DDM 矩阵或 ISF 及其最佳拟合结果，可在使用 Jupyter Notebook 环境时参考所提供的示例，使用 Browse_DDM_Fits 类。
3. 根据特征衰减时间 τ 与波数 q 的关系图，判断体系动力学行为属于扩散、亚扩散、弹道运动或其他类型的运动。可通过分析 τ 与 q 之间的幂律关系来实现。
   ​注意：由 fit_report 函数生成的 τ 与 q 的双对数图中，将显示三条直线，分别对应在指定 q 范围内的幂律拟合结果。实心黑色线表示将 τ 与 q 拟合为幂律关系 τ = 1 / Kq^β，其中 K 和 β 为自由参数；橙色虚线表示拟合为简单扩散关系 τ = 1 / Dq²，其中 D 为扩散系数；蓝色点划线表示拟合为 τ = 1 / vq，其中 v 为速度。

8. 保存结果

1. 拟合结果将保存在一个 xarray 数据集中。使用 xarray 的 to_netcdf 函数或 Python 内置的 pickle 模块将此数据结构保存到磁盘。使用 xarray 的 open_dataset 函数加载这些 netCDF 文件。
2. 使用 save_fit_results_to_excel 函数将拟合结果连同数据一起保存到工作表文件中。

结果

本文展示了使用 PyDDM 对两组不同实验数据进行分析的示例。在第一组实验中，将亚微米示踪微球嵌入由中间丝蛋白波形蛋白（vimentin）构成的网络中，并在明场模式下使用100倍物镜以每秒100帧的速度进行成像（图3A）。波形蛋白在间充质细胞中表达，是细胞质力学特性以及在受限迁移过程中细胞核机械稳定性的关键决定因素⁶⁵，^66,67。迄今为止，重组波形蛋白网络主要通过宏观流变学方法进行研究^64,68,69，而对其动力学特性的研究相对较少^13,70,71。这些实验的更多细节见于补充文件2。在另一组实验中，构建了包含肌动蛋白、微管和肌球蛋白的活性细胞骨架网络。通过光谱上可区分的荧光标记，使用60倍物镜的双色激光扫描共聚焦显微镜以每秒2.78帧的速度对肌动蛋白和微管纤维进行成像（图3B,C）。肌动蛋白和微管纤维均在动态细胞形态变化中发挥重要作用，其功能通过机械和生化相互作用协调实现⁷²。这些实验的更多细节见于文献¹¹。这些实验所采集图像序列中的单帧图像如图3所示。

图3：时间序列分析所得图像。（A）波形蛋白网络中0.6 µm微珠的明场图像。（B,C）使用激光扫描共聚焦显微镜配备60倍物镜拍摄的活性微丝-微管复合物中的（B）微管和（C）肌动蛋白图像，微管成像采用561 nm激发光，肌动蛋白成像采用488 nm激发光。请点击此处查看该图的放大版本。

对于波形蛋白网络中示踪微球的图像，以每秒100帧的速度记录了5000帧、每帧大小为512 × 512像素的视频。基于这些视频，在1到1000帧（即0.01秒至10秒）之间对数间隔的60个延迟时间点上计算了DDM矩阵。为了估计背景值B，计算了平方傅里叶变换图像的平均值，并将其设为等于^55,73。假设在最大的10%的q值范围内，该量等于B/2，且B与q无关。这是该软件包估计B的默认方法，但也可通过将background_method参数设置为其他值来采用其他方法。

利用从确定的参数A(q)和B，可以从DDM矩阵中提取中间散射函数（ISF）。示例ISF如图4所示。图4A展示了直径为0.6 µm的微珠嵌入vimentin浓度为19 µM的网络中时的ISF；图4B展示了相同类型微珠在vimentin浓度为34 µM的网络中的ISF。有趣的是，在这两种情况下，ISF均未衰减至零。对于遍历系统，在较大的延迟时间下，ISF应趋近于零，即此类系统中的密度涨落应在较大的延迟时间后完全失去相关性。此处ISF未衰减至零，可能是由于用于从计算得到的DDM矩阵中求取ISF的A(q)和B估值不准确所致。值得注意的是，本文采用的方法在某些情况下可能高估B⁶²。然而更可能的原因是示踪微珠的动力学本质上是非遍历的，因为微珠尺寸与网络网孔尺寸相近，因而可能被“笼困”。其他数据也支持非遍历性的发现：具体而言，微珠尺寸（0.6 µm）大于计算得到的网孔尺寸平均值，即19 µM浓度下的网孔尺寸为0.4 µm，34 µM浓度下为0.3 µm。此外，后续展示的这些示踪微珠的单颗粒追踪结果也显示出受限运动。

图4：波数不同时波形蛋白网络的中间散射函数。 散射强度函数（ISF）以延迟时间为变量，对应波数 q 的范围约为 1 至 9 µm^-1。(A) 直径为 0.6 µm 的微球在波形蛋白浓度为 19 µM 的波形蛋白网络中的 ISF。(B) 直径为 0.6 µm 的微球在波形蛋白浓度为 34 µM 的波形蛋白网络中的 ISF。ISF 在较长延迟时间下趋于一个明显高于零的平台值，表明系统具有非遍历性。请点击此处查看该图的放大版本。

鉴于动力学过程可能是非遍历的，将强度自关联函数（ISFs）拟合为以下形式：，其中C为非遍历性因子³²。该形式的ISF已在先前关于非遍历动力学的研究中被采用，例如胶体凝胶^32,74或肌动蛋白-微管网络中示踪粒子的研究¹⁰。图4中的黑色虚线展示了拟合结果及其对应的数据。通过这些拟合，可进一步分析衰减时间τ和非遍历性参数C随波矢q的变化关系。

图5：波数对波形蛋白网络衰减时间的影响。 通过对强度自相关函数（ISF）进行拟合，确定了一系列 q 值下的衰减时间 τ。为清晰起见，图中并未展示每个 q 值对应的 τ，而仅显示一组对数间隔的数据点。蓝色（浅褐色）数据点表示在波形蛋白浓度为 19 µM（34 µM）的波形蛋白网络中，0.6 µm 微球的成像结果。误差棒表示在多段视频中（19 µM 网络数据 [蓝色] 来自四段视频，34 µM 网络数据 [浅褐色] 来自五段视频）τ 的标准偏差。红色点划线标记了我们在时间和空间分辨率上的估计界限，具体说明见结果部分。实心黑线表示 标度关系，该关系对应于扩散运动。两组数据均未遵循此标度关系。相反，19 µM 网络中的微球表现出亚扩散运动（，其中 β > 2），而 34 µM 网络中的微球则表现出受限或笼状运动。请点击此处查看该图的放大版本。

衰变时间在低值区间表现出较大的不确定性 q 和高 q 极端情况，如所见 图5该图中的误差条表示对低波形蛋白浓度情况分析的四个视频或高浓度情况分析的五个视频之间的标准差。为了理解在这些极端情况下较大不确定性的来源，需同时考虑时间分辨率和空间分辨率。三个红色点划线标示了分辨率的近似极限。两条水平线对应所探测的最小和最大滞后时间。由于帧速率为每秒100帧，且最大滞后时间对应1000帧（占视频总时长的20%），因此在测量快于0.01秒或慢于10秒的动力学过程时，精度会下降。在较低浓度下 q-值，拟合得到的 τ 值大于 10 秒。因此，当衰减时间超过最大滞后时间时，应预期存在较大的不确定性。在较高范围的 q-范围内，衰减时间接近0.01秒的最小滞后时间，但仍高于该值。在较高浓度下，限制因素并非时间分辨率，而是 q 数值，空间分辨率可能是限制因素。鉴于像素大小为0.13 µm，最大值为 q 约为 24 µm^-1然而，受衍射极限限制的分辨率未必能够准确测量这些高空间频率下的动态变化。将光学分辨率近似为  导致波数上限约为16 µm^-1，给定物镜的数值孔径NA为1.4以及光的波长 。这在图中由垂直的红色点划线标出 图5. 事实上，在较大数值下数据噪声较大 q. 即使在此近似上限值之前 q，τ 的不确定性增加，这可能是由于高估所致 q_最大光学分辨率低于预期可能是因为使用了油浸物镜透过盖玻片对水性样品成像，或聚光镜未完全对准所致。

对于嵌入在较低浓度网络（19 µM 波形蛋白）中的 0.6 µm 微球，从衰减时间与波数的对数-对数图中可以观察到，衰减时间随波数的增加而减小，且其变化趋势符合幂律关系（图5）。然而，该趋势似乎并不符合正常扩散运动的预期行为，即 。相反，τ 随 q 的增加而更急剧地下降。这表明存在亚扩散运动，这种现象通常出现在此类拥挤环境中微球的运动中。将 τ(q) 在 1.4 µm^-1 至 12.3 µm^-1 的范围内拟合为形如 τ = 1/Kq^β 的幂律函数，可得到输运参数 K = 0.0953 μm^β/s 和 β = 2.2。对于更习惯通过示踪粒子均方位移（MSD）随滞后时间的变化（即 MSD = K' Δt^α）来理解正常扩散与亚扩散的研究者，需注意 MSD 方程中的亚扩散标度指数 α 与 β 的关系为 α = 2 / β。换句话说，β = 2.2 的值对应于 MSD 方程中 α = 0.9 的亚扩散标度指数。在 PyDDM 中，可通过在 YAML 文件中设置参数 Good_q_range，或向函数 generate_fit_report 传递可选参数 forced_qs，来指定对这一 q 值范围内的 τ(q) 进行拟合。对于此处的数据，q 从 1.4 µm^-1 到 12.3 µm^-1 的范围对应于 q 数组的索引 15 至 130。

对于浓度较高的网络（34 µM）中的0.6 µm微球，其衰减时间对q的依赖性很小。这可能是由于在网孔尺寸较小的网络中，微球表现出非遍历性。为了探究该系统中的非遍历性，应将非遍历性参数C作为q的函数进行作图，如图6所示。在19 µM波形蛋白网络中的0.6 µm微球，C ≈ 0.2，且对q的依赖性较弱（未显示）。然而，对于34 µM波形蛋白网络以及浓度更高的49 µM波形蛋白网络，C的对数与q²呈正比关系，如图6所示。这种C与q之间的关系符合受限运动的预期特征。对于被困在网络孔隙中的微球，均方位移（MSD）在足够长的延迟时间下预计将趋于平台值（即，其中为均方位移，δ²为最大均方位移）。由于强度自相关函数（ISF）可用MSD表示为，且非遍历性ISF在长延迟时间下趋近于C（即），因此可得关系式 ^32,75。因此，可通过C(q)求得δ²，结果得到34 µM和49 µM波形蛋白网络的δ²分别为0.017 μm²和0.0032 μm²（对应δ = 0.13 μm和0.057 μm）。

图6：波形蛋白网络的非遍历性参数与波数的关系。 通过对强度自相关函数（ISF）进行拟合，获得一系列 q 值下的非遍历性参数 C。图中橙色（红色）数据点表示在波形蛋白浓度为 34 μM（49 μM）的网络中，0.6 µm 微球成像所得的数据。误差棒表示多个视频中 τ 的标准差（34 μM 网络的数据来自五个视频 [橙色]，49 μM 网络的数据来自四个视频 [红色]）。纵轴采用对数刻度。可以观察到 C 随 q 的变化关系符合 ，由此可提取最大均方位移 δ²。实线表示对 的拟合结果。请点击此处查看该图的放大版本。

也可以采用其他方法从数据中提取限制尺寸 δ，以及通过分析19 µM 波形蛋白网络中微珠的 τ(q) 所得的亚扩散指数。首先，可采用 Bayles 等人⁷⁶ 和 Edera 等人⁷⁷ 描述的方法从 DDM 矩阵中提取均方位移（MSD）。值得注意的是，该方法无需对 DDM 矩阵进行拟合。只需计算 DDM 矩阵 D(q, Δt) 和 （由此可确定 A(q) 和 B）。然后，利用关系式 计算 MSD。需要注意的是，该方法在计算 MSD 时假设粒子位移分布为高斯分布，尽管先前的研究表明，在某些情况下，即使位移呈非高斯分布，由 DDM 得到的 MSD 仍与粒子追踪结果一致⁷³。对于本系统，如预期所示⁷⁸，大位移分布表现出非高斯特性，如图 S1 所示。在 PyDDM 软件包中，应执行函数 extract_MSD，该函数返回 。其次，也可采用单粒子追踪法获取 MSD。尽管 DDM 可用于分析因粒子密度过高或光学分辨率有限而难以准确定位粒子的图像，但对于波形蛋白网络中 0.6 µm 微珠的图像，我们能够使用 trackpy 软件（https://github.com/soft-matter/trackpy）⁷⁹ 实现微珠的定位与追踪。该粒子追踪软件包采用了 Crocker 和 Grier 所描述的算法⁸⁰。

图 7：波形蛋白网络的均方位移（MSD）与滞后时间的关系。 MSD 通过两种方法确定。首先，MSD 由 DDM 矩阵计算得出（以实心符号表示）。其次，通过单颗粒追踪（SPT）获取颗粒轨迹来确定 MSD（以空心符号表示）。误差棒的确定方式与前两个图注中所述相同。(A) 19 µM 波形蛋白网络中 0.6 µm 微球的 MSD 显示出亚扩散运动行为，两种计算 MSD 的方法之间具有良好的一致性。(B) 49 µM 波形蛋白网络中 0.6 µm 微球的 MSD 显示出受限运动行为，两种计算 MSD 的方法之间具有良好一致性，并且与非遍历性参数所得的最大 MSD 一致。请点击此处查看该图的放大版本。

0.6 µm珠粒在19 µM波形蛋白网络和49 µM波形蛋白网络中的均方位移（MSD）与滞后时间的关系如图所示 图7在两种情况下，通过动态散斑干涉测量法（DDM）确定的均方位移（MSD）与通过单粒子追踪（SPT）获得的MSD结果吻合良好。此外，对于浓度较低的网络，其亚扩散标度指数（α 在 约为0.9，这与 τ(q）的缩放  通过拟合ISF来确定 τ(q）（即 2/2.2 = 0.9）。对于浓度更高的网络，均方位移（MSD）在较长的滞后时间下趋于平稳。通过分析得到的最大均方位移（MSD） q非遍历性参数的依赖性（如图所示） 图7B 水平线位于 δ² = 0.0032 μm²）的值大致相同，该值似乎也是SPT和DDM两种方法测得的均方位移（MSD）在长滞后时间下趋于平缓的方向。DDM与SPT在最长滞后时间下测得的均方位移之间存在差异 图7A. 尽管这可能是由于较长滞后时间的轨迹数量有限所致，但也可能存在进一步优化范围的情况 q 用于估计 DDM 矩阵的值  对于每个滞后期（如 Bayles 等人所采用的方法）⁷⁶ 和 Edera 等人⁷⁷将有助于改善我们的结果，此类优化将是未来工作的重点。

这些实验记录了嵌入波形蛋白中间纤维网络中的示踪微球的图像序列，从而实现了两种独立的分析方法：DDM（使用本文所述软件包）和SPT（使用trackpy）。这两种分析方法均可揭示亚扩散程度和限制长度，使得研究者能够利用两种独立的图像分析技术获得互补的度量指标。此外，还可以从SPT和DDM中比较其他物理量。例如，样品动力学的异质性可能在SPT确定的粒子位移分布（即van Hove分布）中表现为非高斯性，也可能在DDM确定的中间散射函数（ISF）中体现为可被拉伸指数函数拟合的特征^34,35。图S1展示了波形蛋白网络中0.6 µm微球的van Hove分布，并讨论了通过拟合ISF得到的拉伸指数——这些指标在以往研究中被联合使用，以证明仿生系统^9,10,47或其他拥挤环境³⁴中粒子动力学的异质性。另一个例子是，可以通过SPT测量的粒子轨迹计算ISF，并与DDM获得的ISF进行比较。尽管均方位移（MSD）和位移分布是从SPT分析中最常提取的指标，但也可以从粒子轨迹计算ISF，，使用公式 （见图S2）。该ISF可与DDM生成的ISF进行比较，并用于揭示在MSD中不明显的动力学特征⁵⁹。

尽管在生物网络中获取示踪粒子的图像可使研究者结合使用单颗粒追踪（SPT）和差分动态显微（DDM）这两种互补的分析方法，但需要注意的是，DDM 相较于 SPT 的一个优势在于，它不需要能够被精确定位和追踪的微球（或其他特征结构）图像。为了说明这一点，接下来我们重点介绍肌动蛋白和微管纤维活性网络的分析，在该系统中，通过荧光标记肌动蛋白和微管蛋白，可利用多色激光扫描共聚焦显微镜对两种类型的纤维进行成像，并借助不同的荧光染料加以区分。

使用激光扫描共聚焦显微镜获取了由肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管网络的图像（兔骨骼肌肌球蛋白II；Cytoskeleton #MY02）。实验细节和结果此前已有描述¹¹，此处展示的代表性结果来自对补充材料中提供的两段视频（视频S1和S4）的分析¹¹。两段图像序列均以每秒2.78帧的速度连续记录，共采集1000帧。

为了分析这些图像，计算了50个延迟时间（从0.4 s到252 s，即1帧到700帧）下的DDM矩阵。随后将DDM矩阵拟合至模型 ，其中中间散射函数为 。因此，存在四个拟合参数：A、τ、s 和 B。这些拟合结果如图8所示。观察发现，特定q值的DDM矩阵在短延迟时间下出现平台期，随延迟时间增加而上升，随后在长延迟时间下再次趋于平台（或显示出开始趋于平台的迹象）。对于较低q值的DDM矩阵，在长延迟时间下未达到平台。因此，对于这些低q值（大长度尺度）的动力学过程，其衰减时间的测量精度应较差。

从对 DDM 矩阵的拟合中得到的特征衰减时间 τ 显示在图9中。结果展示了活性肌动蛋白-微管复合网络（类似于视频 S1¹¹）和活性肌动蛋白网络（类似于视频 S4¹¹）的情况。两种网络均以相同浓度的肌动蛋白和肌球蛋白制备，但仅含肌动蛋白的网络未添加微管蛋白，具体制备方法见文献¹¹。对于这两种类型的活性网络，观察到的幂律关系为 。该标度关系表明存在弹道式运动，且肌球蛋白驱动的收缩与流动主导了纤维的热运动。由 τ = (vq)^-1 可得，活性肌动蛋白-微管复合网络的特征速度 v 约为 10 nm/s，而活性肌动蛋白网络的特征速度约为 75 nm/s。这些数值与文献¹¹中相同视频的粒子图像测速分析结果一致。在较低 q 值下，活性肌动蛋白-微管复合网络不满足 标度关系。这可能是由于该肌动蛋白-微管复合网络在较低 q 值下的真实衰减时间超过了所计算 DDM 矩阵的最大滞后时间。最大滞后时间在图9中以水平红线标出，衰减时间在接近这些较长滞后时间时偏离了预期的 标度关系。

图 8：活性肌动蛋白-微管复合网络的 DDM 矩阵与延迟时间关系。 针对由 2.9 µM 肌动蛋白单体、2.9 µM 微管蛋白二聚体和 0.24 µM 肌球蛋白组成的复合网络视频，绘制了多个 q 值下的 DDM 矩阵随延迟时间的变化。这些数据展示了多色时间序列图像中仅微管通道的分析结果。请点击此处查看此图的放大版本。

图9活性肌动蛋白-微管网络的衰减时间与波数关系。 通过拟合 DDM 矩阵得到的衰减时间， τ，作为波数的函数， q，被发现。图中显示的是 τ 与 q 用于显示活性肌动蛋白-微管网络（仅分析微管通道）的图像以棕色表示，用于显示活性肌动蛋白网络的图像以绿色表示。两种网络中肌动蛋白和肌球蛋白的浓度相同（分别为 2.9 µM 和 0.24 µM）；肌动蛋白-微管复合物中含有 2.9 µM 的微管蛋白二聚体。活性肌动蛋白网络的衰减时间远小于活性肌动蛋白-微管网络的衰减时间，表明活性肌动蛋白网络的运动更快。在两种情况下，动力学行为均表现为弹道式运动，因为数据符合一条  趋势。插图：ISFs 与滞后时间按波数缩放后的关系图Δt × q) 显示在一定范围内ISFs的塌陷 q 数值。这也表明了弹道运动。此插图中显示的ISF来自活跃的肌动蛋白网络。 请点击此处以查看此图的放大版本。

对于该活性网络数据，我们选择对 DDM 矩阵进行拟合，。这与之前对波形蛋白网络中微珠数据的处理方式不同，在后者中，A(q) 和 B 无需拟合即可估算，以分离出强度自相关函数 ISF f(q, Δt)。而在本例的活性网络数据中，A 和 B 被保留为拟合参数，因为用于估算 B 的方法未能获得良好的拟合结果。默认的 B 估算方法是计算 ，并假设在大 q 值下其趋近于 B/2。然而，该方法对此数据中的 B 存在高估，这一点体现在：当使用此方式估算的 B 计算 ISF 时（未展示），早期延迟时间下的 ISF 值大于 1（而理论上 ISF 应从最大值 1 随延迟时间增加衰减至零或某个非遍历性参数）。用户可通过 background_method 参数选择其他估算 B 的方法。其中一种替代方法是将 B 估算为 DDM 矩阵在早期延迟时间下的最小值（通过设置 background_method=1 实现）。Bayles 等人⁷⁶ 曾采用过类似方法，但他们并未假设 B 随 q 保持恒定。另一种选择是将 B 估算为在最大 q 值处 DDM 矩阵在所有延迟时间上的平均值（通过设置 background_method=2 实现）。这些不同的背景估算方法，以及将 B 作为自由拟合参数的结果，均展示于图 10中。从这些图中可以看出，振幅 A 在所探测的最大 q 值下并未趋近于零，因为 在大 q 下未出现平台期（图 10B），且 D(q_max, Δt) 从较低延迟时间的平台值上升至较高延迟时间的平台值（即在 q_max 处存在非零的 A；图 10D）。因此，将 B 估算为 或 均不合适。在决定如何（或是否）估算 B 之前，应先检查 随 q 的变化以及 D(q_max, Δt) 随 Δt 的变化。

图10活性肌动蛋白-微管网络的背景信号与波数关系图 通过拟合 DDM 矩阵，可以确定背景信号， B，作为波数的函数， q如图所示 B 与 q 用于分析活跃的肌动蛋白-微管网络图像（仅分析微管通道），这些拟合结果以紫色符号表示。(中的三条实线A) 显示了未进行任何拟合时得到的背景估计值。( 中最上方的最深色线条A) 显示了使用估算的背景 ，如果适用，可能合适 在较大时趋于一个恒定值 q. 从（B），请注意 尚未在最大值处达到恒定值 q 检测。因此，使用该方法会高估背景信号。(A）显示了使用估计的背景 . 如果DDM矩阵显示出如（所示的较短滞后期平台C) 中的红线，那么此方法可能适用于背景估计。( 中间最浅的线A）显示了估计的背景 . 如果在 q_最大值，振幅， A，已降至零。从（D可以看出，振幅非零，因此该方法高估了背景值。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图 S1：粒子位移的概率分布。 粒子位移的概率分布在波形蛋白浓度为 34 µM 和 49 µM 时表现出非高斯特性。在不同浓度的波形蛋白网络中对直径为 0.6 µm 的微球进行了单粒子追踪。三种条件下的位移分布展示了不同的滞后时间。（A）19 µM 波形蛋白网络中的粒子位移分布可用高斯函数拟合。高斯分布的宽度随滞后时间增加而增大。（B）34 µM 波形蛋白网络中的粒子位移分布相较于 19 µM 情况表现出更强的非高斯性，尤其是在大位移区域。（C）49 µM 波形蛋白网络中的粒子位移分布同样表现出非高斯性。此外，其分布宽度随滞后时间的增加不如低浓度波形蛋白样品显著，表明粒子运动受到限制。非高斯型 van Hove 分布（在所有波形蛋白样品中均可见，但在较高浓度下更为明显）与异质性动力学相关，这通常出现在拥挤和受限环境中粒子的输运过程中。通过 DDM 分析确定的另一个异质性输运指标是用于拟合中间散射函数的拉伸指数（即本研究中 ISF 方程中的参数 s： + ）。在 q 值范围为 0.4 µm^-1 至 9.4 µm^-1 内的平均拉伸指数，从最高到最低波形蛋白浓度分别为 0.53 ± 0.07、0.64 ± 0.02 和 0.86 ± 0.04（均值 ± 标准差）。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：来自 DDM 和 SPT 的中间散射函数。 展示了五个不同波数下的中间散射函数（ISF）。通过 DDM 获得的 ISF 随滞后时间的变化以圆形标记表示，由单颗粒轨迹计算得到的 ISF 以空心方块表示。黑色虚线表示对 DDM 测得的 ISF 的拟合结果。单颗粒轨迹的 ISF 通过公式 ，并利用 进行计算。在（A）中，展示了 0.6 µm 颗粒在 19 µM 波形蛋白网络中的 ISF。在（B）中，展示了 0.6 µm 颗粒在 34 µM 波形蛋白网络中的 ISF。DDM 与 SPT 所得 ISF 之间的差异可能是由于长滞后时间轨迹的数量有限所致。请点击此处下载该文件。

补充文件1：使用DDM的方案。 本方案中所示步骤的输入与输出均已列出。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：波形蛋白网络的样品制备细节及示例参数文件。 提供了波形蛋白网络样品制备和图像采集的详细步骤。此外，还提供了一个用于分析代表性结果部分中波形蛋白网络数据的示例参数文件。请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述的软件包利用差分动态显微技术（DDM）分析通过光学显微镜获取的图像中观察到的密度波动。首先展示了嵌入波形蛋白网络中的示踪粒子数据的代表性结果。此类数据的分析可用于表征网络的网孔尺寸和刚度，其方式类似于以往许多细胞骨架网络研究中所采用的单粒子追踪方法^6,12,13。与单粒子追踪相比，DDM 的一个优势在于无需对粒子进行精确定位。因此，即使在粒子密度过高或粒子过小而难以定位和追踪的图像中，DDM 仍可确定其动力学行为。单粒子追踪更具优势的情况是需要考察粒子间个体差异时。使用 DDM 可获得系综平均的动力学信息，而使用单粒子追踪则可同时计算单个粒子的均方位移（MSD）以及系综平均的 MSD。然而，通过分析大视野中的多个感兴趣区域，DDM 也可用于研究非均质动力学行为。

接下来，展示了由两种不同荧光标记的细胞骨架纤维类型组成的活性网络中，荧光标记纤维数据的代表性结果¹¹。利用这些数据，无需图像中存在可定位的特征，即可表征弹道运动。由于差分动态显微技术（DDM）能够以极少的用户输入提取整体平均的动力学信息，因此便于直接比较在不同条件下获取的图像序列（例如，比较肌动蛋白与微管蛋白比例不同的样品，或肌球蛋白浓度不同的样品，如文献⁵⁰中所进行的实验）。此外，通过荧光成像，我们可以利用多色标记来研究网络中不同组分的动力学行为。文献^11,50中已实现该方法，即在活性肌动蛋白-微管复合网络中，通过多色成像分别分析了肌动蛋白和微管的动力学。在本文的代表性结果部分，仅展示了微管通道的结果，但在先前的研究中，我们已对微管和肌动蛋白纤维的动力学进行了比较¹¹。

我们注意到，这些代表性结果展示了被动亚扩散或主动弹道运动。重要的是，差分动态显微技术（DDM）可用于分析在中间时间或长度尺度上动力学类型发生转变的体系。例如，Kurzthaler 等人将 DDM 应用于主动 Janus 胶体体系，研究了短时间尺度下的主动定向运动以及长时间尺度下运动方向的随机化⁵⁹；Giavazzi 等人将 DDM 用于粗化泡沫体系，发现动力学的转变对应于气泡的特征长度尺度³³；Cho 等人将 DDM 用于胶体凝胶体系，发现在不同长度尺度下存在三个可区分的动力学区域，涵盖从分形团簇到整个网络的范围³²。

代表性结果部分包含的数据是通过明场显微镜和激光扫描共聚焦显微镜获得的。然而，如前所述，差分动态显微技术（DDM）可与多种成像模式联用。无论采用何种成像方式，使用者均应考虑光学设置，例如光学切片程度或景深。较高的光学切片程度可减少来自离焦物体的信号，但会导致无法准确测量物体在景深范围外移动时间尺度以上的动态行为^25,28。关于q依赖性景深如何影响DDM分析的更详细讨论，可参见文献²²。对于明场成像，使用者还需考虑样品厚度。对于弱散射样品，较厚的样品可能提供更强的信号⁴²，而浑浊样品则可能需要修改分析方法以考虑多重散射的影响⁸¹。最后，对于非线性空间不变的成像方法（即相机记录的物体强度取决于该物体在x-y样品平面中的位置），可能需要对线性空间变异进行校正，暗场DDM的应用已对此进行了演示²⁷。

对于刚开始使用 DDM 的研究者，我们希望强调考虑空间和时间分辨率的重要性。在检查衰减时间随波数的变化时，标记分辨率的极限非常重要（即最大和最小延迟时间以及最大波数，如图5所示）。在采集数据之前，应仔细考虑这些限制，以便选择最合适的物镜、图像尺寸、帧率和视频持续时间。另一个重要考虑因素是如何估计背景参数 B。文献中已采用多种方法来估计背景，且先前的研究已描述了对 B 的高估或低估所产生的影响^62,77。如图10所示，PyDDM 允许用户采用不同的方法来估计 B，我们建议新用户尝试这些方法，并评估哪些方法适用于其研究。

该软件包的一个优势是其详尽的文档和示例数据的操作指南，能够存储和组织元数据以追踪分析过程，并且在分析 DDM 矩阵方面具有灵活性（多种拟合模型、多种估计背景参数 B 的方法、以及计算均方位移 MSD 的能力）。然而，该代码仍有多方面可以改进。目前，代码尚未针对计算速度进行优化。已有文献报道了加快计算速度的方法^61,62，这些方法将在未来的版本中实现。此外，我们计划引入近期报道的方法，以更准确地估计不确定性，并利用模拟帮助用户选择合适的 ISF 模型⁶²。对于其他改进，我们希望用户能主动联系我们并提出建议。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CMOS 相机，Orca-Flash 4.0	Hamatsu
F-127 Pluronic	Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop	赛默飞世尔科技
尼康 Ti-Eclipse 显微镜	尼康
PLL-PEG-生物素	SuSos AG, Dü本多夫，瑞士
聚苯乙烯微球	Sigma Aldrich
蛋白质透析微型盒	赛默飞世尔科技
PyDDM	圣迭戈大学	N/A	开源软件，可从 https://github.com/rmcgorty/PyDDM 获取