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方法文章

利用低成本阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）通过慢病毒介导将shRNA递送至人胚胎干细胞和神经前体细胞

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DOI：

10.3791/63953

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2022年5月24日

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

本文内容

摘要

利用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI），我们高效地制备了用于在H9人胚胎干细胞（hESCs）中稳定表达shRNA的慢病毒颗粒，并实现了对H9来源的神经前体细胞（NPCs）的高效瞬时转导。

摘要

本方案描述了利用慢病毒颗粒高效地将短发夹RNA（shRNA）递送至人胚胎干细胞（hESC）以及由hESC衍生的神经前体细胞（NPC）的方法。通过使用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI），将携带shRNA的入门载体与包装质粒（pAX和pMD2.G）共同转染HEK293T细胞，从而产生慢病毒颗粒。病毒颗粒经超速离心浓缩后，平均滴度超过5 × 107。使用这些慢病毒颗粒可实现hESC和NPC的高效感染，这通过嘌呤霉素筛选及hESC中的稳定表达、以及NPC中绿色荧光蛋白（GFP）的瞬时表达得以证实。此外，Western blot分析显示，shRNA靶向基因的表达水平显著降低。同时，细胞仍保持其多能性及分化潜能，表现为后续可分化为中枢神经系统（CNS）的不同谱系。本方案主要涉及shRNA的递送，但该方法同样可用于cDNA的异位表达，以开展过表达研究。

引言

源自囊胚内细胞团的人胚胎干细胞（hESCs）具有多能性，可根据外部因素分化为不同类型的细胞 体外 条件1,2为了充分挖掘人类胚胎干细胞（hESCs）的潜力，必须具备快速且可靠的基因递送方法。传统上，所采用的技术 broadly 可分为两类：非病毒和病毒基因递送系统。3,4较为常用的非病毒基因递送系统包括脂质体转染、电穿孔和核转染。非病毒递送系统的优点在于插入突变较少，且整体免疫原性降低。5,6然而，这些方法的转染效率较低，且外源基因瞬时表达的持续时间较短，这成为长期分化研究的主要限制因素。7电穿孔相较于脂质体转染可实现更高的转染效率；然而，其导致的细胞死亡率超过50%8,9,10通过核转染技术，结合脂质体转染与电穿孔，可提高细胞存活率和转染效率，但该方法需要细胞特异性的缓冲液和专用设备，因此在大规模应用时成本较高11,12.

相比之下，病毒载体在转导后表现出更高的转染效率以及总体较低的细胞毒性。此外，所递送的基因能够稳定表达，因此该方法适用于长期研究。13在将基因递送至人胚胎干细胞（hESCs）的常用病毒载体中，慢病毒载体（LVS）是其中之一，使用高滴度病毒颗粒时可实现超过80%的转导效率。14,15脂质体转染与磷酸钙法4 沉淀法是瞬时转染HEK293T细胞或其衍生细胞系的常用方法之一，通常与基因转移载体及包装质粒共转染，以产生慢病毒颗粒16尽管脂质体转染法具有较高的转染效率和较低的细胞毒性，但该技术受限于其成本较高，若需扩大规模以获得高滴度的慢病毒颗粒，成本将极为昂贵。CaPO4 沉淀法获得的转染效率与脂质体转染法相对相似。尽管磷酸钙法成本较低4 沉淀会导致转染后出现显著的细胞死亡，这使得标准化操作以及避免批次间差异变得困难17在此情况下，开发一种具有高效转染率、低细胞毒性且成本效益高的方法，对于生产可用于人胚胎干细胞（hESCs）的高滴度慢病毒颗粒至关重要。

聚乙烯亚胺（PEI）是一种阳离子聚合物，可在对HEK293T细胞进行转染时实现高效转染，同时细胞毒性较低，且与基于脂质转染的方法相比成本极低18。在此情况下，PEI可用于大规模生产高滴度慢病毒（LVS）的应用，通过多种技术从培养上清中浓缩慢病毒颗粒。本文所述方法介绍了使用PEI转染HEK293T细胞，并通过蔗糖垫超速离心法浓缩慢病毒载体。采用该方法，我们通常获得的病毒滴度稳定高于5 × 107 IU/mL，且批间差异较小。该方法操作简便、直接，且成本效益高，适用于向人胚胎干细胞（hESCs）及其衍生细胞进行基因递送的大规模应用。

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方案

1. 使用PEI或Lipofectamine 3000试剂转染HEK293T细胞

  1. 将HEK293T细胞培养于含10% FBS和1×青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37 °C、5% CO2和21% O2的湿化培养箱中，直至细胞融合度达到90%时进行转染接种。为获得高滴度病毒，应使用较低传代次数的细胞（理想情况下低于P30）。
  2. 在100 mm组织培养皿中加入10 mL完全生长培养基，接种4 × 106个细胞，并在含5% CO2和21% O2的湿化组织培养箱中过夜培养。
  3. 每项转染实验中，将质粒DNA（1 mg/mL储备液）用1 mL无血清DMEM培养基稀释至1.5 mL离心管中，按以下比例加入进入载体和包装质粒：
    进入载体 = 10 µg
    psPAX2.0 = 7.5 µg
    pMD2.G = 5 µg
  4. 涡旋振荡10秒，然后在室温下以10,000 × g离心30秒以收集液体。
  5. 向管中加入70 µL（1 mg/mL储备液）PEI，按上述方法短暂涡旋并离心收集。所用PEI体积基于总DNA（µg）与PEI（µg）1:3的比例。
  6. 对于基于脂质体转染试剂（lipofectamine）的转染，将上述载体用500 µL无血清DMEM培养基稀释，并加入试剂盒提供的45 µL试剂P，室温孵育5分钟。
  7. 用500 µL无血清DMEM培养基稀释试剂盒提供的70 µL试剂L，室温孵育5分钟。
  8. 将两管内容物混合，室温孵育20分钟，以形成复合物。
  9. 将1 mL DNA/PEI或1 mL DNA/脂质体复合物逐滴加入含细胞的培养皿中，在37 °C、5% CO2和21% O2的湿化培养箱中孵育6小时。
  10. 6小时后，更换为新鲜完全生长培养基（10 mL），并将细胞放回含5% CO2和21% O2的湿化培养箱中继续培养。

2. LVS 的收集与超速离心

  1. 转染后第2天，收集含病毒的培养基，并再次用10 mL新鲜的完全生长培养基覆盖细胞。
  2. 转染后第3天，收集含病毒的培养基，并将其与第2天收集的含病毒培养基混合。
  3. 将病毒上清液在4 °C条件下以2,000 × g离心10分钟，沉淀细胞碎片。
  4. 使用孔径为0.45 µm的低蛋白结合滤膜（PES或SFCA材质）过滤上清液，并于4 °C保存至进行超速离心。含有慢病毒颗粒的滤过上清液可在4 °C保存5天，病毒滴度无明显下降。
  5. 用70%乙醇清洗超速离心管套管10分钟，晾干，盖紧，并于4 °C保存。
  6. 将36 mL含有慢病毒颗粒的滤过培养基加入无菌的超速离心管中。
  7. 用无菌移液条吸取4 mL无菌的20%蔗糖溶液（用PBS配制），加入5 mL无菌移液条中，并将其准确排至含有慢病毒的超速离心管（UC）底部。注意蔗糖溶液不应与培养基混合，需在管底形成梯度。
  8. 使用无血清DMEM培养基平衡所有超速离心管，放入预冷的超速离心管套管中，盖紧管盖。
  9. 在4 °C条件下以125,000 × g离心2小时。
  10. 离心结束后，将管内容物倒置于含漂白剂的容器中，小心弃去上清液，避免扰动沉淀物。若可见沉淀，可做标记。
  11. 将超速离心管置于一个50 mL无菌离心管中，并在沉淀物顶部精确加入200 µL无菌DPBS。于4 °C静置过夜。
  12. 次日，通过移液枪轻柔吹打40次进行混匀。
  13. 在台式离心机中以13,000 × g短暂离心，以沉淀任何残留碎片。
  14. 将上清液转移至新管中，并将病毒原液分装为每份20 µL。于−80 °C保存。
  15. 留出5 µL用于病毒滴度测定。

3. 基于pLKO.1载体的LVS滴度测定

  1. 根据制造商的建议，使用qPCR测定慢病毒颗粒的滴度。
  2. 为建立标准曲线，将试剂盒中提供的标准对照DNA进行5次10倍连续稀释：每次取5 µL DNA加入45 µL无核酸酶的H2O中。使用1:100至1:100,000的稀释度生成标准曲线。
  3. 在冰上以复孔方式设置反应体系，如下所示：
    2x qPCR预混液        10 µL
    引物混合液                          2 µL
    样品或标准DNA   2 µL
    无核酸酶H2O            6 µL
  4. 按照试剂盒说明书中的循环条件进行qPCR，共35个循环。
  5. 以循环阈值（Ct）为Y轴，病毒滴度为X轴作图。
  6. 利用四个标准对照DNA稀释样本（1:100至1:100,000）生成对数回归曲线，并通过趋势线方程计算未知病毒样品的滴度。

4. 基于pll3.7载体的LVS滴度测定

  1. 在感染前24小时，将1 × 105个HEK293T细胞接种至12孔板的每个孔中，每孔加入1 mL完全培养基。
  2. 在培养基中添加8 µg/mL聚凝胺，并将1 mL该培养基加入每个无菌的1.5 mL离心管中。
  3. 分别取4 µL、2 µL、1 µL、0.5 µL和0.1 µL浓缩的慢病毒颗粒，加入含8 µg/mL聚凝胺的1 mL培养基中进行稀释。
  4. 将HEK293T细胞的培养基更换为含有指定体积慢病毒颗粒及8 µg/mL聚凝胺的培养基，于37 °C、含5% CO2和21% O2的湿润培养箱中孵育24小时。
  5. 次日，更换为新鲜培养基，并继续在37 °C、含5% CO2和21% O2的湿润培养箱中培养72小时。
  6. 72小时后，用PBS洗涤细胞，按照生产商说明书在37 °C进行胰酶消化，并重悬于1 mL PBS中。
  7. 使用流式细胞分选仪进行FACS细胞分选，遵循生产商推荐的操作步骤。以未感染的HEK293T细胞设定门控为0% GFP阳性细胞，每份样品计数50,000个事件，以确定各病毒稀释度下的阳性细胞百分比。
  8. 仅选用产生2%–20% GFP阳性细胞的慢病毒颗粒体积，用于计算慢病毒颗粒的滴度。

5. hESC 的感染与稳定筛选

  1. 用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 6 孔细胞培养板中每个孔内生长的细胞。
  2. 加入 1 mL 1× 细胞解离试剂，于 37 °C 孵育 5 分钟，使细胞从培养板上脱离。
  3. 用 DMEM/F12 培养基收集细胞，并在室温下以 1,500 × g 离心 5 分钟，以收集细胞沉淀。
  4. 吸除上清，将细胞重悬于 1 mL 培养基中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
  5. 用含 mTeSR1 的完全生长培养基制备细胞悬液，终浓度为 2 × 105 个细胞/mL，培养基中需补充 10 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、青霉素/链霉素（P/S）和 10 µM ROCK 抑制剂（RI）。
  6. 在 50 倍稀释的完全基底膜基质包被的 P24 孔板中，每孔加入 500 µL 完全生长培养基，接种 1 × 105 个细胞，并将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 和 21% O2 的湿润化培养箱中进行培养。
  7. 次日，以感染复数（MOI）为 10 的病毒感染人胚胎干细胞（hESCs），同时加入 8 µg/mL 多聚素（polybrene），于 37 °C 孵育 8 小时。
  8. 8 小时后，弃去含病毒的培养基，更换为新鲜生长培养基（不含 RI），继续培养至细胞融合度达到 90%。
  9. 当细胞融合度达到 90% 时（通常为感染后 48–72 小时），开始使用嘌呤霉素进行筛选，浓度为 0.8 µg/mL。
  10. 筛选完成后（通常为 4–6 天），将稳定转染的细胞按 1:4 比例传代，并扩增细胞用于冻存及后续分析。

6. H9 来源的神经前体细胞（NPCs）的转导

注意：NPCs 采用双 Smad 抑制方案由 H9 细胞衍生而来，具体方法如先前所述19。

  1. 简而言之，将 H9 细胞用细胞解离试剂在 37 °C 下处理 5 分钟，以获得单细胞，然后重悬于含有 mTeSR1 并补充了 10 ng/mL 基础成纤维细胞生长因子（bFGF）、青霉素/链霉素（P/S）和 10 µM ROCK 抑制剂（RI）的完全培养基中。以 60,000 个细胞/cm2 的密度接种于经 1:50 稀释 Matrigel 包被的 6 孔细胞培养板中（第 0 天）。
  2. 当细胞达到 95%–100% 汇合度时，开始诱导分化，更换为含 LDN193189（200 nM）和 SB431542（10 µM）的 100% KSR 培养基（第 1 天）。
  3. 第 2 天，再次更换培养基，使用补充了 LDN193189（200 nM）、SB431542（10 µM）和 XAV939（5 µM）的 100% KSR 培养基。
  4. 分化第 4 天，更换为 KSR 培养基（75%）和 N2 培养基（25%）的混合液，并补充 LDN193189（200 nM）、SB431542（10 µM）和 XAV939（5 µM）。
  5. 从第 6 天至第 12 天，通过每天增加 25% 的 N2 培养基比例，逐步过渡至含 LDN193189（200 nM）、SB431542（10 µM）和 XAV939（5 µM）的 100% N2 培养基，并每 2 天更换一次培养基。
  6. 将第 12 天的神经前体细胞（NPCs）在补充了 20 ng/mL bFGF 的 N2:B27 培养基中进行培养。
  7. 在每孔 2 mL NPC 培养基中，将 2 × 105 个细胞接种至经 1:50 稀释的完全基底膜基质包被的 P6 培养板中，孵育以使细胞贴壁。
  8. 次日，在含 8 µg/mL 多聚素（polybrene）的条件下，用慢病毒颗粒以 MOI 6 感染细胞。
  9. 感染 8 小时后，将含病毒的培养基更换为新鲜的 NPC 生长培养基。
  10. 次日，重复感染操作，并在 8 小时后更换培养基。
  11. 继续培养细胞 72 小时，之后收获用于进一步分析。

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结果

基因转导后，人胚胎干细胞（hESCs）必须保持高存活率。尽管已对电穿孔法转染hESCs的方案进行了诸多优化以减少细胞死亡，但这些细胞在电穿孔后仍会出现超过50%的细胞死亡率，且转染效率较低20。慢病毒介导的基因转导不仅可实现高效的基因转移，而且在转导后还能维持较高的细胞存活率。以下结果展示了两种方法：一种使用GFP作为报告基因，在hESCs分化而来的神经前体细胞（NPCs）中实现瞬时表达；另一种使用嘌呤霉素对hESCs进行稳定筛选，以用于长期分化实验。

在第一组实验中，通过共转染携带shRNA的pll3.7载体（以GFP作为报告基因）以及第二代慢病毒包装质粒psPAX2.0和pMD2.G来产生慢病毒颗粒。转染后48小时和72小时收集慢病毒颗粒，并通过超速离心进行浓缩。图1A显示转染72小时后HEK293T细胞中GFP表达丰富。病毒蛋白的表达还导致HEK293T细胞出现合胞体形成，即单个细胞相互融合，如图1A中箭头所示...

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讨论

利用基因改造技术对干细胞进行研究或临床应用的能力，受到现有技术和对人胚胎干细胞（hESC）生物学基础认知的双重限制。在小鼠胚胎干细胞（ESC）中已显示出显著潜力的技术，如脂质体转染（lipofection）和电穿孔（electroporation），在hESC中效率较低，因为hESC notoriously 难以通过传统方法实现高效基因递送20。这一现状不仅推动了对现有技术的优化，也促进了新型方法的开发，以提高hESC中的转染效率。这些新方法的研发重点是在长期培养过程中，实现对hESC高效且稳定的基因递送，同时对其生长、多能性及分化潜能产生最小影响。在众多满足上述严格标准的新技术中，慢病毒介导的基因转移技术被广泛应用于hESC21,22。为生产表达特定基因的慢病毒颗粒，需将目标基因克隆至一种转移载体中，并与包装质粒共同转染HEK293T细胞，从而收获含有慢病毒颗粒的细胞培养上清液。为在hESC中使用，必须通过多种技术浓缩这些病毒颗粒，以获得至少达到1 × 107<...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了阿拉伯联合酋长国大学（UAEU）研究基金的资助，项目编号为 #31R170（扎耶德健康科学中心）和 #12R010（UAEU-AUA 基金）。我们感谢兰德尔·摩尔斯教授（Randall Morse，纽约奥尔巴尼沃兹沃思中心）在文稿的语言风格和语法修改方面提供的帮助。

所有数据均可根据要求提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Invitrogen31350010
38.5 mL，无菌认证开放式超透明薄壁管Beckman CoulterC14292
AccutaseStem Cell Technologies7920
bFGF 重组人源InvitrogenPHG0261
牛血清白蛋白 FRAC VInvitrogen15260037
Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEVCorning354234
环杷明Stem Cell Technologies72074
DMEM 培养基Invitrogen11995073
DMEM/F12 营养混合物 Invitrogen11320033
不含 Ca 和 Mg 的 DPBSPAN BiotechP04-36500
胎牛血清Invitrogen10270106
GAPDH (14C10) 兔单克隆抗体CST2118S
温和细胞解离试剂Stem Cell Technologies7174
HyClone 非必需氨基酸 (NEAA) 100X 溶液GE healthcareSH30238.01
L-谷氨酰胺，100X Invitrogen2924190090
L2HGDH 多克隆抗体Proteintech15707-1-AP
L2HGDH shRNAMacrogen序列：CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 试剂盒Thermo FisherL3000001
mTesR1 完全培养基Stem Cell Technologies85850
Neurobasal 培养基 1X CTSInvitrogenA1371201
Neuropan 2 补充剂 100xPAN BiotechP07-11050
Neuropan 27 补充剂 50xPAN BiotechP07-07200
青霉素-链霉素溶液Invitrogen15140122
pLKO.1 TRC 载体Addgene10878
pLL3.7 载体 Addgene11795
pMD2.GAddgene12259
Polybrene 感染试剂SigmaTR1003- G
支化聚乙烯亚胺Sigma408727
psPAX2.0Addgene12260
嘌morphamineTocris4551/10
嘌呤霉素InvitrogenA1113802
ROCK 抑制剂 Y-27632
二盐酸盐 		Tocris1254
SB 431542Tocris1614/10
0.05% 胰蛋白酶-EDTA Invitrogen25300062
XAV 939Tocris3748/10

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