同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

摘要

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。

摘要

化疗药物可在癌细胞中诱导不可逆的DNA损伤，导致细胞凋亡或过早衰老。与凋亡性细胞死亡不同，衰老是一种本质上不同的机制，可抑制 癌细胞的增殖。数十年的科学研究揭示了衰老癌细胞在肿瘤及其微环境中复杂的病理效应，这些效应可调节癌细胞和间质细胞的行为。新近证据表明，细胞衰老是癌症治疗过程中一个重要的预后因素，因此在癌组织样本中快速、准确地检测衰老细胞至关重要。本文介绍了一种用于可视化和检测癌细胞中治疗诱导性衰老（TIS）的方法。采用甲酰磷酰胺（mafosfamide, MAF）或柔红霉素（daunorubicin, DN）处理弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系，并检测衰老标志物——衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）、DNA合成标志物5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）以及DNA损伤标志物γ-H2AX（γH2AX）。通过流式细胞仪成像，可在短时间内获得高分辨率的单细胞图像，从而同时对癌细胞中的这三种标志物进行可视化观察和定量分析。

引言

多种刺激可触发细胞衰老，导致细胞进入稳定的细胞周期阻滞状态。这些刺激包括内在的信号变化或外在的应激因素。内在信号包括端粒进行性缩短、端粒结构改变、表观遗传修饰、蛋白质稳态失调、线粒体功能障碍以及癌基因的激活。外在应激因素包括炎症和/或组织损伤信号、辐射或化学处理以及营养缺乏^1,2,3,4。在不同类型的衰老中，最常见且研究最深入的是复制性衰老、癌基因诱导的衰老（OIS）、辐射诱导的衰老以及治疗诱导的衰老（TIS）。OIS 是细胞对异常癌基因激活引起的复制应激所导致的基因毒性损伤的一种急性反应，在一定程度上可阻止癌前病变向完全恶性肿瘤的病理进展。TIS 则发生在肿瘤细胞受到化疗药物或电离辐射应激时^5,6。

衰老在病理学中因其高度动态的特性而被视为一把双刃剑。最初，衰老被认为是一种有益的肿瘤抑制机制，可通过清除分裂细胞群体中的受损细胞，保护器官的正常功能并抑制肿瘤生长。^7,8,9然而，越来越多的证据表明细胞衰老也存在不利的一面。衰老细胞会分泌促炎性细胞因子，即衰老相关分泌表型（SASP），导致纤维化和器官功能障碍，并促进肿瘤的发生与进展¹⁰此外，衰老的癌细胞会伴随染色质重塑和持续性DNA损伤反应（DDR）的激活，同时发生表观遗传和基因表达的重编程。^11,12，新获得癌症干细胞特性³尽管具有衰老能力的肿瘤对治疗干预的反应优于缺乏衰老能力的肿瘤¹³，如果衰老细胞未能被衰老细胞清除药物有效识别并清除，可能会导致较差的长期预后⁵因此，一种可靠的衰老评估方法具有重要的临床意义，不仅有助于治疗方案的预后判断，也对靶向衰老细胞的新型策略开发至关重要。

无论诱因如何，衰老细胞均表现出一些共同特征，包括体积增大、形态扁平、多核并伴有大空泡，细胞核显著扩张，细胞核内形成富含H3K9me3的衰老相关异染色质灶（SAHF），DNA损伤标志物γH2AX焦点持续积累，p53-p21^CIP1和Rb-p16^INK4a细胞周期调控通路被激活，细胞稳定停滞于G1期，衰老相关分泌表型（SASP）大量诱导，以及衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性升高¹⁴。由于单一标志物不足以定义细胞衰老，通常将被视为衰老检测金标准的SA-β-gal酶活性染色，与H3K9me3和Ki67的免疫组织化学染色联合使用，以检测治疗诱导的衰老（TIS）¹⁵。然而，基于化学显色的SA-β-gal检测难以实现定量分析。在此，我们结合了5-十二烷酰氨基荧光素二-β-D-半乳糖吡喃苷（C₁₂FDG）荧光法检测SA-β-gal（fSA-β-gal）与γH2AX免疫荧光染色及EdU掺入DNA检测，利用先进的成像流式细胞术系统识别C₁₂FDG⁺EdU^-γH2AX⁺衰老细胞。该系统结合了流式细胞术的高速度、高灵敏度与显微镜所能提供的单细胞精细图像及空间信息，而这些信息是传统流式细胞术和显微镜各自无法单独提供的。该方法可快速生成高分辨率图像，实现细胞内荧光信号的定位与定量，同时通过建立标准化分析流程，支持多个样本的快速分析。

方案

1. 使用马法兰酰胺或柔红霉素处理弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系以诱导细胞衰老

注意：该方案同样适用于贴壁癌细胞。根据细胞大小，将 1-2 × 10⁵ 个细胞接种至 6 孔板的一个孔中，并在处理前于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中过夜培养。该方案的步骤与悬浮细胞相同，但有两个例外。第一，在步骤 3.4 之后需用胰蛋白酶消化使细胞从培养板上脱落。第二，在胰蛋白酶消化前的洗涤步骤中不进行离心。

1. 计数弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞，并将细胞以每毫升1 × 10⁶个细胞的密度接种于6孔培养板中，每孔加入4 mL培养基。在含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养DLBCL细胞。
2. 向细胞培养物中加入MAF（5 µg/mL）或DN（20 ng/mL），轻轻摇动培养板以混匀。
   注意：MAF和DN不稳定。溶解于DMSO后，应将储备液分装并储存于-20 °C，避免反复冻融。
3. 将培养板置于5% CO₂、37 °C的培养箱中孵育3天。
4. 孵育3天后，将DLBCL细胞收集至15 mL无菌离心管中，在4 °C、100 × g条件下离心5分钟。
5. 弃去上清液，用4 mL新鲜培养基重悬细胞沉淀，并将细胞悬液重新加回6孔板中。
6. 将细胞培养板继续在5% CO₂、37 °C培养箱中培养2天，随后收获细胞用于分析。

2. 准备染色用溶液（表1）

3. 使用不同衰老标志物对DLBCL细胞进行染色

注意：需制备使用单个标记染色的细胞样品（即太平洋蓝-EdU、C₁₂FDG 或 Alexa Fluor 647-γH2AX），以生成补偿矩阵，校正检测过程中发生的荧光溢出。尽管强烈建议执行此步骤，但当不同荧光染料的发射光谱重叠可忽略（补偿系数值 ≤ 0.1）时，可省略该步骤。然而，用户在使用不同仪器和荧光检测面板时，必须确定标准化的补偿步骤。

1. 将10 mM EdU溶液以1:1,000的比例加入步骤1.6制备的DLBCL细胞培养物中（最终EdU浓度为10 µM）。轻轻摇动培养板混匀，并在5% CO₂、37 °C培养箱中孵育3小时。
2. 从培养箱中取出培养板，加入100 mM氯喹溶液至终浓度为75 µM（参见讨论部分）。轻轻摇动培养板混匀，并在5% CO₂、37 °C培养箱中孵育30分钟。
3. 从培养箱中取出培养板，加入20 mM C₁₂FDG溶液，按1:1,000稀释（最终C₁₂FDG浓度为20 µM）。轻轻摇动培养板混匀，并在5% CO₂、37 °C培养箱中孵育1小时。
4. 从培养箱中取出培养板，加入100 mM 2-苯乙基-β-D-硫代半乳糖苷（PETG）溶液，按1:50稀释以终止fSA-β-gal染色（最终PETG浓度为2 mM）。轻轻旋转培养板混匀。
5. 将细胞转移至15 mL无菌离心管中，在100 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，用4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
6. 重复PBS洗涤步骤一次。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL 4%多聚甲醛固定液中。
7. 室温孵育10分钟后，在250 × g、室温条件下离心5分钟。弃去上清液，用4 mL PBS洗涤细胞。
8. 重复PBS洗涤步骤一次。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL皂苷通透缓冲液中，并将悬液转移至新的1.5 mL离心管中。室温孵育10分钟后，在250 × g、室温条件下离心5分钟。
9. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL一抗溶液中（在抗体孵育液中按1:500稀释γH2AX抗体）。4 °C避光过夜孵育。
10. 在250 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，用100 µL皂苷洗涤液洗涤一次。
11. 再重复洗涤步骤两次。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL EdU检测试剂混合液中。
12. 室温避光孵育30分钟。在250 × g、室温条件下离心5分钟。弃去上清液，用1 mL皂苷洗涤液洗涤一次。
13. 再重复洗涤步骤两次。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20–50 µL PBS中。随后进入第4节进行样本检测。

4. 使用成像流式细胞仪系统检测衰老标志物

1. 清空废液瓶。在开启仪器前，检查流速珠、消毒剂、清洁剂、除泡剂、鞘液和冲洗试剂（去离子水）的液位，确保液体充足（参见材料表）。
2. 开启仪器及成像软件（参见图1A中的软件界面）。
3. 点击启动按钮以初始化流路系统并进行系统校准。
   注意：此过程约需45分钟。
4. 将放大倍数设为40x，将流速设为低速，并开启实验所需的激光器。开启405 nm、488 nm和642 nm激光器，分别用于检测EdU-太平洋蓝、C₁₂FDG和Alexa Fluor 647-γH2AX（或Alexa Fluor 647-Ki67）。将Ch6设为散射通道，将Ch1和Ch9设为明场。
5. 从预期荧光最强的样本开始，调节激光强度。轻轻翻转样本管以混匀。打开管盖，将样本管插入进样口。点击加载开始进样。
6. 打开散点图，分别选择Area_M01和Aspect Ratio_M01作为X轴和Y轴。设置门控，选择长宽比大于0.5的细胞群，以排除下方和右侧的双细胞及细胞聚集体，以及左侧的速度珠群体（图1B）。
7. 打开直方图，选择Gradient RMS_M01_Ch01作为X轴。选择单细胞群体，并设置门控以筛选聚焦良好的细胞（图1C）。
   注意：成像系统将自动利用速度珠调整焦距。但建议选择直方图峰值右侧半部分，以获得最佳聚焦的细胞群体。
8. 打开直方图，为每个荧光通道（Ch2、7和11）选择原始最大像素强度作为X轴。调节激光功率（即分别对应Ch2、7和11的488 nm、405 nm和642 nm激光器），使每种荧光染料的原始最大像素值保持在100至4,000之间，以避免信号过饱和。
   注意：本实验中，激光功率设置分别为50 mW、200 mW和50 mW，对应488 nm、405 nm和642 nm激光器。
9. 选择聚焦良好的细胞群体进行记录，点击采集，以一致的参数测量DLBCL样本。更换样本时，点击返回取出样本管，按加载以弃去样本。
10. 所有样本测量完成后，关闭明场和散射激光。测量单色对照样本，以生成补偿矩阵。
11. 点击关机关闭成像系统。
12. 在图像分析软件中分析数据。
    1. 使用图像分析软件中的斑点向导工具，自动计数并量化活细胞图像中细胞核内的γH2AX焦点。选择两个细胞群体（一个高斑点数，一个低斑点数）训练斑点向导，以便后续自动进行斑点计数分析。

结果

使用图像分析软件加载单色对照样本的记录数据，生成了补偿矩阵。如补充图S1所示，检测到EdU对C₁₂FDG存在不可忽略的光溢出（系数值 ≥ 0.1），串扰系数为0.248，而其他通道之间的串扰不显著。四种不同的DLBCL细胞系分别用5 µg/mL MAF或20 ng/mL DN处理以诱导细胞衰老，并采用传统的SA-β-半乳糖苷酶染色或成像流式细胞术方法进行分析。

超过70%的KARPAS422、WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞进入衰老状态，表现为SA-β-半乳糖苷酶阳性，而SU-DHL6细胞对MAF和DN诱导的衰老完全耐受（补充图S2A）。值得注意的是，MAF和DN也在所有DLBCL细胞中诱导了细胞死亡，尽管程度并不显著（补充图S2B）。通过成像流式细胞术方法，单细胞图像及基于流式细胞术的定量分析显示，在KARPAS422、WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞中，C₁₂FDG⁺EdU^-γH...

讨论

本方法通过明场成像和基于流式细胞术的定量分析，检测了四种不同弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系在接受化疗处理后进入衰老状态的能力。在单细胞水平上，我们成功检测到经处理的KARPAS422和WSU-DLCL2细胞中存在大量C₁₂FDG⁺EdU^-Ki67⁺的衰老细胞群体，在OCI-LY1细胞中也有一定程度的出现，而SU-DHL6细胞系则对处理具有抗性。不同细胞系在进入衰老能力上的差异可能归因于其独特的基因组缺陷^16,17。然而，不适当的细胞培养密度或药物浓度也可能影响衰老的诱导能力。为了进行更全面的分析，应谨慎选择细胞密度和药物浓度的梯度稀释方案。值得注意的是，该方法的灵敏度足以准确检测在未施加额外基因毒性刺激条件下DLBCL细胞中自然发生的衰老细胞群体（见图3中C₁₂FDG⁺EdU^-Ki67⁺

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 647 抗 H2A.X 磷酸化（Ser139）抗体	Biolegend	613407
抗 Ki-67 小鼠单克隆抗体（Alexa Fluor 647）	Biolegend	350509
C12FDG（5-十二烷酰氨基荧光素二-β-D-半乳吡喃糖苷）	费舍尔科技	11590276
氯喹-二磷酸盐	Sigma aldrich	C6628
清洗剂（Coulter Clenz）	贝克曼库尔特	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue 流式细胞术检测试剂盒	赛默飞世尔科技	C10418
柔红霉素	Medchemexpress	HY-13062A
除泡剂（70% 异丙醇）	默克密理博	1.3704
图像分析软件（Amnis IDEAS 6.3）	Luminex	CN-SW69-12
仪器及成像软件（Amnis ImageStreamX Mk II 成像流式细胞仪系统及 INSPIRE 软件）	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
马法兰环己胺盐	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
多聚甲醛	费舍尔科技	11473704
PETG（2-苯乙基-β-D-硫代半乳糖苷）	Sigma aldrich	P4902
皂苷	Sigma aldrich	47036
鞘液	默克密理博	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
消毒剂（0.4–0.7% 次氯酸盐）	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575