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方法文章

可视化大鼠腓肠肌内侧头中神经肌肉接头的形态学特征

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DOI：

10.3791/63954

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2022年5月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案介绍了一种利用不同生物标志物（即神经丝蛋白200、囊泡乙酰胆碱转运体、α-银环蛇毒素和S100）进行荧光免疫组织化学染色，以检测大鼠腓肠肌内侧头中突触前末梢、突触后受体及突触周施万细胞之间空间相关性的方法。

摘要

神经肌肉接头（NMJ）是一种复杂的结构，负责运动神经元向骨骼肌传递信号，由三个基本组织学组分构成：突触前运动轴突末梢、突触后烟碱型乙酰胆碱受体（AchRs）以及突触周围施万细胞（PSCs）。为了展示NMJ的形态学特征，本研究选择大鼠腓肠肌内侧头作为目标组织，采用多种荧光染色方法结合不同生物标志物进行观察，包括用于标记运动神经纤维及其突触前末梢的神经丝蛋白200（NF200）和囊泡型乙酰胆碱转运蛋白（VAChT）、用于标记突触后烟碱型AchRs的α-银环蛇毒素（α-BTX），以及用于标记PSCs的S100蛋白。本研究设置了两组染色方案：第一组样本使用NF200、VAChT和α-BTX进行染色，第二组样本则使用NF200、α-BTX和S100进行染色。结果显示，这两种染色方案均能有效显示NMJ的精细结构。通过共聚焦显微镜观察，可清晰识别突触前末梢、突触后受体及PSCs的形态特征，并利用Z轴层扫图像重建三维结构，进一步分析不同标记物之间的空间关系。从方法学角度来看，这些染色方案为在生理条件下研究NMJ形态特征提供了有价值的参考，同时也可能适用于评估NMJ的病理改变，如周围神经损伤与再生过程中的变化。

引言

作为神经肌肉接头（NMJ）的三个基本结构组成部分1,2,3,4，突触前运动神经末梢、含有烟碱型乙酰胆碱受体（AchRs）的突触后膜以及突触周围施万细胞（PSCs）的形态学特征已被广泛研究。研究人员已采用多种组织学技术，如电子显微镜5,6、共聚焦显微镜7,8和光片显微镜9,10，对骨骼肌的薄切片和整体封片标本进行了检测。尽管这些技术从不同角度揭示了NMJ的形态学特征，但相比之下，共聚焦显微镜仍是成像NMJ精细结构的理想选择。

近年来，许多新技术已被开发用于显示神经肌肉接头（NMJ）的结构组分。例如，thy1-YFP 转基因荧光小鼠已被直接用于在体内和体外观察运动轴突和运动终板in vivo和in vitro10,11。此外，通过静脉注射荧光标记的α-BTX，并结合组织光学透明化处理，利用光片显微镜观察野生型及转基因荧光小鼠全装骨骼肌中运动终板的空间分布9,12。然而，尽管这些先进方法能够显示突触前和突触后结构，却无法同时展示突触周围胶质细胞（PSCs）。

越来越多的证据表明，终板胶质细胞（PSCs）作为外周胶质细胞，与突触前终末密切相关，在神经肌肉接头（NMJ）的发育与稳定性、生理条件下对NMJ突触活动的调节，以及神经损伤后NMJ的再生过程中发挥重要作用13,14,15。考虑到NMJ的细胞结构，本方案适用于同时标记PSCs、突触前和突触后成分，并可用于评估正常及病理状态下NMJ的完整性与可塑性. 例如，比较生理与病理状态下肌肉中NMJ的强度、突触后运动终板的形态与体积、NMJ的神经支配与去神经支配情况，以及PSCs的数量。

腓肠肌是构成小腿后部隆起的最大肌肉，通过去除肢体上的皮肤和股二头肌即可轻松分离出来。该肌肉常被用于评估肌肉萎缩、神经肌肉退行性变、肌肉功能以及运动单位的力量，可在离体（ex vivo）或在体（in vivo）条件下进行16,17,18。然而，该技术也适用于揭示多种骨骼肌中神经肌肉接头（NMJ）的形态学特征。同时，与薄切片7,8和单根解离肌纤维19相比，较厚的肌肉切片能够更完整地呈现NMJ的形态和数量。

与这些研究一致，本研究选择大鼠内侧腓肠肌作为目标组织，并根据神经肌肉接头（NMJ）的结构成分将其切成80 µm厚的切片，用于多种生物标志物的多重荧光染色。其中，神经丝蛋白200（NF200）20,21、囊泡乙酰胆碱转运体（VAChT）22、α-银环蛇毒素（α-BTX）23,24以及S10025,26分别用于标记神经纤维、突触前终末、突触后乙酰胆碱受体（AchRs）和终末胶质细胞（PSCs）。此外，肌组织背景和细胞核分别用鬼笔环肽（phalloidin）和DAPI进行复染。

本研究旨在建立一种优化的实验方案，用于在较厚的固定样本上同时标记神经肌肉接头（NMJ）的细胞结构及其相应的生物标志物。该方法更便于共聚焦显微镜观察，有助于获取关于终末胶质细胞（PSCs）、突触前和突触后组分的精细结构及其相互空间关系的更多信息。从方法学角度来看，该方案可用于评估正常和病理状态下NMJ形态特征的研究。

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方案

本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准（批准号：2021-04-15-1）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996年）。实验使用三只成年雄性大鼠（Sprague-Dawley品系，体重230 ± 15 g）。大鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，温度和湿度受控，并可自由获取食物和饮水。本研究所用仪器与材料见图1。

1. 灌注

  1. 腹腔注射250 mg/kg的三溴乙醇溶液，以诱导大鼠安乐死。
  2. 待呼吸停止后，使用剪刀和镊子打开胸腔以暴露心脏。从左心室插入静脉导管并朝向主动脉推进，然后剪开右心耳。
  3. 在通风橱内对实验大鼠进行灌流。首先用100 mL 0.9%生理盐水灌流，直至从右心耳流出的液体无血色；随后用250–300 mL的4%多聚甲醛（溶于0.1 M磷酸盐缓冲液，PB，pH 7.4）继续灌流约10分钟，直至尾部难以弯曲为止。

2. 区域解剖学

  1. 灌注后，使用手术刀去除双侧后肢的皮肤（图2A），并暴露双侧坐骨神经和内侧腓肠肌（图2B）。
  2. 用刀片仔细从后肢分离出双侧内侧腓肠肌（图2C），并将整块肌肉置于10 mL含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液中后固定2小时。
  3. 将肌肉从溶液中取出，并在4 °C条件下，用10 mL含25%蔗糖的0.1 M磷酸缓冲液进行冰冻保护，浸泡1天，直至肌肉完全沉入溶液底部。

3. 肌肉的冷冻切片

  1. 将肌肉组织浸入溶液后，使用冷冻切片介质将其固定在滑动式切片机系统的冷冻台上。沿肌肉长轴方向进行水平切片，厚度为 80 µm。
  2. 用毛笔将每孔七片冷冻切片按顺序放入六孔培养板中，每孔加入 10 mL 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.4）。
    注意：切片需按顺序放置，以确保不同孔中的切片彼此相邻，从而使用于不同染色的切片更具一致性。

4. 使用 NF200、VAChT、α-BTX 和 Pha 进行多重荧光染色

注意：使用 NF200、VAChT、α-BTX 和 Pha 进行多重荧光染色，分别标记神经纤维、突触前终末、突触后烟碱型乙酰胆碱受体和肌纤维。

  1. 在摇床上，以每孔1.5 mL含75 μL 10% Triton X-100（终浓度0.5%）和45 μL正常驴血清（终浓度3%）的0.1 M磷酸缓冲液，在20 rpm转速下孵育四个切片，持续30分钟。
  2. 将切片转移至1.5 mL含一抗的混合溶液中，该溶液包含兔抗NF200抗体（1:1,000）、山羊抗VAChT抗体（1:500），溶于含1%正常驴血清和0.5% Triton X-100的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）中，于4 °C孵育过夜。次日，在摇床上以20 rpm转速用0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。
  3. 将切片置于1.5 mL含二抗的混合溶液中孵育，该溶液包含驴抗兔AF488（1:500）、驴抗山羊AF546（1:500），以及生物标志物α-BTX AF647（1:500）和鬼笔环肽350（phalloidin 350，1:500），溶于含1%正常驴血清和0.5% Triton X-100的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）中，室温避光孵育1小时。
  4. 用0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）洗涤3次，每次5分钟，随后将切片贴附于显微镜载玻片上。使用蒸馏水中含50%甘油的封片剂加盖盖玻片，用于观察。

5. 使用 NF200、S100、α-BTX 和 DAPI 进行多重荧光染色

注意：操作步骤与第4步类似；主要区别在于一抗及其对应的二抗。

  1. 在步骤4.2中使用以下一抗：鸡抗NF200（1:6,000）、兔抗S100（1:2,500），以及相应的二抗：驴抗鸡AF488（1:500）和驴抗兔AF546（1:500）；在步骤4.3中使用α-BTX AF647（1:500）和DAPI（1:50,000）作为生物标志物。

6. 观察与分析

  1. 使用配备以下物镜的共聚焦成像系统观察样本并采集图像：数值孔径（NA）为0.75的20倍物镜和数值孔径（NA）为0.95的40倍物镜。
  2. 根据多重荧光染色情况，选择相应的激发波长和发射波长：350 nm（Pha）、488 nm（NF200）、546 nm（VAChT 和 S100）、647 nm（α-BTX）或 DAPI。将图像采集分辨率设置为640 × 640像素。
    注意：选择640 × 640像素的分辨率是因为图像以Z轴层扫（Z-stacks）方式采集。1024 × 1024像素的分辨率会导致Z轴层扫成像速度变慢并加剧光漂白。
  3. 设定起始焦平面和终止焦平面，步长设为1 µm或2 µm。选择深度模式、图像采集和Z系列扫描。
  4. 对于20倍低倍镜下采集的图像，使用105 µm针孔，对每张80 µm厚的切片以2 µm步长采集40张图像（Z-stacks）。选择投影/地形模式，并沿Z轴进行强度投影，将所有图像整合为一张全焦图像。
  5. 对于40倍高倍镜下采集的图像，将放大倍数设为2，使用105 µm针孔，对每张80 µm厚的切片以1 µm步长采集80张图像（Z-stacks）。将所有图像整合为一张全焦图像。
  6. 按照先前文献27所述方法，利用图像处理系统将图像重建为三维模式。

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结果

经过多重荧光染色后，大鼠腓肠肌内侧头80 µm厚切片上依次显示出NF200阳性神经纤维、VAChT阳性突触前终末、α-BTX阳性突触后乙酰胆碱受体（AchRs）、S100阳性施万细胞（PSCs）、鬼笔环肽阳性肌纤维以及DAPI标记的细胞核（图3 和 图4）。

结果显示，NF200阳性的神经纤维成束走行，并发出分支与VAChT阳性的突触前终末形成对应关系，这种对应关系与α-BTX阳性的突触后乙酰胆碱受体（AchRs）呈镜像分布（图3）。此外，在靠近突触前终末的NF200阳性神经纤维周围可检测到S100阳性的施万细胞（PSCs）（图4）。

通过利用图像重建技术，神经纤维、突触前终末、PSCs以及突触后AchRs之间的空间相关性以三维模式进一步呈现，从不同角度展示了NMJ的详细形态学特征（

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讨论

我们已阐述了成功进行肌肉切片多重染色的技术细节，以及利用荧光免疫组织化学方法在大鼠内侧腓肠肌厚切片上显示神经肌肉接头（NMJ）形态特征的操作要点。通过该方法，可在共聚焦显微镜下观察并分析终末施万细胞（PSCs）以及突触前和突触后结构的精细细节及其空间关系，并进一步实现三维重建。本研究中使用了多种生物标志物来揭示NMJ的形态特征：NF200在有髓神经轴突上高表达20,21，VAChT聚集于突触前终末22，α-BTX标记突触后乙酰胆碱受体（AchRs）23,24，S100则表达于PSCs25,26。综合本研究结果与既往研究可见，这些生物标志物可根据实验设计自由组合，用于标记NMJ的各个结构成分，以评估它们之间的空间关系

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由医学科学院创新基金（编号：CI2021A03407）、国家自然科学基金（编号：82004299）以及中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（编号：ZZ13-YQ-068；ZZ14-YQ-032；ZZ14-YQ-034；ZZ201914001；ZZ202017006；ZZ202017015）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐ThermoFisherD3571
共聚焦激光扫描显微镜OlympusFV1200
驴抗鸡 AF488Jackson149973 (703-545-155)
驴抗山羊 AF546ThermoFisherA11056
驴抗兔 AF488ThermoFisherA21206
驴抗兔 AF546ThermoFisherA10040
冷冻切片包埋介质ThermoFisherNeg-50无色
显微镜盖玻片Citotest10212450C
切片机YamatoREM-710
神经丝蛋白200Sigma-AldrichN4142兔
神经丝蛋白200Abcamab4680鸡
正常驴血清Jackson ImmunoResearch Laboratories017-000-1210 ml
生理盐水山东华鲁制药有限公司H37022750250 ml
多聚甲醛MacklinP804536500g
鬼笔环肽 AF350ThermoFisherA22281
精密蠕动泵LongerBT100-2J
S100-βAbcamab52642兔
十二水合磷酸氢二钠MacklinS818118500g
二水合磷酸二氢钠MacklinS817463500g
蔗糖MacklinS818046500g
Superfrost plus 载玻片ThermoFisher4951PLUS-001E
吐温X-100Solarbio Life Sciences9002-93-1100 ml
囊泡乙酰胆碱转运蛋白MiliporeANB100山羊
α-银环蛇毒素 AF647 偶联物ThermoFisherB35450

参考文献

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