基于同步成像和流式细胞术检测治疗诱导的衰老癌细胞中的多种荧光衰老标志物

Summary

在这里，我们提出了一种基于流式细胞术的方法，用于可视化和定量单个细胞中多种衰老相关标记物。

Abstract

化疗药物可诱导癌细胞中不可修复的DNA损伤，导致细胞凋亡或过早衰老。与凋亡细胞死亡不同，衰老是抑制癌细胞繁殖的根本不同机制。几十年的科学研究揭示了衰老癌细胞在肿瘤和调节癌细胞和基质细胞的微环境中的复杂病理作用。新的证据表明，衰老是癌症治疗过程中的一个有效预后因素，因此快速准确地检测癌症样本中的衰老细胞至关重要。本文提出了一种可视化和检测癌细胞中治疗诱导的衰老（TIS）的方法。弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系用马磷酰胺（MAF）或柔红霉素（DN）处理，并检查衰老标志物，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal），DNA合成标志物5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）和DNA损伤标志物γ-H2AX（γH2AX）。流式细胞仪成像可以帮助在短时间内生成高分辨率的单细胞图像，以同时可视化和量化癌细胞中的三种标志物。

Introduction

多种刺激可引发细胞衰老，使细胞进入细胞周期停滞的稳定状态。这些刺激包括内在信号变化或外在应力。内在信号包括进行性端粒缩短、端粒结构改变、表观遗传修饰、蛋白稳态障碍、线粒体功能障碍和癌基因激活。外在应激包括炎症和/或组织损伤信号、辐射或化学治疗以及营养剥夺^{1，2，3，4}。在不同类型的衰老中，最常见和研究最充分的是复制性衰老、癌基因诱导的衰老 （OIS）、辐射诱导的衰老和治疗诱导的衰老 （TIS）。OIS是对异常癌基因激活产生的复制应激引起的遗传毒性损伤的急性细胞反应，并且可以在一定程度上阻止从肿瘤前病变到完全肿瘤的病理进展。当肿瘤细胞受到化疗药物或电离辐射^5，6的压力时，就会发生TIS。

衰老被认为是病理学中的双刃剑，因为它具有高度的动态性质。它最初被描述为一种有益的肿瘤抑制机制，从分裂细胞的循环池中去除受损细胞，保护器官的正常功能并抑制肿瘤生长^7，8，

Protocol

1. DLBCL细胞系与马磷酰胺或柔红霉素治疗，诱导细胞衰老

注意:该协议也适用于贴壁癌细胞。根据细胞大小，将1-2×10⁵ 个细胞放入6孔板的一个孔中，并将板在5%CO₂，37°C培养箱中孵育过夜，然后在处理前。方案步骤与悬浮细胞相同，但有两个例外。首先，需要在步骤3.4之后将细胞从板上胰蛋白酶消化。其次，在胰蛋白酶消化之前无需离心即可执行洗涤步骤。

1. 计数DLBCL细胞并将1×10⁶ 个细胞/ mL接种在每孔4mL培养基中放入6孔培养板中。在补充有10%胎牛血清（FBS）和100 U / mL青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养DLBCL细胞。
2. 将MAF（5微克/毫升）或DN（20纳克/毫升）加入细胞培养物中，轻轻摇动板进行混合。
   注意:动态影像防抖动和 DN 不稳定。溶解在DMSO后，应等分试样储备溶液并储存在-20°C。 应避免冷冻/解冻循环。
3. 将板在5%CO₂，37°C培养箱中孵育3天。
4. 孵育3天后，将DLBCL细胞收集在15mL无菌离心管中，并在100× g，4°C下旋转5分钟。
5. 弃去上清液，用4mL新鲜培养基重悬细胞沉淀，并将悬浮液重新加入6孔板中。
6. 在收获之前，在5%CO₂

Results

使用图像分析软件通过加载单色控制样品的记录数据来生成补偿矩阵。如 补充图S1所示，检测到从EdU到C 12 FDG的不可忽略（系数值≥_0.1）光溢出，串扰系数值为0.248，而其他通道之间的串扰不显着。用5μg/ mL MAF或20 ng / mL DN处理四种不同的DLBCL细胞系以诱导细胞衰老，并使用常规SA-β-gal染色或成像流式细胞术方法进行分析。

超过70%的KARPAS422，WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞进入衰老状态，表现为阳性SA-β-gal，而SU-DHL6对MAF和DN诱导衰老完全耐受（补充图S2A）。值得注意的是，MAF和DN也诱导所有DLBCL细胞中的细胞死亡，尽管不是显着的（补充图S2B）。使用成像流式细胞术方法，单细胞图像和基于流式细胞术的定量显示，KARPAS422，WSU-DLCL2和^OCI-LY1中的C₁₂FDG ⁺ EdU-γH2AX ^+<.......

Discussion

该方法通过明场成像和流式细胞术定量检查了化疗后四种不同DLBCL细胞系的衰老进入能力。在单细胞水平上，我们成功地在经过处理的KARPAS422和^WSU-DLCL2细胞中检测到主要的C₁₂FDG ⁺ EdU-Ki67 ⁺衰老群体，并且在较小程度上在OCI-LY1细胞中检测到，而SU-DHL6细胞系对治疗具有抗性。细胞系之间衰老进入能力的差异可以通过其独特的基因组缺陷^{来解释16，17}。然而，不适当的细胞培养密度或药物浓度也可能影响衰老诱导性。应仔细选择细胞密度和药物浓度的连续稀释度，以进行更全面的检查。值得注意的是，该方法足够灵敏，可以在没有额外遗传毒性刺激的情况下准确检测DLBCL细胞中自然发生的衰老群体（图3中C₁₂FDG ^{+ EdU-Ki67 +} DMSO处理的组）。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 抗 H2A.X 磷酸化 （Ser139） 抗体	Biolegend	613407
抗 Ki-67 小鼠单克隆抗体 （Alexa Fluor 647）	Biolegend	350509
C12FDG（5-十二烷基氨基荧光素二-β;-D-吡喃半乳糖苷）	Fisher Scientific	11590276
氯喹-二磷酸盐	Sigma aldrich	C6628
清洁剂（Coulter Clenz）	贝克曼库尔特	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue流式细胞术检测试剂盒	Thermo Scientific	C10418
红霉素	Medchemexpress	HY-13062A
消泡剂（70%异丙醇）	Millipore	1.3704
图像分析软件（Amnis 创意 6.3）	Luminex	CN-SW69-12
仪器及成像软件 （Amnis ImageStreamX Mk II 成像流式细胞仪系统和 INSPIRE 软件）	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide 环己胺	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
多聚甲醛	Fisher Scientific	11473704
PETG（2-苯乙基-β;-D-硫代半乳糖苷）	Sigma aldrich	P4902
皂苷	Sigma aldrich	47036
护套	Millipore	BSS-1006-B
用于 ImageStream	Luminex	400041
灭菌器的 SpeedBead 套件（0.4-0.7% 次氯酸盐）	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	帝斯曼	ACC 575