基于同步成像和流式细胞术检测治疗诱导的衰老癌细胞中的多种荧光衰老标志物

多种刺激可引发细胞衰老，使细胞进入细胞周期停滞的稳定状态。这些刺激包括内在信号变化或外在应力。内在信号包括进行性端粒缩短、端粒结构改变、表观遗传修饰、蛋白稳态障碍、线粒体功能障碍和癌基因激活。外在应激包括炎症和/或组织损伤信号、辐射或化学治疗以及营养剥夺^{1，2，3，4}。在不同类型的衰老中，最常见和研究最充分的是复制性衰老、癌基因诱导的衰老 （OIS）、辐射诱导的衰老和治疗诱导的衰老 （TIS）。OIS是对异常癌基因激活产生的复制应激引起的遗传毒性损伤的急性细胞反应，并且可以在一定程度上阻止从肿瘤前病变到完全肿瘤的病理进展。当肿瘤细胞受到化疗药物或电离辐射^5，6的压力时，就会发生TIS。

衰老被认为是病理学中的双刃剑，因为它具有高度的动态性质。它最初被描述为一种有益的肿瘤抑制机制，从分裂细胞的循环池中去除受损细胞，保护器官的正常功能并抑制肿瘤生长^7，8，9。然而，新出现的证据表明衰老有黑暗的一面。衰老细胞分泌促炎细胞因子，称为衰老相关分泌表型（SASP），导致纤维化和器官功能障碍，并促进肿瘤的发生和进展¹⁰。此外，衰老的癌细胞与染色质重塑和持续DNA损伤反应（DDR）的激活同时进行表观遗传和基因表达重编程^11，12，新获得新的癌症干细胞特性³。虽然与衰老能力较弱的肿瘤相比，衰老功能的肿瘤对治疗干预的反应更好¹³，但如果衰老细胞不能被高效识别和消除，则衰老细胞的持续存在可能导致长期预后不良⁵。无论哪种方式，评估衰老的可靠方法都具有重要的临床意义，不仅对于治疗的预后，而且对于开发针对衰老细胞的新策略。

无论触发因素如何，衰老细胞都表现出一些共同的特征，包括增大、扁平、多核形态与大液泡、细胞核显著扩张、细胞核中形成富含H3K9me3的衰老相关异染色质（SAHF）、DNA损伤标记物γH2AX病灶的持续积累、活化的p53-p21^CIP1和Rb-p16^INK4a 细胞周期调节机制、稳定的 G1 细胞周期停滞、SASP 的大量诱导以及衰老相关的β半乳糖苷酶 （SA-β-gal） 活性升高¹⁴.由于没有单一标记物足以定义衰老，因此SA-β-gal活性的酶染色被认为是衰老检测的金标准，通常与H3K9me3和Ki67的免疫组化染色相结合以检测TIS¹⁵。然而，基于化学显色的SA-β-gal很难量化。在这里，我们将5-十二酰氨基荧光素-二-β-D-半乳糖基糖苷（C₁₂FDG）荧光基SA-β-gal（fSA-β-gal）检测与γH2AX和EdU掺入的DNA的免疫荧光染色相结合，使用先进的成像流式细胞仪系统鉴定C₁₂FDG ⁺ EdU-γH2AX ⁺衰老细胞，该系统将速度，灵敏度和详细的单细胞图像与流式细胞术和显微镜无法提供的空间信息相结合。该方法可以快速生成高分辨率图像，从而允许对细胞内的荧光信号进行定位和定量，同时通过构建标准管道获得对多个样品的快速分析的许可。

1. DLBCL细胞系与马磷酰胺或柔红霉素治疗，诱导细胞衰老

注意:该协议也适用于贴壁癌细胞。根据细胞大小，将1-2×10⁵ 个细胞放入6孔板的一个孔中，并将板在5%CO₂，37°C培养箱中孵育过夜，然后在处理前。方案步骤与悬浮细胞相同，但有两个例外。首先，需要在步骤3.4之后将细胞从板上胰蛋白酶消化。其次，在胰蛋白酶消化之前无需离心即可执行洗涤步骤。

1. 计数DLBCL细胞并将1×10⁶ 个细胞/ mL接种在每孔4mL培养基中放入6孔培养板中。在补充有10%胎牛血清（FBS）和100 U / mL青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养DLBCL细胞。
2. 将MAF（5微克/毫升）或DN（20纳克/毫升）加入细胞培养物中，轻轻摇动板进行混合。
   注意:动态影像防抖动和 DN 不稳定。溶解在DMSO后，应等分试样储备溶液并储存在-20°C。 应避免冷冻/解冻循环。
3. 将板在5%CO₂，37°C培养箱中孵育3天。
4. 孵育3天后，将DLBCL细胞收集在15mL无菌离心管中，并在100× g，4°C下旋转5分钟。
5. 弃去上清液，用4mL新鲜培养基重悬细胞沉淀，并将悬浮液重新加入6孔板中。
6. 在收获之前，在5%CO₂，37°C培养箱中再培养2天进行细胞板以进行分析。

2. 制备染色溶液（表1）

3. 用不同的衰老标志物染色DLBCL细胞

注意:准备用单个标记物（即太平洋蓝EdU，C₁₂FDG或Alexa Fluor 647-γH2AX）染色的细胞样品以产生补偿基质以校正测量过程中的荧光溢出。尽管强烈建议这样做，但当不同荧光团之间的发射光谱存在可忽略的重叠（补偿系数值≤0.1）时，可以暂停此步骤。但是，用户在使用不同的仪器和荧光板时必须确定标准化的补偿步骤。

1. 将10mM EdU溶液以1:1，000的比例加入步骤1.6产生的DLBCL细胞培养物中（最终EdU浓度为10μM）。轻轻摇动板以混合并在5%CO₂，37°C培养箱中孵育3小时。
2. 将板从培养箱中取出，加入100 mM氯喹溶液至终浓度为75μM（参见讨论）。轻轻摇动板以混合并在5%CO₂，37°C培养箱中孵育30分钟。
3. 将板从培养箱中取出，以_1:1，000向最终的C₁₂FDG浓度为20μM加入20μM的20mM中加入20mM的20mM C₁₂ FDG溶液。
4. 将板从培养箱中取出，以1:50的比例加入100mM 2-苯乙基-β-D-硫代乳糖苷（PETG）溶液，以停止fsA-β-gal染色（最终PETG浓度为2mM）。轻轻旋转盘子进行混合。
5. 将细胞转移到15mL无菌离心管中，并在100× g，4°C下旋转5分钟。弃去上清液，用4mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。
6. 重复 PBS 清洗步骤。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于500μL4%多聚甲醛固定溶液中。
7. 在室温下孵育10分钟后，在250× g下离心，室温下离心5分钟。弃去上清液并用4 mL PBS洗涤细胞。
8. 重复 PBS 清洗步骤。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200μL皂苷透化缓冲液中，并将悬浮液转移到新的1.5mL管中。在室温下孵育10分钟后，在250× g下离心，室温下离心5分钟。
9. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于200μL一抗溶液（1:500 γH2AX抗体在抗体培养液中）中。在4°C下在黑暗中孵育过夜。
10. 将管在250× g，4°C下离心5分钟。弃去上清液，用100μL皂苷洗涤液洗涤。
11. 再重复洗涤步骤两次。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于500μLEdU检测混合物中。
12. 在室温下在黑暗中孵育30分钟。在250× g下离心，室温下离心5分钟。弃去上清液，用1 mL皂苷洗涤液洗涤。
13. 重复洗涤步骤两次。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于20-50μLPBS中。继续第 4 节进行样品测量。

4. 使用成像流式细胞仪系统对衰老标志物进行成像

1. 清空废液瓶。在打开仪器之前，请检查速度磁珠、灭菌器、清洁剂、消泡剂、护套和漂洗试剂（去离子水）的液位，以确保有足够的液体（参见 材料表）。
2. 打开仪器和成像软件（参见 图1A中的软件界面）。
3. 单击 "启动" 按钮以初始化流体和系统校准。
   注意:此过程大约需要 45 分钟。
4. 将 放大倍率 设置为 40x，将 流体速度 设置为 低，然后打开实验中所需的激光器。打开 405 nm、488 nm 和 642 nm 激光器，分别测量 EdU 太平洋蓝、C₁₂FDG 和 Alexa Fluor 647-γH2AX （或 Alexa Fluor 647-Ki67）。将 Ch6 设置为 散射通道， 将 Ch1 和 Ch9 设置为 明场。
5. 从预计具有最高荧光的样品开始，以设置激光的强度。轻轻翻转样品管进行混合。打开试管盖，然后将样品管插入底座。单击" 加载" 以开始。
6. 打开散点图并分别选择 X 轴和 Y 轴Area_M01和坡向Ratio_M01的特征。将栅极设置为高于 0.5 的纵横比，以排除下方和右侧的双晶和细胞聚集体，以及左侧的速度磁珠填充（图 1B）。
7. 打开直方图图，然后为 X 轴选择要素渐变RMS_M01_Ch01。选择单线态群体并设置要为聚焦细胞选择的门（图1C）。
   注:成像系统将自动使用速度珠来调整成像的焦点。但是，建议为重点最集中的人群选择直方图峰值的右半部分。
8. 打开直方图，为每个颜色通道（Ch2、7 和 11）的 X 轴选择"原始最大像素强度"。调整激光功率（即 Ch2、7 和 11 的激光器分别为 488 nm、405 nm 和 642 nm），使每个荧光染料的原始最大像素值介于 100 和 4，000 之间，以避免过饱和。
   注意:对于此实验，激光器488 nm、405 nm和642 nm的激光器功率设置分别为50 mW、200 mW和50 mW。
9. 选择要记录的聚焦群体，然后单击" 获取 "以使用一致的设置测量DLBCL样本。更换样品进行测量时，单击 "返回 "以回收样品管。按 "加载" 以 丢弃 样品。
10. 测量完所有样品后，关闭明场并散射激光。测量单色对照样品以生成补偿矩阵。
11. 单击 关机 以关闭映像系统。
12. 在图像分析软件中分析数据。
    1. 使用图像分析软件的 点向导 工具自动计数和量化活细胞图像中的核γH2AX病灶。选择两个细胞群（一个具有高点计数，另一个具有低点计数）以训练点向导以进行进一步的自动点计数分析。

使用图像分析软件通过加载单色控制样品的记录数据来生成补偿矩阵。如 补充图S1所示，检测到从EdU到C 12 FDG的不可忽略（系数值≥0.1）光溢出，串扰系数值为0.248，而其他通道之间的串扰不显着。用5μg/ mL MAF或20 ng / mL DN处理四种不同的DLBCL细胞系以诱导细胞衰老，并使用常规SA-β-gal染色或成像流式细胞术方法进行分析。

超过70%的KARPAS422，WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞进入衰老状态，表现为阳性SA-β-gal，而SU-DHL6对MAF和DN诱导衰老完全耐受（补充图S2A）。值得注意的是，MAF和DN也诱导所有DLBCL细胞中的细胞死亡，尽管不是显着的（补充图S2B）。使用成像流式细胞术方法，单细胞图像和基于流式细胞术的定量显示，KARPAS422，WSU-DLCL2和OCI-LY1中的C12FDG + EdU-γH2AX +衰老群体增加，但在SU-D6细胞中不增加（图2A-D），这与传统的SA-β-gal染色结果一致。然而，C12FDG + EdU-γH2AX +衰老群体的百分比显着低于传统的SA-β-gal染色方法（图2和补充图S2）。

此外，成像流式细胞术分析显示，不同DLBCL细胞系的衰老诱导性不同，传统的SA-β-gal染色不能清楚地区分。C12FDG+EdU-γH2AX+衰老OCI-LY1细胞的百分比（即MAF和DN分别为43.2%和31.9%）明显低于KAPAS422（MAF和DN分别为62.2%和73.8%）和WSU-DLCL2（MAF和DN分别为60%和58.1%）（图2）。重要的是，基于成像的分析显示，KARPAS422、WSU-DLCL2 和 OCI-LY1 中 γH2AX 病灶的数量显著增加，但在 SU-DHL6 细胞中却没有（图 3A，B）。

图 1:操作软件界面和仪器设置（A） 成像流式细胞仪软件界面。活细胞图像面板（左上角）包含所有12个图像通道的活细胞图像和图像调整工具（例如，缩放、细胞群选择、颜色变化、蒙版和图像属性调整）。流式细胞术分析区域（左下角）包含用于流式细胞术分析的工具栏，例如直方图、散点图、各种区域门控、布局和人口统计。控制面板（右）包含用于数据采集和保存、照明设置、放大倍率、流体速度控制、对焦和对中的菜单。（B）单细胞群的选择。（C）选择重点细胞群。请点击此处查看此图的大图。

图2:在单细胞水平上对衰老细胞进行可视化和定量。 C12FDG+ EdU-γH2AX+ 衰老细胞的代表性图像（左图）和流式细胞术分析（右图），包括 （A） KARPAS422、（B） WSU-DLCL2、（C） OCI-LY1 和 （D） 用 5 μg/mL MAF 或 20 纳克/毫升 DN 处理 5 天的 SU-DHL6 细胞，并染色用于 fSA-β 加仑、EdU 和 γH2AX。使用DMSO处理的细胞作为对照。缩写:C12FDG = 5-十二烷酰氨基荧光素-二-β-二羟甲基吡啶;EdU = 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷;γH2AX = 组蛋白 H2AX 的磷酸化形式;DMSO = 二甲基亚砜;氨纶 = 马磷酰胺;DN = 柔红霉素;fSA-β-gal = 基于荧光的衰老相关β-半乳糖苷酶。请点击此处查看此图的大图。

图3:基于成像的衰老细胞中核γH2AX病灶的定量（A）DLBCL细胞中γH2AX病灶的代表性图像（参见图2的文本了解治疗和染色细节）。（B）DLBCL细胞中γH2AX病灶计数的频率（左）和定量（右）。缩写:γH2AX = 组蛋白H2AX的磷酸化形式;DMSO = 二甲基亚砜;氨纶 = 马磷酰胺;DN = 柔红霉素。请点击此处查看此图的大图。

表 1:染色解决方案。

补充图S1:教育大学太平洋蓝，C12FDG-荧光素和AF647-γH2AX的补偿矩阵。 缩写:C12FDG = 5-十二烷酰氨基荧光素-二-β-己二酰基拉诺苷;EdU = 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷;γH2AX = 组蛋白 H2AX 的磷酸化形式;AF647 = 亚历克莎·福陆647。 请按此下载此档案。

补充图S2:治疗诱导的DLBCL细胞系衰老。（A）用5μg/ mL MAF或20 ng / mL DN处理的指示的DLBCL细胞系的常规SA-β-gal染色（左图）和定量（右图）。在室温下用幽灵染料太平洋蓝染色细胞15分钟。缩略语: DMSO = 二甲基亚砜;氨纶 = 马磷酰胺;DN = 柔红霉素;SA-β-gal = 衰老相关的β-半乳糖苷酶。请按此下载此档案。

补充图S3:代表性图像和流式细胞术分析。（A）用MAF处理5天的卡帕斯422和WSU-DLCL2细胞的C 12 FDG + EdU-Ki67 +衰老细胞（B）的代表性图像和流式细胞术分析，并染色为fsA-β-gal，EdU和Ki67。使用DMSO处理的细胞作为对照。缩写:C12FDG = 5-十二烷酰氨基荧光素-二-β-二羟甲基吡啶;EdU = 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷;DMSO = 二甲基亚砜;氨纶 = 马磷酰胺;DN = 柔红霉素;fSA-β-gal = 基于荧光的衰老相关β-半乳糖苷酶。请按此下载此档案。

作者没有利益冲突要披露。