研究细胞内囊泡破裂功能的光动力方法

Summary

AlPcS_2a介导的发色团辅助激光灭活（CALI）是研究活细胞中细胞内囊泡（IVs）时空损伤的强大工具。

Abstract

细胞内囊泡（IV）是通过囊泡内吞作用形成细胞质而形成的。IV形成通过IV膜的透化以及内体和溶酶体的形成参与激活各种信号通路。一种称为发色团辅助激光灭活（CALI）的方法用于研究IV的形成和控制IV调节的材料。CALI是一种基于成像的光动力方法，用于研究膜透化诱导的信号通路。该方法允许对所选细胞器进行时空操作以在细胞中透化。CALI方法已被应用于通过内体和溶酶体的透化来观察和监测特定分子。已知IV的膜破裂会选择性地募集聚糖结合蛋白，例如半乳糖凝集素-3。在这里，该协议描述了AlPcS_2a 诱导IV破裂和使用半乳糖凝集素-3作为标记受损溶酶体的标记物，这对于研究IV膜破裂的下游效应及其在各种情况下的下游效应是有用的。

Introduction

内体是一种细胞内囊泡（IV），通过内吞作用形成，然后成熟为溶酶体。各种细胞内信号通路参与IV的形成;此外，不同的内在和外在刺激会损害静脉注射（例如，病原体在感染期间可以从边界膜逸出并进入细胞质¹）。这通常伴有内吞囊泡破裂²。因此，靶向和破坏IV的技术可用于相关研究³。

光动力疗法（PDT）是一种光依赖性疗法，通过杀死肿瘤或病原体来对抗疾病^4。在PDT中，靶细胞用无毒发色团标记，称为光敏剂，可以通过光照明^局部激活5^，6。光敏剂从光中吸收能量并转化为激发的单重态，导致长寿命的激发三重态。三重态的光敏剂可以在氧气存在下发生电子或能量转移并形成活性氧（ROS），并且可以在空间上破坏照明区域内的标记细胞⁷。结果因光的力量而异⁸.通过控制光敏剂的浓度和光照明强度，可以在不进行细胞裂解的情况下选择性地灭活目标生物分子，称为发色团辅助光灭活（CALI）⁹。随着可以选择性标记各种亚细胞靶标的光敏剂的重大发展，CALI 已成为控制光介导的生物分子灭活....

Protocol

1. AlPcS_2a 原液制备

1. 将 10 mg AlPcS_2a 溶解在 400 μL 的 0.1 M NaOH 中。为了提高溶解度，将溶液加热到50°C并涡旋。
2. 将溶液与 4 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 混合。然后，用0.22μm过滤器过滤溶液以除去不溶性沉淀物。
3. 通过紫外-可见分光光度计测量溶液的浓度。AlPcS_2a在672 nm处的消光系数为4 x 10⁴ cm-1 ^M-1。用PBS稀释AlPcS_2a溶液，制成1 mM溶液。制作1mL等分试样并储存在-20°C。

2. 转染

注意:Gal3-GFP用作溶酶体破裂活细胞成像的指标。

1. 
   

Results

图中显示了AlPcS_2a诱导的IV损伤，包括内体和溶酶体（图1）。

市售标记物可用于确定AlPcS_2a 染色条件。例如，AlPcS_2a 点和绿色荧光染料²² 共定位（图2）。

荧光团标记的半乳糖凝集素-3可用作监测IV损伤的指示剂（图3）。此外，还可以跟踪Gal3点的位置以检测下游信号通路，包括溶酶体修复和溶酶体3^，23。Gal3从细胞质到受损IV的快速积累将显着增加Gal3的强度，如果调整图像的对比度以显示胞质Gal3，这将使Gal3点的强度饱和。事实上，图像还显示胞质Gal3略有减少。

Discussion

AlPcS_2a 与质膜结合，然后通过内吞作用内化并最终积聚在溶酶体中。因此，_{AlPcS 2a} 可以通过调整孵育持续时间定位在亚细胞区室中。这种方法的局限性在于，只有 IV 亚群可以通过内吞作用被 AlPcS_2a 标记，因为还有许多其他 IV 膜源，例如 ER 和高尔基体装置。此外，将_{AlPcS 2a} 选择性标记到早期或晚期内体中具有挑战性，然而，荧光标记物可用于在亚细胞成像期间区分早期形成的内体和晚期形成的内体。CALI诱导的IV损伤可以用多种染料^3，24诱导。

损伤强度可以通过光的功率和照明持续时间来控制。更高强度的损伤可能导致细胞萎缩或坏死。在这里，已经显示了IV损伤的几个指标，可用于确定实验条件。此外，这些指示剂还可以作为受损IV的标志物，并提供有关其随时间推移的亚细胞分布的信息。

临床上，AlPcS_2a<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>试剂
Al（III） 氯化酞菁二磺酸 （AlPcS2a）	Frontier Scientific	P40632
培养皿	同上	812128-200
培养基			DMEM，补充有 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素 G 和 100 mg/mL 链霉素
DMEM	Gibco	11965092
FBS	、Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP 质粒	、addgene
Lipofectamine 3000 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	绿色荧光染料、
多壁板	、Perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
青霉素-链霉素	Gibco	15140163
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco	21600-069	137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4
细胞系
HeLa 细胞系	ATCC	CCL-2	该方法适用于大多数贴壁细胞系。条件必须单独确定。
设备
0.22 &m 滤光	片 Merck	SLGV013SL
准直 LED 灯 （660 纳米）	Thorlabs	M660L3-C1 和 DC2100	近红外光是 AlPcS2a 激发光谱的理想基础。
共聚焦显微镜	Carl Zeiss	LSM 780	长期成像需要孵育系统。
NanoDrop 2000/2000c 分光光度计	Thermo Fisher Scientific
红色 LED 灯	Tholabs	M660L4-C1