可视化大鼠腓肠肌内侧头中神经肌肉接头的形态学特征

摘要

本实验方案介绍了一种利用不同生物标志物（即神经丝蛋白200、囊泡乙酰胆碱转运体、α-银环蛇毒素和S100）进行荧光免疫组织化学染色，以检测大鼠腓肠肌内侧头中突触前末梢、突触后受体及突触周施万细胞之间空间相关性的方法。

摘要

神经肌肉接头（NMJ）是一种复杂的结构，负责运动神经元向骨骼肌传递信号，由三个基本组织学组分构成：突触前运动轴突末梢、突触后烟碱型乙酰胆碱受体（AchRs）以及突触周围施万细胞（PSCs）。为了展示NMJ的形态学特征，本研究选择大鼠腓肠肌内侧头作为目标组织，采用多种荧光染色方法结合不同生物标志物进行观察，包括用于标记运动神经纤维及其突触前末梢的神经丝蛋白200（NF200）和囊泡型乙酰胆碱转运蛋白（VAChT）、用于标记突触后烟碱型AchRs的α-银环蛇毒素（α-BTX），以及用于标记PSCs的S100蛋白。本研究设置了两组染色方案：第一组样本使用NF200、VAChT和α-BTX进行染色，第二组样本则使用NF200、α-BTX和S100进行染色。结果显示，这两种染色方案均能有效显示NMJ的精细结构。通过共聚焦显微镜观察，可清晰识别突触前末梢、突触后受体及PSCs的形态特征，并利用Z轴层扫图像重建三维结构，进一步分析不同标记物之间的空间关系。从方法学角度来看，这些染色方案为在生理条件下研究NMJ形态特征提供了有价值的参考，同时也可能适用于评估NMJ的病理改变，如周围神经损伤与再生过程中的变化。

引言

作为神经肌肉接头（NMJ）的三个基本结构组成部分^1,2,3,4，突触前运动神经末梢、含有烟碱型乙酰胆碱受体（AchRs）的突触后膜以及突触周围施万细胞（PSCs）的形态学特征已被广泛研究。研究人员已采用多种组织学技术，如电子显微镜^5,6、共聚焦显微镜^7,8和光片显微镜^9,10，对骨骼肌的薄切片和整体封片标本进行了检测。尽管这些技术从不同角度揭示了NMJ的形态学特征，但相比之下，共聚焦显微镜仍是成像NMJ精细结构的理想选择。

近年来，许多新技术已被开发用于显示神经肌肉接头（NMJ）的结构组分。例如，thy1-YFP 转基因荧光小鼠已被直接用于在体内和体外观察运动轴突和运动终板in vivo和in vitro^....

方案

本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准（批准号：2021-04-15-1）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996年）。实验使用三只成年雄性大鼠（Sprague-Dawley品系，体重230 ± 15 g）。大鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，温度和湿度受控，并可自由获取食物和饮水。本研究所用仪器与材料见图1。

1. 灌注

1. 腹腔注射250 mg/kg的三溴乙醇溶液，以诱导大鼠安乐死。
2. 待呼吸停止后，使用剪刀和镊子打开胸腔以暴露心脏。从左心室插入静脉导管并朝向主动脉推进，然后剪开右心耳。
3. 在通风橱内对实验大鼠进行灌流。首先用100 mL 0.9%生理盐水灌流，直至从右心耳流出的液体无血色；随后用250–300 mL的4%多聚甲醛（溶于0.1 M磷酸盐缓冲液，PB，pH 7.4）继续灌流约10分钟，直至尾部难以弯曲为止。

2. 区域解剖学

1. 灌注后，使用手术刀去除双侧后肢的皮肤（图2A），并暴露双侧坐骨神经和内侧腓肠肌（图....

结果

经过多重荧光染色后，大鼠腓肠肌内侧头80 µm厚切片上依次显示出NF200阳性神经纤维、VAChT阳性突触前终末、α-BTX阳性突触后乙酰胆碱受体（AchRs）、S100阳性施万细胞（PSCs）、鬼笔环肽阳性肌纤维以及DAPI标记的细胞核（图3 和 图4）。

结果显示，NF200阳性的神经纤维成束走行，并发出分支与VAChT阳性的突触前终末形成对应关系，这种对应关系与α-BTX阳性的突触后乙酰胆碱受体（AchRs）呈镜像分布（图3）。此外，在靠近突触前终末的NF200阳性神经纤维周围可检测到S100阳性的施万细胞（PSCs）（图4）。

通过利用图像重建技术，神经纤维、突触前终末、PSCs以及突触后AchRs之间的空间相关性以三维模式进一步呈现，从不同角度展示了NMJ的详细形态学特征（

讨论

我们已阐述了成功进行肌肉切片多重染色的技术细节，以及利用荧光免疫组织化学方法在大鼠内侧腓肠肌厚切片上显示神经肌肉接头（NMJ）形态特征的操作要点。通过该方法，可在共聚焦显微镜下观察并分析终末施万细胞（PSCs）以及突触前和突触后结构的精细细节及其空间关系，并进一步实现三维重建。本研究中使用了多种生物标志物来揭示NMJ的形态特征：NF200在有髓神经轴突上高表达^20,21，VAChT聚集于突触前终末²²，α-BTX标记突触后乙酰胆碱受体（AchRs）^23,24，S100则表达于PSCs^25,26。综合本研究结果与既往研究可见，这些生物标志物可根据实验设计自由组合，用于标记NMJ的各个结构成分，以评估它们之间的空间关系

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐	ThermoFisher	D3571
共聚焦激光扫描显微镜	Olympus	FV1200
驴抗鸡 AF488	Jackson	149973 (703-545-155)
驴抗山羊 AF546	ThermoFisher	A11056
驴抗兔 AF488	ThermoFisher	A21206
驴抗兔 AF546	ThermoFisher	A10040
冷冻切片包埋介质	ThermoFisher	Neg-50	无色
显微镜盖玻片	Citotest	10212450C
切片机	Yamato	REM-710
神经丝蛋白200	Sigma-Aldrich	N4142	兔
神经丝蛋白200	Abcam	ab4680	鸡
正常驴血清	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 ml
生理盐水	山东华鲁制药有限公司	H37022750	250 ml
多聚甲醛	Macklin	P804536	500g
鬼笔环肽 AF350	ThermoFisher	A22281
精密蠕动泵	Longer	BT100-2J
S100-β	Abcam	ab52642	兔
十二水合磷酸氢二钠	Macklin	S818118	500g
二水合磷酸二氢钠	Macklin	S817463	500g
蔗糖	Macklin	S818046	500g
Superfrost plus 载玻片	ThermoFisher	4951PLUS-001E
吐温X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 ml
囊泡乙酰胆碱转运蛋白	Milipore	ANB100	山羊
α-银环蛇毒素 AF647 偶联物	ThermoFisher	B35450