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在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

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DOI：

10.3791/63968

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2022年7月12日

 ,  ,  , 
1Centre for Mechanochemical Cell Biology and Division of Biomedical Sciences, Warwick Medical School, University of Warwick, 2National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

本文内容

摘要

本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。

摘要

活细胞表面为多种细胞过程提供了多功能的活性平台，这些过程源于质膜与下方肌动蛋白皮层之间的相互作用。在过去几十年中，基于支撑脂双层与肌动蛋白丝网络相结合的重建最小系统，已被证明在揭示膜锚定肌动蛋白网络的基本机制与效应，以及研究单个膜相关蛋白功能方面具有重要作用。本文描述了如何重建此类活性复合系统 体外 由流体支撑的脂双层组成，通过膜结合的肌动蛋白结合蛋白与动态的肌动蛋白丝和肌球蛋白马达相偶联，该体系可通过全内反射荧光显微镜直接观察。开放式腔室设计使得系统能够逐步组装，并可系统性地调控多种参数，如连接蛋白浓度、肌动蛋白浓度、肌动蛋白丝长度、肌动蛋白/肌球蛋白比例以及ATP水平。最后，我们讨论了如何控制体系的质量，如何检测并排除常见问题，以及该体系相较于活细胞表面存在的一些局限性。

引言

活体动物细胞的质膜持续与相邻的肌动蛋白细胞骨架相互作用，二者共同形成一种具有多种细胞功能的活性复合材料1,2。为了研究脂质膜与肌动蛋白界面处的过程，在支撑脂质双层（SLB）上重建细胞骨架网络已被证明非常有效。这种最小系统方法可精确控制细胞骨架网络组分和脂质组成。与巨大单层囊泡的游离脂质膜相比，SLB 的平面几何结构更有利于高效利用前沿显微技术，如超分辨率成像3,4、全内反射荧光（TIRF）5,6,7或干涉散射成像8，以研究细胞骨架网络的空间组织与动态行为。由于溶液中未结合的荧光标记分子对背景信号的贡献极小，TIRF 可为荧光标记组分提供最高的对比度。

本文介绍了一种基本实验方案，用于构建锚定在支撑脂质双层上的肌动球蛋白网络，该体系在研究活性准二维网络的物理特性9,10,11及其对膜结构组织的影响3,5,12,13,14,15,16（图1）领域被广泛应用。该方法不仅限于基于肌动蛋白的网络，还可轻松拓展用于研究微管、中间纤维或混合型复合网络，并结合表面敏感显微镜技术，探究脂质膜蛋白与细胞骨架组分之间的多种相互作用。

为了使本方案保持重点突出，我们未详细描述肌动蛋白和肌球蛋白的纯化与标记，也未详述如何调节和控制肌动蛋白-肌球蛋白网络的收缩性与组织结构。相关内容可参考同期发表于 JoVE 方法合集《用于生物材料、生物物理学和活性物质研究的细胞骨架网络体外重建》中的其他方案17。

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图1示意图 体外 肌动蛋白-膜活性复合系统 由Biorender制作。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

1. 试剂与设备

  1. 按所列要求配制新鲜缓冲液 表1. 使用电阻率为 18.2 MΩ·cm 的超纯去离子水Ω·厘米 25 °C. 将所有缓冲液通过滤膜除菌 0.22 µm 在真空下过滤。对柱层析所用的缓冲液进行脱气。
  2. 按照前述方法纯化骨骼肌肌动蛋白18,19加入20%甘油至终纯化的G-actin溶液中，并分装成等份 500 µL （用于标记或大规模实验）以及 10 µL （针对单个实验）体积。将试管浸入液氮中30秒以快速冷冻各等分试样，随后于−80 °C 长达 18 个月。
    注意：也可从商业渠道购买纯化的肌动蛋白或丙酮粉。
  3. 按照前述方法，用任何荧光马来酰亚胺染料标记纯化的骨骼肌 G-actin5. 通过分光光度法测定蛋白质的浓度和标记程度，使用校正后的 A290 nm 用于肌动蛋白（ε肌动蛋白 = 26,600 M-1cm-1）和 Aλ最大值 染料。分装成等量小份 10 µL 用镊子将试管浸入液氮中30秒进行速冻，随后于−80 °C 长达 18 个月。
    注意：使用与赖氨酸结合的NHS酯进行标记会产生无功能的肌动蛋白，应避免使用。
  4. 按照方案纯化骨骼肌肌球蛋白II20使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，随后进行考马斯亮蓝染色，以确定蛋白质的纯度水平21. 将纯化的骨骼肌肌球蛋白-II 储存于 −20 °C 以含50%甘油的肌球蛋白II缓冲液液态形式保存。
    注意：储存的肌球蛋白 II 可用于长达 2 年。
  5. 按照先前所述方法，用任何荧光马来酰亚胺染料标记纯化的肌球蛋白-II5避免使用NHS酯类染料标记肌球蛋白马达。通过分光光度法测定校正后的A值，确定其浓度和标记程度。280nm II 型肌球蛋白和 Aλ最大 染料。将回收的肌球蛋白II（深色或标记的）储存于 4 °C 并在6周内使用。
  6. 帽蛋白的纯化
    1. 按照先前的方案获取小鼠加帽蛋白22. 采用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，随后进行考马斯亮蓝染色，以确定蛋白质的纯度。使用A280nm 加帽蛋白的εCP = 99,530 M-1cm-1).
    2. 向蛋白溶液中加入 20% 甘油并混匀 5 µL 分装于 200 µL PCR管。将管子浸入液氮中，并在−80 °C下保存。80 °C 长达 2 年。
      注意：通过在不同浓度的帽蛋白存在下，使固定量的荧光标记G-actin进行聚合，以检测帽蛋白的活性。随后在显微镜下观察所形成的肌动蛋白丝，并对其长度分布进行定量分析。帽蛋白的相对浓度越高，肌动蛋白丝的长度分布越短。参见Köster等人的研究。5.
  7. 表达一种荧光膜-肌动蛋白连接蛋白，例如本方案使用 10xHis-YFP-EzrinABD（HYE），在 Bl21DE3* 中进行表达 大肠杆菌，并按照前述方法进行纯化23通过分光光度法测定蛋白质浓度。
  8. 将蛋白在凝胶过滤层析缓冲液（或其他合适的缓冲液）中分装成小份，加入20%甘油，于−80 °C在这些条件下，该蛋白质可稳定保存超过2年。
    注意：所选用的肌动蛋白-膜连接蛋白和荧光标记物取决于具体研究问题。近年来已开发出多种脂质连接策略，包括组氨酸标签蛋白24，生物素-链霉亲和素25，以及单链DNA26.
  9. 多层囊泡（MLVs）的制备
    注意：从MLVs到支撑脂双层的工作流程如图所示 图2.
    1. 将5-10个棕色玻璃小瓶放入200 mL玻璃烧杯中。向烧杯中加入2%清洗液，液量以完全浸没玻璃小瓶为宜。在水浴中超声处理30分钟，设置为全脉冲模式。 65 °C.
    2. 从溶液中取出小瓶，用蒸馏水彻底冲洗。将小瓶放入盛有2 N NaOH的玻璃烧杯中，超声处理20分钟。此步骤无需加热。
    3. 从 NaOH 溶液中取出小瓶，用蒸馏水彻底冲洗。将小瓶置于设定温度的热风烘箱中干燥 65 °C 2小时或更长时间。
    4. 将清洗后的样品瓶置于洁净的烧杯中，用透明薄膜密封，可保存长达6周。
      注意：以下步骤均须在化学通风橱内进行。使用气密型汉密尔顿玻璃注射器操作氯仿及脂质溶液，以避免塑料污染。
    5. 用纯氯仿将 Hamilton 注射器和数个棕色玻璃小瓶反复冲洗多次。从 −20 °C 冻存并加入足量的氯仿以溶解脂质粉末，使其浓度达到10–25 mg/mL。
    6. 将溶液从安瓿转移至一个新近清洗过的棕色玻璃小瓶中，并做好适当标记。此步骤需在冰上操作，以减少氯仿的挥发。
    7. 配制浓度为10–25 mg/mL的DOPC储备液，并加入DGS-NTA-Ni2+ 浓度为 1-10 mg/mL。
    8. 为配制工作用脂质混合液，取一支洁净的玻璃小瓶，用氯仿冲洗2次。加入 300 µL 向小瓶中加入纯氯仿，以作为组分更好混合的基础。这不会影响脂质的最终浓度，因为在后续步骤中所有氯仿都将被完全干燥除去。
    9. 将定量的储备脂质溶液加入小瓶中，以配制所需的工作脂质混合液。脂质在脂质重悬缓冲液中的目标浓度为 4 mM。在缓慢的氮气流下干燥脂质混合物。2 在室温下的化学通风橱中放置气体。每个小瓶此步骤最多可能需要30分钟。
    10. 待所有溶剂完全干燥后，将脂质膜进行真空干燥处理 >室温下干燥2小时，以除去残留的氯仿。用脂质重悬缓冲液重悬干燥后的脂质混合物，使脂质终浓度为4 mM。
    11. 孵育5-10分钟，使脂质充分水化。涡旋脂质溶液约30秒，以形成多层囊泡（MLVs）。
    12. 将MLVs分装至1.5 mL微量离心管中，每管0.5–1 mL。将离心管迅速浸入液氮中，用透明封口膜密封后，于−20 °C （最长可达6周）。
      注意：选择脂质储备液的浓度时，应确保其体积足够大，以便使用 Hamilton 注射器进行可靠移液。如果配制储备液所需的体积过大，导致无法充分溶解干燥的脂质粉末，则应对储备液进行多步稀释，以确保不同脂质之间混合的可重复性。
  10. 小单层囊泡（SUVs）的制备
    1. 从 −80 °C 取出一份 MLVs 等分试样20°C 储存并在室温下解冻。将微量离心管浸入液氮中15-30秒以瞬时冷冻囊泡，随后立即放入设定温度的水浴中 45 °C 直至溶液完全解冻（1-2 分钟）。重复上述冻融循环 10–15 次，直至溶液浑浊度明显降低。
      注意：将水浴温度设置为高于所融化脂质混合物的相变温度，以确保脂质均匀混合。
    2. 将装有80 nm孔径聚碳酸酯滤膜的基于注射器的小型挤出器用SUV重悬缓冲液平衡。确保系统无泄漏或气泡。尽管挤出法可产生单一分散且脂质损伤最小的SUV，但带负电荷的脂质混合物可能粘附于聚碳酸酯膜上。
    3. 将解冻的脂质溶液轻轻从预平衡的挤出装置一侧推至另一侧，再反向推回。重复此过程5至10次，直至脂质溶液明显变澄清，表明已形成直径约100 nm的SUVs。
    4. 将挤出后的悬浮液（或进行探头超声处理；参见下文注释）在15,000 x g 60 分钟 4 °C 离心沉淀脂质残渣。收集上层80%的溶液，注意不要扰动沉淀，也不要产生气泡。将含有小单层囊泡（SUVs）的上清液转移至新的微量离心管中，置于冰上保存，可存放至多6天。
      注意：可采用以下方式进行探头超声处理，作为离心的替代方法。打开微探头超声仪，并设置如下参数：振幅为最大输出的30%，超声时间10秒，间歇时间60秒。依次用去离子水、2 N NaOH、氯仿及去离子水清洗微探头，将探头分别浸入上述各溶液中，按上述参数超声1–2个循环。将清洁后的探头浸入冻融后的囊泡溶液中，在冰上进行3–6个循环的超声处理，直至溶液变为澄清。
    5. 离心后，检查是否存在脂质严重降解或脂质挤出失败的迹象，如形成一层薄的白色薄膜和/或出现明显可见的沉淀。若出现这些情况，则不应继续后续操作，需重复小单层囊泡（SUV）的制备步骤。
      注意：不同脂质混合物制备的小单层囊泡（SUVs）其保质期可能有所不同。由 DOPC: DGS-NTA-Ni 制备的 SUVs2+ 在这些实验中可稳定保存长达6天。常见问题的解决技巧可在 表2.

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图2：从多层囊泡和小单层囊泡的制备到支撑脂双层形成的流程示意图。使用Biorender创建。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 膜锚定肌动蛋白网络的重建

  1. 样品室的制备
    1. 取3-5片矩形玻璃盖玻片，放入一个Coplin染色缸中。开启超声波清洗仪，并将温度设定为65 °C。向Coplin染色缸中加入2%清洗液，完全浸没盖玻片，并在全脉冲模式下超声处理30分钟。
    2. 使用钝头PTFE涂层镊子逐个从染色缸中取出盖玻片，用去离子水彻底冲洗后，放入另一个装有2 N NaOH的Coplin染色缸中。
    3. 在全脉冲模式下对盖玻片进行20分钟超声处理。逐个取出盖玻片，用去离子水彻底冲洗，然后放入另一个装有去离子水的Coplin染色缸中。
      注意：可选步骤，可在去离子水中超声处理20分钟，然后再次用去离子水冲洗。
    4. 在实验开始前立即取出装有盖玻片的染色缸，置于配有N2气体供应的化学通风橱中。
    5. 通过反复试验优化N2气流的压力，使其刚好足以将水从盖玻片表面吹走而不致破裂。将N2气流方向调整为与盖玻片平面平行，以降低盖玻片破裂的可能性。
    6. 戴手套并使用镊子逐个从染色缸中取出盖玻片，在N2气流下干燥。将每片盖玻片的两面均干燥后，放置于洁净的塑料网格上并加盖。将装有盖玻片的盒子放入干燥器中，以避免接触空气中的灰尘颗粒。
      注意：经N2干燥的盖玻片可在干燥器中保存，最多可保持亲水性达2天。当实验需要多个双分子层，或实验时间超过8小时时，此策略可能非常有用。
    7. 取已灭菌的PCR管，用锋利的手术刀切下其盖子和下部锥形部分。逐个取下圆筒状的半截管，在每个切口管的光滑边缘涂上紫外光固化胶，然后将其倒置放置在刚清洗过的盖玻片上，使边缘平整地贴合在盖玻片表面。
    8. 一旦圆筒放置在盖玻片上后，切勿横向移动，以确保胶水不会流入反应室中央区域。矩形盖玻片可舒适地容纳最多三个反应室，而圆形盖玻片只能在中心容纳一个（图1）。
    9. 将带有反应室的盖玻片放入配有O2供应和真空装置的紫外臭氧清洗机中（或使用紫外灯照射仪）。打开紫外灯，照射3-5分钟，使胶水聚合。延长照射时间（10-15分钟）可提高盖玻片的亲水性，从而改善脂质双分子层的质量。
    10. 将干燥并经紫外照射的样品室在小型塑料盒（如空的矩形盖玻片盒）中保存，最长可达8小时，并用透明薄膜包裹，以减少与空气中灰尘颗粒的接触。
      注意：在紫外光存在下，稳定的O2气流会生成臭氧和氧自由基，可去除盖玻片表面的有机杂质。真空环境可防止过程中产生的有毒臭氧泄漏。
    11. 取出盖玻片，通过向反应室中加入去离子水来检测其是否泄漏。每个反应室最多可容纳约150 µL样品。丢弃有泄漏的反应室。
      注意：另一种优秀且安全的清洗方法是使用等离子清洗仪。时间和功率设置取决于具体型号，但需注意不要过度处理载玻片，否则会导致脂质流动性降低。表面处理会影响脂质的流动性27，如使用清洗液（>45分钟）或NaOH（>30分钟）长时间处理时所观察到的现象。
  2. 支撑脂质双分子层的制备
    1. 用SLB形成缓冲液（或1x PBS）清洗每个反应室，以去除表面污染物，最终保留100 µL缓冲液。用永久性记号笔在100 µL处标记液面，以便可重复追踪体积变化。
    2. 向反应室中加入2 µL 0.1 M CaCl2。这有助于囊泡吸附到玻璃表面，从而增强下一步双分子层的形成。向每个反应室中加入8 µL SUV溶液（来自步骤1.10），在25 °C下孵育15分钟。
      注意：可通过计算所需完全覆盖微孔暴露亲水区域（以两层脂质计）的总脂质数量（平均面积为0.72 nm2）来估算应加入的SUV混合物体积。
    3. 用肌动蛋白运动缓冲液（1x KMEH）洗去未结合的囊泡。首先，移除50 µL SLB形成缓冲液，使反应室中仅保留50 µL。其次，向反应室中加入100 µL 1x KMEH。轻轻混匀，然后移除100 µL缓冲液，注意不要触碰底部。
      注意：洗涤过程中操作需轻柔。确保移液枪头不接触反应室底部。保持移液枪倾斜，使缓冲液流向反应室壁而非直接冲击双分子层，因为直接冲击可能破坏双分子层。移液时注意避免引入气泡，因为气泡可能接触脂质双分子层并造成缺陷。
    4. 重复上述洗涤步骤10次，每次加入100 µL 1x KMEH并移除100 µL。
    5. 向双分子层中加入10 µL 1 mg/mL β-酪蛋白，轻轻混匀后孵育5-10分钟。β-酪蛋白可封闭盖玻片上未形成双分子层的区域。按照步骤2.2.3所述方法，用1x KMEH洗涤3次以去除β-酪蛋白，并将缓冲液体积恢复至100 µL标记处。
  3. 膜-肌动蛋白连接蛋白的添加
    1. 在β-酪蛋白孵育期间（步骤2.2.5），从−80 °C取出一份膜-肌动蛋白连接蛋白样品，迅速在37 °C下解冻，然后置于冰上。用蛋白稀释缓冲液将其稀释至终浓度为1 µM。
    2. 以确定的终浓度（通常为5-20 nM）加入连接蛋白，并轻轻混匀。为确保蛋白在反应室中快速平衡，若加入体积大于20 µL，应先将连接蛋白与1x KMEH预混。
    3. 在室温下孵育40分钟。用1x KMEH缓冲液洗涤3次 以去除未结合的HSE蛋白（方法同步骤2.2.3）。将每个反应室中的缓冲液体积恢复至100 µL标记处。样品现已准备好用于成像。
  4. 脂质双分子层的质量评估
    注意：此为可选步骤，无需每次实验都执行。建议每次从冷冻的MLV储备液新制备SUV时进行此项评估。
    1. 开启显微镜、激发激光器和检测相机。确保激光已对准、物镜已清洁，且软件已准备就绪以采集图像。
    2. 在100x物镜上加油，将样品置于显微镜载物台上，聚焦于双分子层。确保激光位置能使光束在样品表面发生全内反射。使用488 nm激发激光检查双分子层结合的10xHis-YFP-EzrinABD的荧光强度分布。
      注意：高质量的双分子层表现出大范围均匀的荧光强度分布；质量差的双分子层则呈现强烈且斑块状的荧光亮点。
    3. 为确定双分子层的完整性，进行荧光漂白后恢复（FRAP）实验。
      1. 在双分子层上选择一个感兴趣区域，使用信噪比达到5:1或更高的成像条件记录几幅视野图像。暂停记录，并关闭TIRF显微镜的视场光阑，将集中的激光束聚焦于双分子层的一个小圆形区域，以局部漂白荧光团。
      2. 将激光调至最大输出功率，对小区域进行3-10秒的光漂白，然后关闭激光。重新打开视场光阑至原始半径，将成像条件恢复至（漂白前）设置，并立即继续记录视野中荧光信号的恢复情况。
    4. 检查双分子层是否具有流动性。具有良好侧向扩散的正常双分子层恢复迅速，而质量差的双分子层恢复缓慢或完全不恢复（图3）。若双分子层无恢复现象，请查阅故障排除部分并重新开始。将图像保存为16位TIFF文件。如需定量估算扩散系数，请参见下方第3步。
  5. 荧光标记肌动蛋白的聚合
    注意：为节省时间，可在HSE蛋白结合双分子层的孵育期间（步骤2.3）或双分子层质量评估期间（步骤2.4）开始肌动蛋白的聚合。
    1. 将未标记和荧光标记的G-肌动蛋白按10:1的摩尔比混合，并用G缓冲液补足，使G-肌动蛋白浓度为20 µM。最终聚合时的肌动蛋白浓度为此值的1/4。向混合物中加入1/10体积的10x ME缓冲液，得到1x溶液，并孵育2分钟。此步骤将G-肌动蛋白结合的Ca2+离子替换为Mg2+离子。确保最终体积为10 µL的整数倍。
    2. 按以下方法加入所需量的封端蛋白。迅速在37 °C下解冻一瓶封端蛋白储备液，然后置于冰上。用G缓冲液稀释，使封端蛋白浓度为聚合混合液中所需终浓度的两倍。将等体积的稀释封端蛋白溶液加入步骤2.5.1的肌动蛋白混合液中。
    3. 最后，向反应混合物中加入等体积的新鲜2x目标缓冲液。最终溶液的体积应为步骤2.5.2结束时肌动蛋白混合物体积的四倍。确保最终KMEH浓度为1x，ATP为1 mM，BSA为1 mg/mL，G-肌动蛋白为5 µM。
      在25 °C避光孵育45-60分钟，以完成聚合。
      注意：此称为目标缓冲液策略，即将一体积的Mg2+ G-肌动蛋白（步骤2.5.1）与一体积的封端蛋白混合液（步骤2.5.2）及两体积的2x目标缓冲液（步骤2.5.3）混合。该方法便于放大或缩小肌动蛋白用量，并可调节封端蛋白（或其他肌动蛋白调节因子）的相对浓度（图4）。
  6. 荧光标记肌动蛋白丝的添加
    1. 用锋利刀片或剪刀将若干200 µL移液枪头切平，使其末端变钝。使用钝头移液枪头轻轻吸取步骤2.5.3所得的5 µM聚合肌动蛋白所需体积（以防止肌动蛋白丝剪切），并加入洁净的已灭菌PCR管中。
    2. 向管中加入1x KMEH，使总体积>20 µL，并轻轻混匀以避免F-肌动蛋白剪切。从已安装的样品室中移除等体积的缓冲液。
    3. 将聚合的肌动蛋白溶液加入反应室，并轻轻吹打3次，避免触碰底部的双分子层。这有助于肌动蛋白丝在双分子层上均匀分布。将样品安装至TIRF显微镜上（参见步骤2.4.1和步骤2.4.2）。
    4. 可记录F-肌动蛋白结合双分子层的过程。孵育20-30分钟。在F-肌动蛋白添加达到稳态后，从不同视野记录若干图像。观察10xHis-YFP-EzrinABD在肌动蛋白组织形成前（均匀分布）和之后的空间分布变化。
      注意：在无肌动蛋白存在时，HYE在脂质双分子层上均匀分布。加入肌动蛋白丝后，HYE与F-肌动蛋白共定位。共定位程度取决于连接蛋白的肌动蛋白结合亲和力；亲和力越强，共定位程度越高，连接蛋白的侧向流动性越慢（图5）。
  7. 肌球蛋白II的添加
    1. 肌动蛋白孵育30分钟后，将样品重新放回显微镜上（若曾取下）。检查连接蛋白和F-肌动蛋白通道的信号。根据需要调整成像条件。
    2. 选择一个连接蛋白信号均匀、肌动蛋白丝均匀分散且无伪影的区域，进行长时间延时记录。在加入肌球蛋白前，以0.1-0.2 Hz采集10-15帧图像，然后暂停记录。用钝头移液枪头从储备管中吸取所需体积的回收肌肉肌球蛋白II，并加入洁净的已灭菌PCR管中。
    3. 立即向管中加入1x KMEH，使总体积>20 µL，并轻轻混匀。此步骤中也可加入ATP、ATP再生系统、光稳定剂等。小心从已安装的样品室中移除等体积缓冲液，避免扰动样品。
    4. 轻柔地将肌球蛋白溶液加入样品室。不要反复吹打，以免扰动表面结合的丝状结构。立即恢复延时记录，观察系统从肌球蛋白加入前状态，经ATP驱动的肌动球蛋白收缩流和星状结构形成，最终进入ATP耗尽的阻塞状态的演化过程（参见代表性结果）。
    5. 使用仅含缓冲液的样品采集所有通道的背景图像。将所有图像保存为16位.tiff文件。常见问题的解决建议见表2。

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图3：通过快速FRAP实验对双层膜进行质量评估。由DOPC和Ni-NTA脂质（98:2 mol%）制备的支持性脂双层膜（SLBs）包被有HYE（10xHis-YFP标记的膜-肌动蛋白连接蛋白）。在洗去未结合的蛋白质后，使用TIRF显微镜对荧光标记的双层膜进行成像。用高功率激光对双层膜上的小区域进行光漂白，并记录荧光恢复过程。(A) 良好的双层膜总是快速恢复，本实验所用脂质组成的预期扩散系数为1-1.5 µm2/s。(B) 质量差的双层膜恢复非常缓慢或完全不恢复。(C) 质量差的双层膜的代表性图像：(C-i) 含有孔洞的双层膜，(C-ii) 含有大块不移动脂质区域的双层膜，以及(C-iii) 含有小而不移动的点状结构的双层膜。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4： 示意图展示如何使用目标缓冲液法聚合肌动蛋白。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 5： HYE 与 F-actin 结合后的空间分布。 全内反射荧光（TIRF）成像显示 HYE 在加入用 Atto-635 马来酰亚胺标记的肌动蛋白丝前后其空间分布的变化。在加入 F-actin 前，HYE 的分布是均匀的；加入后则与肌动蛋白丝共定位并沿其排列。 请点击此处查看该图的高清版本。

3. 数据分析

  1. 使用 Fiji 软件（https://imagej.net），对连接蛋白图像（来自步骤 2.4）进行背景扣除。测量漂白区域和参考区域的平均强度值。
  2. 将漂白区域和参考区域的时间轨迹归一化至各自漂白前的强度值。将归一化后漂白区域的每个时间点除以归一化后参考区域对应时间点的值。对所得的归一化时间轨迹进行背景校正，并校正采集过程中强度的任何系统性波动（如全局光漂白、z轴漂移等）。
    1. 采用无需拟合的手动方法28估算双层膜锚定蛋白的扩散系数。简言之，通过观察归一化恢复曲线达到其稳态值一半时的时间，可计算恢复曲线的半恢复时间 τ1/2：
      figure-protocol-5
      其中，F0 表示光漂白后第一帧中漂白区域的平均强度，F∞ 表示双层膜恢复的长期稳态值。
    2. 从漂白后斑点轮廓的线扫描中估算有效漂白半径 re，该参数用于校正光漂白过程中的扩散效应29。穿过漂白斑点中心的线扫描的半高全宽 r1/2 与 re 的关系如下：
      figure-protocol-6
      利用步骤 2.8.3 计算得到的 τ1/2、步骤 2.8.4 计算得到的 re 以及最初设定的漂白半径 rn，通过以下公式计算扩散系数 (D)：
      figure-protocol-7
  3. 肌动球蛋白星状结构的图像分析
    1. 使用 Fiji 对所有通道中记录的所有图像进行背景扣除。使用平场校正法对图像进行非均匀照明或干涉图样的校正。
      注：可使用彩色塑料载片，这类样品是进行此类校正的良好平场样本。对于平面双层膜上的连接蛋白和肌动蛋白丝，也可利用多个加肌球蛋白前图像的平均投影，生成各通道特异性的照明校正图。
      1. 以本例所示的 HYE 通道为例，取多个 HYE 图像（在加入肌球蛋白前从脂双层不同区域记录）的平均强度投影。对平均投影（来自加肌球蛋白前图像或任何标准平场样本）应用适当的高斯滤波（σ = 50 至 80 像素）。
      2. 将滤波后的图像转换为 32 位图像。将所有像素值除以整幅图像的平均值，从而获得 HYE 通道的归一化校正图。将 HYE 通道的所有图像除以该图以完成平场校正。采用相同策略为其他通道创建校正图。
    2. 在 Fiji 中使用指数法或简单比值法（根据强度衰减曲线特征选择）对光漂白进行校正。
      1. 为校正任何时间上的 x-y 错位（平移运动），将所有经光漂白校正的通道合并为单个 Hyperstack。使用 Fiji 中的 Hyperstack-Reg 插件，应用刚体或平移变换。
      2. 最后，将对齐后的 Hyperstack 拆分为各个独立通道，并分别保存为 16 位 TIFF 图像栈，用于后续分析。

结果

为便于说明，此处展示光漂白后第一幅图像（即 图3A 中 t = 0 s 时的图像）的典型漂白后恢复曲线，及其对以下函数28（见 图6A）的拟合结果：

figure-results-1

通过拟合该曲线得到的 re 值（23.94 µm）与步骤 2.8.4 中计算出的 re（23.24 µm）非常接近。其中，K 是一个漂白深度参数，可直接从 F0 估算得出（见步骤 2.8.4）。类似地，图 6B 显示了恢复曲线及其对以下函数的拟合结果28：

figure-results-2

我们发现扩散系数的拟合值为 1.34 µm2/s，该值与……的值非常接近 1.39 µm2/，该值由第2.8.4步中的公式计算得出。此处， MF 代表脂双层中可移动部分，即被漂白群体中恢复荧光的比例。脂锚定分子的流动性当然取决于脂质组成及其物理状态（液相或凝胶相）。在使用DOPC为基础的脂膜进行的实验中，其流动性应为 >1 µm2/s，且流动相分数不应低于0.9，以表明脂双层质量良好。我们建议使用无需拟合的手动方法快速检测双层膜的质量与分子流动性。在自动化分析大量FRAP曲线时，拟合方法可能更为适用。此外，若需开展更复杂的FRAP实验以系统表征体系中的扩散行为，我们推荐读者参考Lorén等人的综述。30 有关模型拟合及实验设计中潜在陷阱的更多细节。

figure-results-3
图6：量化脂质双层的扩散系数。（A） 光漂白后第一张图像（图3A 中 t = 0 s）的线扫描轮廓及其对公式4的拟合，用于计算有效漂白半径。（B）漂白区域的恢复曲线及其对公式5的拟合，用于计算扩散系数和可移动组分比例。请点击此处查看该图的放大版本。

通过TIRF显微镜观察支撑脂双层上肌动蛋白-肌球蛋白网络动态组装与组织的上述实验的典型结果如 图7 和补充视频S1所示。

图7展示了连接蛋白、F-肌动蛋白和肌球蛋白II的图像拼接图。

figure-results-4
图7：收缩性肌动球蛋白流动驱动膜-肌动蛋白连接蛋白 HYE 的局部聚集。在向含有 HYE 和 F-肌动蛋白的支撑脂双层（SLB）中加入肌球蛋白 II 后，通过 TIRF 显微镜拍摄的 HYE（YFP 标记）、肌动蛋白丝（用 Atto-635 马来酰亚胺标记）和肌球蛋白 II 丝（用 Atto-565 马来酰亚胺标记）的快照。时间标注在图像上方：0 分钟表示荧光肌丝刚出现在 TIRF 视野中的时刻。在加入肌球蛋白之前（0 分钟），HYE 和 F-肌动蛋白在脂双层上均匀分布。肌球蛋白的活性诱导产生收缩性肌动球蛋白流动，在稳态时形成星状结构（15 分钟），从而驱动与膜偶联的组分（HYE）发生局部聚集。最下方一行为肌动蛋白（黄色）和肌球蛋白 II（洋红色）图像的叠加，显示了不同时间点肌动蛋白与肌球蛋白的组织结构。用于合成这些图像拼接图的原始图像已在 Fiji 软件中对背景信号、非均匀强度模式以及平移运动进行了校正。比例尺 = 10 µm。详细信息请参见 补充视频 S1。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液名称成分
Lipid Rehydration buffer50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% 蔗糖, pH 7.5
SLB Formation buffer50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5–6
SLB Storage buffer50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2
Protein Dilution buffer20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1 mM TCEP 或 DTT, pH 7.2
1X ME 或肌动蛋白离子交换缓冲液 50 mM MgCl₂, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.2（4°C 保存）
1X KMEH 或肌动蛋白聚合缓冲液 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7.2
100 mM ATP 储存液100 mM ATP 二钠盐, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, pH 7.5（-20°C 保存） 
2x 目标缓冲液2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2 mM ATP, 5 mM TCEP（4°C 保存）
G-buffer2 mM Tris, 0.1 mM CaCl₂, 0.2 mM ATP, 0.5 mM TCEP, 0.04% NaN₃, pH 8（4°C 保存）
Myosin II buffer500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10–20 mM HEPES, pH 7.0
凝胶过滤层析缓冲液50 mM Tris-HCl, 150–300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0.1% Tween-20, pH 7.5
封端蛋白储存缓冲液 10 mM Tris·Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5, 20% 甘油 

表1：本实验方案中所用缓冲液成分列表。

常见问题及其解决方案  射击 问题原因可能的解决方案
1脂质双层无扩散现象导致该问题最可能的原因是盖玻片不洁净，这可能发生在清洗液老化或水浴超声过程中未进行加热时。这些双层膜会呈现“囊泡状”外观，因为破裂的囊泡附着在盖玻片上，但彼此之间未发生融合。使用超过6周的多层脂质体（MLVs）或超过6天的小单层脂质体（SUVs），或加入过少的SUVs，也可能导致囊泡状双层膜的形成。使用新鲜的清洗液。确保加热器已开启，温度保持在45-65°C使用新鲜的脂质混合物。（使用荧光脂质探针与荧光蛋白探针时，结果可能有所不同。例如，当双分子层存在亚衍射极限缺陷且未进行表面钝化步骤（或钝化无效）时，脂质探针会显示均匀的荧光强度分布，而荧光蛋白探针则可能出现明亮的荧光斑点。）
2脂质双层出现亮斑长时间孵育SUV以形成双层膜可能导致整体扩散的脂双层，但偶尔会出现明亮的斑块。这些斑块可能是多层双层结构，可吸附大量荧光探针。与 SUV 孵育 15-20 分钟即可。确保探针未发生聚集：将连接蛋白快速高速离心（300 × g，15 分钟， 4 °C）可以去除聚集体
3脂质双层出现暗孔当使用陈旧的小单层脂质体（SUVs）制备双分子层并在长时间内进行成像时，会发生这种情况（> 形成后4小时）、溶液pH值因长时间成像而发生显著变化（例如在高ATP状态下并存在某些氧气清除剂时），或表面用β-酪蛋白过度钝化时（加入过多β-酪蛋白超过10-15分钟，或未充分洗涤去除）。使用新鲜的脂质。降低成像帧率或有效激光照射时间。使用缓冲能力更强的缓冲液。
4脂质双层表现出缓慢的扩散 高胆固醇含量、长链饱和脂质或带电脂质的脂双层扩散较慢。在此类情况下，需在高温下制备样品。可同时使用一种简单且经过验证的脂质组合作为对照，与复杂且未经验证的脂质组成进行比较。确保玻璃器皿洁净。
5肌动蛋白不发生聚合 靶向缓冲液过期，G-肌动蛋白储存液过期，新旧G-肌动蛋白发生共聚合。 确保 Ca2+ 被 Mg 取代2+ 在聚合前（使用ME缓冲液）。使用新鲜的ATP-Mg2+ 储备液。使用 freshly recycled G-actin。确保加入双层膜的 F-actin（以 G-actin 计）浓度高于 0.2 µM对于较低浓度，使用鬼笔环肽稳定的F-肌动蛋白。
6肌动蛋白不与双分子层结合膜-肌动蛋白连接蛋白未添加或添加浓度极低——这一点可通过连接蛋白的荧光信号推断。若荧光信号较强，则表明膜-肌动蛋白连接蛋白已丧失与肌动蛋白结合的能力。此外，若连接蛋白非特异性地结合于玻璃表面（当脂双层质量较差时），也可能无法招募肌动蛋白丝。确保双层膜处于扩散状态。使用新鲜的连接蛋白
7荧光F-肌动蛋白信号较弱标记肌动蛋白与暗肌动蛋白的比例过低。可能是标记肌动蛋白或未标记肌动蛋白保存过久，导致二者无法有效共聚。再次回收肌动蛋白，并使用 freshly recycled actin 重新尝试聚合实验。光损伤可能破坏或解聚 F-actin；如有可能，应选用红色或远红染料标记肌动蛋白（以及肌球蛋白）。 
8肌球蛋白不表现出收缩性可以观察到，在向肌球蛋白浸润的体系中加入ATP后，肌动球蛋白并未出现收缩性。 检测肌球蛋白的浓度或纯度是否良好。使用 freshly recycled 的肌球蛋白（回收后6周内使用）。向肌球蛋白混合物中添加新鲜ATP可能有所帮助。对缓冲液进行脱气处理并使用氧气清除剂等方法可减少马达蛋白的光损伤。  更多信息可在 Plastino 等人或 Stam 等人所著的同一方法合集中找到
9盖玻片不具备亲水性盖玻片未清洗干净。清洁的亲水性盖玻片是  对脂质双层的形成至关重要。清洗程序后，可通过观察水在盖玻片表面的润湿情况，直观判断其亲水性。将少量水滴加至平放的盖玻片上，若盖玻片未彻底清洗，水滴将保持圆形液滴状；而在经过处理、具有亲水性的盖玻片上，相同体积的水会铺展开，形成一层薄水膜。通过观察水在盖玻片表面的润湿行为，可判断使用清洗液/NaOH的清洗步骤是否有效。 .   

表2：常见问题及相应解决方案的故障排除指南。

补充视频 S1：收缩性肌动球蛋白流驱动膜-肌动蛋白连接蛋白 HYE 的局部聚集。 在含有 HYE 和 F-肌动蛋白的支撑脂双层（SLB）中加入肌球蛋白 II 后，对 HYE（YFP 标记）、肌动蛋白丝（用 Atto-635 马来酰亚胺标记）和肌球蛋白 II 丝（用 Atto-565 马来酰亚胺标记）进行 TIRF 显微成像的时间序列观察。时间显示在图像上方：0 分钟为荧光肌丝刚出现在 TIRF 视野中的时刻。比例尺 = 10 µm。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案提供了一个多功能的平台和实验设计的起点，用于研究细胞膜与皮层之间的界面。关键步骤包括洁净玻璃载片的制备、使用新鲜脂质以高效形成小单层脂泡（SUV）（这两者均影响支撑脂双层膜SLB的质量），以及使用新近纯化的肌球蛋白II蛋白以实现肌动蛋白丝的动态重组。在进行长时间动态成像时，非常关键的是引入氧气清除系统（例如原儿茶酸和原儿茶酸3,4-双加氧酶5,31）。

开放腔室设计允许在不引起脂质流动的情况下，向现有系统中依次添加组分。这相较于常用的封闭腔室方法，或在脂质体中封装蛋白质的研究而言，具有重要优势36。然而，诸如蛋白质诱导的膜形变等相反效应，则无法利用玻璃吸附的脂双层进行研究。

脂质双层可以通过多种不同的脂质组成来形成。该过程始于脂质囊泡吸附到亲水性玻璃表面，随后由于表面与囊泡之间以及囊泡与囊泡之间的直接相互作用，囊泡可能发生自发破裂；或者吸附的囊泡达到临界覆盖度后，少量囊泡破裂形成活性边缘，最终促成双层膜的形成32。除了玻璃之外，还可使用多种基底来构建支撑脂质双层，例如云母（如用于原子力显微镜）、软质基底（如聚二甲基硅氧烷）、聚合物垫层33,34,35，以及跨越电子显微镜载网孔洞的结构14。液滴界面双层是另一种构建稳定、自支撑脂质双层的有趣方法36。将肌动蛋白-肌球蛋白网络引入囊泡或乳液中，是一种在类细胞几何结构中研究这一最小系统的强有力方法37,38，该方法在其他文献中有详细描述39。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了安盛研究基金和华威大学-惠康基金会定量生物医学计划（惠康ISSF，RMRCB0058）对DVK的资助，NCBS-TIFR对AB和ST的资助，以及惠康-DBT玛格达尔什会士项目（IA/M/15/1/502018）对SM的资助。DVK还希望感谢生物物理学会支持举办了题为"从分子尺度到介观尺度理解多组分细胞骨架网络的挑战"的虚拟学术交流活动，该活动促进了本实验方案合集的形成。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰)Avanti Polar Lipids81015816:0 RhoPE
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨二乙酸)琥珀酰基]（镍盐）Avanti Polar Lipids790404DGS-NTA-Ni2+
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱Avanti Polar Lipids850375DOPC
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱Avanti Polar Lipids850355DPPC
琥珀色玻璃小瓶赛默飞世尔科技B7990-2A
ATP二钠盐Sigma AldrichA26209
Attofluor 细胞培养皿ThermoFisherA7816
超声波清洗机GT Sonic1860QTS
β-酪蛋白Sigma AldrichC6905
CaCl2赛默飞世尔科技12135
氯仿Sigma Aldrich650471可选自 Electron Microscopy Sciences，货号 50980296
盖玻片，#1，直径 25 mm，Gold Seal哈佛仪器公司64-0705B
盖玻片，#1，40×22 mm，Gold Seal赛默飞世尔科技48404-031
EDTA赛默飞世尔科技G12635
EGTAHimediaMB130
气密性玻璃注射器，带可拆卸钝头针，容量 10 µL，100 µ升，500 µLHammilton1700 系列
Hellmanex IIIHellma AnalyticsZ805939清洗液
HEPESHimediaRM380
KaH2PO4赛默飞世尔科技G13405
KCl赛默飞世尔科技G13305
KOHThermoFisherG26708
脂质挤出器Avanti Polar Lipids61000-1EA
MgCl₂2赛默飞世尔科技G15535
微尖超声波破碎仪声学VC7503 mm 尖端直径
Na2CO3ThermoFisherG15955
NaClHimediaGRM853
NaH2PO4赛默飞世尔科技G15825
NaOH赛默飞世尔科技G27815
尼康Ti Eclipse TIRF显微镜尼康配备TIRF装置，通过保偏光纤连接至安捷伦（Agilent）MLC400单片式激光合束器，该合束器提供多条激光谱线；使用尼康100倍、1.45数值孔径（NA）油浸物镜，并配备两台512 × 512像素的EMCCD相机（Photometrics Evolve 512）
NOA88Norland 产品8801
PTFE 涂层镊子，型号 #2A结构探针0S2AT-XD
冷藏微量离心机Eppendorf5424R
蔗糖赛默飞世尔科技G15925
紫外灯箱NovascanPSD PRO-UV需要真空和 O2 供应

参考文献

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