利用低成本阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）通过慢病毒介导将shRNA递送至人胚胎干细胞和神经前体细胞

摘要

利用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI），我们高效地制备了用于在H9人胚胎干细胞（hESCs）中稳定表达shRNA的慢病毒颗粒，并实现了对H9来源的神经前体细胞（NPCs）的高效瞬时转导。

摘要

本方案描述了利用慢病毒颗粒高效地将短发夹RNA（shRNA）递送至人胚胎干细胞（hESC）以及由hESC衍生的神经前体细胞（NPC）的方法。通过使用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI），将携带shRNA的入门载体与包装质粒（pAX和pMD2.G）共同转染HEK293T细胞，从而产生慢病毒颗粒。病毒颗粒经超速离心浓缩后，平均滴度超过5 × 10⁷。使用这些慢病毒颗粒可实现hESC和NPC的高效感染，这通过嘌呤霉素筛选及hESC中的稳定表达、以及NPC中绿色荧光蛋白（GFP）的瞬时表达得以证实。此外，Western blot分析显示，shRNA靶向基因的表达水平显著降低。同时，细胞仍保持其多能性及分化潜能，表现为后续可分化为中枢神经系统（CNS）的不同谱系。本方案主要涉及shRNA的递送，但该方法同样可用于cDNA的异位表达，以开展过表达研究。

引言

源自囊胚内细胞团的人胚胎干细胞（hESCs）具有多能性，可根据外部因素分化为不同类型的细胞 体外 条件^1,2为了充分挖掘人类胚胎干细胞（hESCs）的潜力，必须具备快速且可靠的基因递送方法。传统上，所采用的技术 broadly 可分为两类：非病毒和病毒基因递送系统。^3,4较为常用的非病毒基因递送系统包括脂质体转染、电穿孔和核转染。非病毒递送系统的优点在于插入突变较少，且整体免疫原性降低。^5,6然而，这些方法的转染效率较低，且外源基因瞬时表达的持续时间较短，这成为长期分化研究的主要限制因素。⁷电穿孔相较于脂质体转染可实现更高的转染效率；然而，其导致的细胞死亡率超过50%^8,9,10通过核转染技术，结合脂质体转染与电穿孔，可提高细胞存活率和转染效率，但该方法需要细胞特异性的缓冲液和专用设备，因此在大规模应用时成本较高

方案

1. 使用PEI或Lipofectamine 3000试剂转染HEK293T细胞

1. 将HEK293T细胞培养于含10% FBS和1×青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37 °C、5% CO₂和21% O₂的湿化培养箱中，直至细胞融合度达到90%时进行转染接种。为获得高滴度病毒，应使用较低传代次数的细胞（理想情况下低于P30）。
2. 在100 mm组织培养皿中加入10 mL完全生长培养基，接种4 × 10⁶个细胞，并在含5% CO₂和21% O₂的湿化组织培养箱中过夜培养。
3. 每项转染实验中，将质粒DNA（1 mg/mL储备液）用1 mL无血清DMEM培养基稀释至1.5 mL离心管中，按以下比例加入进入载体和包装质粒：
   进入载体 = 10 µg
   psPAX2.0 = 7.5 µg
   pMD2.G = 5 µg
4. 涡旋振荡10秒，然后在室温下以10,000 × g离心30秒以收集液体。
5. 向管中加入70 µL（1 mg/mL储备液）PEI，按上述方法短暂涡旋并离心收集。所用PEI体积基于总DNA（µg）与PEI（µg）1:3的比例。
6. 对于基于脂质体转染试剂（lipofectamine）的转染，将上述载体用500 µL无血清DMEM培养基稀释....

结果

基因转导后，人胚胎干细胞（hESCs）必须保持高存活率。尽管已对电穿孔法转染hESCs的方案进行了诸多优化以减少细胞死亡，但这些细胞在电穿孔后仍会出现超过50%的细胞死亡率，且转染效率较低²⁰。慢病毒介导的基因转导不仅可实现高效的基因转移，而且在转导后还能维持较高的细胞存活率。以下结果展示了两种方法：一种使用GFP作为报告基因，在hESCs分化而来的神经前体细胞（NPCs）中实现瞬时表达；另一种使用嘌呤霉素对hESCs进行稳定筛选，以用于长期分化实验。

在第一组实验中，通过共转染携带shRNA的pll3.7载体（以GFP作为报告基因）以及第二代慢病毒包装质粒psPAX2.0和pMD2.G来产生慢病毒颗粒。转染后48小时和72小时收集慢病毒颗粒，并通过超速离心进行浓缩。图1A显示转染72小时后HEK293T细胞中GFP表达丰富。病毒蛋白的表达还导致HEK293T细胞出现合胞体形成，即单个细胞相互融合，如图1A中箭头所示.......

讨论

利用基因改造技术对干细胞进行研究或临床应用的能力，受到现有技术和对人胚胎干细胞（hESC）生物学基础认知的双重限制。在小鼠胚胎干细胞（ESC）中已显示出显著潜力的技术，如脂质体转染（lipofection）和电穿孔（electroporation），在hESC中效率较低，因为hESC notoriously 难以通过传统方法实现高效基因递送²⁰。这一现状不仅推动了对现有技术的优化，也促进了新型方法的开发，以提高hESC中的转染效率。这些新方法的研发重点是在长期培养过程中，实现对hESC高效且稳定的基因递送，同时对其生长、多能性及分化潜能产生最小影响。在众多满足上述严格标准的新技术中，慢病毒介导的基因转移技术被广泛应用于hESC^21,22。为生产表达特定基因的慢病毒颗粒，需将目标基因克隆至一种转移载体中，并与包装质粒共同转染HEK293T细胞，从而收获含有慢病毒颗粒的细胞培养上清液。为在hESC中使用，必须通过多种技术浓缩这些病毒颗粒，以获得至少达到1 × 10^7<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Invitrogen	31350010
38.5 mL，无菌认证开放式超透明薄壁管	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF 重组人源	Invitrogen	PHG0261
牛血清白蛋白 FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV	Corning	354234
环杷明	Stem Cell Technologies	72074
DMEM 培养基	Invitrogen	11995073
DMEM/F12 营养混合物	Invitrogen	11320033
不含 Ca 和 Mg 的 DPBS	PAN Biotech	P04-36500
胎牛血清	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) 兔单克隆抗体	CST	2118S
温和细胞解离试剂	Stem Cell Technologies	7174
HyClone 非必需氨基酸 (NEAA) 100X 溶液	GE healthcare	SH30238.01
L-谷氨酰胺，100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH 多克隆抗体	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		序列：CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 试剂盒	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 完全培养基	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal 培养基 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 补充剂 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 补充剂 50x	PAN Biotech	P07-07200
青霉素-链霉素溶液	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC 载体	Addgene	10878
pLL3.7 载体	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene 感染试剂	Sigma	TR1003- G
支化聚乙烯亚胺	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
嘌morphamine	Tocris	4551/10
嘌呤霉素	Invitrogen	A1113802
ROCK 抑制剂 Y-27632 二盐酸盐	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10