基于同步成像和流式细胞术检测治疗诱导的衰老癌细胞中的多种荧光衰老标志物

摘要

在这里，我们提出了一种基于流式细胞术的方法，用于可视化和定量单个细胞中多种衰老相关标记物。

摘要

化疗药物可诱导癌细胞中不可修复的DNA损伤，导致细胞凋亡或过早衰老。与凋亡细胞死亡不同，衰老是抑制癌细胞繁殖的根本不同机制。几十年的科学研究揭示了衰老癌细胞在肿瘤和调节癌细胞和基质细胞的微环境中的复杂病理作用。新的证据表明，衰老是癌症治疗过程中的一个有效预后因素，因此快速准确地检测癌症样本中的衰老细胞至关重要。本文提出了一种可视化和检测癌细胞中治疗诱导的衰老（TIS）的方法。弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系用马磷酰胺（MAF）或柔红霉素（DN）处理，并检查衰老标志物，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal），DNA合成标志物5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）和DNA损伤标志物γ-H2AX（γH2AX）。流式细胞仪成像可以帮助在短时间内生成高分辨率的单细胞图像，以同时可视化和量化癌细胞中的三种标志物。

引言

多种刺激可引发细胞衰老，使细胞进入细胞周期停滞的稳定状态。这些刺激包括内在信号变化或外在应力。内在信号包括进行性端粒缩短、端粒结构改变、表观遗传修饰、蛋白稳态障碍、线粒体功能障碍和癌基因激活。外在应激包括炎症和/或组织损伤信号、辐射或化学治疗以及营养剥夺^{1，2，3，4}。在不同类型的衰老中，最常见和研究最充分的是复制性衰老、癌基因诱导的衰老 （OIS）、辐射诱导的衰老和治疗诱导的衰老 （TIS）。OIS是对异常癌基因激活产生的复制应激引起的遗传毒性损伤的急性细胞反应，并且可以在一定程度上阻止从肿瘤前病变到完全肿瘤的病理进展。当肿瘤细胞受到化疗药物或电离辐射^5，6的压力时，就会发生TIS。

衰老被认为是病理学中的双刃剑，因为它具有高度的动态性质。它最初被描述为一种有益的肿瘤抑制机制，从分裂细胞的循环池中去除受损细胞，保护器官的正常功能并抑制肿瘤生长^7，8，9。然而，新出现的证据表明衰老有黑暗的一面。衰老细胞分泌促炎细胞因子，称为衰老相关分泌表型（SASP），导致纤维化和器官功能障碍，并促进肿瘤的发生和进展¹⁰。此外，衰老的癌细胞与染色质重塑和持续DNA损伤反应（DDR）的激活同时进行表观遗传和基因表达重编程^11，12，新获得新的癌症干细胞特性³。虽然与衰老能力较弱的肿瘤相比，衰老功能的肿瘤对治疗干预的反应更好¹³，但如果衰老细胞不能被高效识别和消除，则衰老细胞的持续存在可能导致长期预后不良⁵。无论哪种方式，评估衰老的可靠方法都具有重要的临床意义，不仅对于治疗的预后，而且对于开发针对衰老细胞的新策略。

无论触发因素如何，衰老细胞都表现出一些共同的特征，包括增大、扁平、多核形态与大液泡、细胞核显著扩张、细胞核中形成富含H3K9me3的衰老相关异染色质（SAHF）、DNA损伤标记物γH2AX病灶的持续积累、活化的p53-p21^CIP1和Rb-p16^INK4a 细胞周期调节机制、稳定的 G1 细胞周期停滞、SASP 的大量诱导以及衰老相关的β半乳糖苷酶 （SA-β-gal） 活性升高¹⁴.由于没有单一标记物足以定义衰老，因此SA-β-gal活性的酶染色被认为是衰老检测的金标准，通常与H3K9me3和Ki67的免疫组化染色相结合以检测TIS¹⁵。然而，基于化学显色的SA-β-gal很难量化。在这里，我们将5-十二酰氨基荧光素-二-β-D-半乳糖基糖苷（C₁₂FDG）荧光基SA-β-gal（fSA-β-gal）检测与γH2AX和EdU掺入的DNA的免疫荧光染色相结合，使用先进的成像流式细胞仪系统鉴定C₁₂FDG ⁺ EdU-γH2AX ⁺衰老细胞，该系统将速度，灵敏度和详细的单细胞图像与流式细胞术和显微镜无法提供的空间信息相结合。该方法可以快速生成高分辨率图像，从而允许对细胞内的荧光信号进行定位和定量，同时通过构建标准管道获得对多个样品的快速分析的许可。

方案

1. DLBCL细胞系与马磷酰胺或柔红霉素治疗，诱导细胞衰老

注意:该协议也适用于贴壁癌细胞。根据细胞大小，将1-2×10⁵ 个细胞放入6孔板的一个孔中，并将板在5%CO₂，37°C培养箱中孵育过夜，然后在处理前。方案步骤与悬浮细胞相同，但有两个例外。首先，需要在步骤3.4之后将细胞从板上胰蛋白酶消化。其次，在胰蛋白酶消化之前无需离心即可执行洗涤步骤。

1. 计数DLBCL细胞并将1×10⁶ 个细胞/ mL接种在每孔4mL培养基中放入6孔培养板中。在补充有10%胎牛血清（FBS）和100 U / mL青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养DLBCL细胞。
2. 将MAF（5微克/毫升）或DN（20纳克/毫升）加入细胞培养物中，轻轻摇动板进行混合。
   注意:动态影像防抖动和 DN 不稳定。溶解在DMSO后，应等分试样储备溶液并储存在-20°C。 应避免冷冻/解冻循环。
3. 将板在5%CO₂，37°C培养箱中孵育3天。
4. 孵育3天后，将DLBCL细胞收集在15mL无菌离心管中，并在100× g，4°C下旋转5分钟。
5. 弃去上清液，用4mL新鲜培养基重悬细胞沉淀，并将悬浮液重新加入6孔板中。
6. 在收获之前，在5%CO₂，37°C培养箱中再培养2天进行细胞板以进行分析。

2. 制备染色溶液（表1）

3. 用不同的衰老标志物染色DLBCL细胞

注意:准备用单个标记物（即太平洋蓝EdU，C₁₂FDG或Alexa Fluor 647-γH2AX）染色的细胞样品以产生补偿基质以校正测量过程中的荧光溢出。尽管强烈建议这样做，但当不同荧光团之间的发射光谱存在可忽略的重叠（补偿系数值≤0.1）时，可以暂停此步骤。但是，用户在使用不同的仪器和荧光板时必须确定标准化的补偿步骤。

1. 将10mM EdU溶液以1:1，000的比例加入步骤1.6产生的DLBCL细胞培养物中（最终EdU浓度为10μM）。轻轻摇动板以混合并在5%CO₂，37°C培养箱中孵育3小时。
2. 将板从培养箱中取出，加入100 mM氯喹溶液至终浓度为75μM（参见讨论）。轻轻摇动板以混合并在5%CO₂，37°C培养箱中孵育30分钟。
3. 将板从培养箱中取出，以_1:1，000向最终的C₁₂FDG浓度为20μM加入20μM的20mM中加入20mM的20mM C₁₂ FDG溶液。
4. 将板从培养箱中取出，以1:50的比例加入100mM 2-苯乙基-β-D-硫代乳糖苷（PETG）溶液，以停止fsA-β-gal染色（最终PETG浓度为2mM）。轻轻旋转盘子进行混合。
5. 将细胞转移到15mL无菌离心管中，并在100× g，4°C下旋转5分钟。弃去上清液，用4mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。
6. 重复 PBS 清洗步骤。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于500μL4%多聚甲醛固定溶液中。
7. 在室温下孵育10分钟后，在250× g下离心，室温下离心5分钟。弃去上清液并用4 mL PBS洗涤细胞。
8. 重复 PBS 清洗步骤。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200μL皂苷透化缓冲液中，并将悬浮液转移到新的1.5mL管中。在室温下孵育10分钟后，在250× g下离心，室温下离心5分钟。
9. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于200μL一抗溶液（1:500 γH2AX抗体在抗体培养液中）中。在4°C下在黑暗中孵育过夜。
10. 将管在250× g，4°C下离心5分钟。弃去上清液，用100μL皂苷洗涤液洗涤。
11. 再重复洗涤步骤两次。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于500μLEdU检测混合物中。
12. 在室温下在黑暗中孵育30分钟。在250× g下离心，室温下离心5分钟。弃去上清液，用1 mL皂苷洗涤液洗涤。
13. 重复洗涤步骤两次。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于20-50μLPBS中。继续第 4 节进行样品测量。

4. 使用成像流式细胞仪系统对衰老标志物进行成像

1. 清空废液瓶。在打开仪器之前，请检查速度磁珠、灭菌器、清洁剂、消泡剂、护套和漂洗试剂（去离子水）的液位，以确保有足够的液体（参见 材料表）。
2. 打开仪器和成像软件（参见 图1A中的软件界面）。
3. 单击 "启动" 按钮以初始化流体和系统校准。
   注意:此过程大约需要 45 分钟。
4. 将 放大倍率 设置为 40x，将 流体速度 设置为 低，然后打开实验中所需的激光器。打开 405 nm、488 nm 和 642 nm 激光器，分别测量 EdU 太平洋蓝、C₁₂FDG 和 Alexa Fluor 647-γH2AX （或 Alexa Fluor 647-Ki67）。将 Ch6 设置为 散射通道， 将 Ch1 和 Ch9 设置为 明场。
5. 从预计具有最高荧光的样品开始，以设置激光的强度。轻轻翻转样品管进行混合。打开试管盖，然后将样品管插入底座。单击" 加载" 以开始。
6. 打开散点图并分别选择 X 轴和 Y 轴Area_M01和坡向Ratio_M01的特征。将栅极设置为高于 0.5 的纵横比，以排除下方和右侧的双晶和细胞聚集体，以及左侧的速度磁珠填充（图 1B）。
7. 打开直方图图，然后为 X 轴选择要素渐变RMS_M01_Ch01。选择单线态群体并设置要为聚焦细胞选择的门（图1C）。
   注:成像系统将自动使用速度珠来调整成像的焦点。但是，建议为重点最集中的人群选择直方图峰值的右半部分。
8. 打开直方图，为每个颜色通道（Ch2、7 和 11）的 X 轴选择"原始最大像素强度"。调整激光功率（即 Ch2、7 和 11 的激光器分别为 488 nm、405 nm 和 642 nm），使每个荧光染料的原始最大像素值介于 100 和 4，000 之间，以避免过饱和。
   注意:对于此实验，激光器488 nm、405 nm和642 nm的激光器功率设置分别为50 mW、200 mW和50 mW。
9. 选择要记录的聚焦群体，然后单击" 获取 "以使用一致的设置测量DLBCL样本。更换样品进行测量时，单击 "返回 "以回收样品管。按 "加载" 以 丢弃 样品。
10. 测量完所有样品后，关闭明场并散射激光。测量单色对照样品以生成补偿矩阵。
11. 单击 关机 以关闭映像系统。
12. 在图像分析软件中分析数据。
    1. 使用图像分析软件的 点向导 工具自动计数和量化活细胞图像中的核γH2AX病灶。选择两个细胞群（一个具有高点计数，另一个具有低点计数）以训练点向导以进行进一步的自动点计数分析。

结果

使用图像分析软件通过加载单色控制样品的记录数据来生成补偿矩阵。如 补充图S1所示，检测到从EdU到C 12 FDG的不可忽略（系数值≥_0.1）光溢出，串扰系数值为0.248，而其他通道之间的串扰不显着。用5μg/ mL MAF或20 ng / mL DN处理四种不同的DLBCL细胞系以诱导细胞衰老，并使用常规SA-β-gal染色或成像流式细胞术方法进行分析。

超过70%的KARPAS422，WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞进入衰老状态，表现为阳性SA-β-gal，而SU-DHL6对MAF和DN诱导衰老完全耐受（补充图S2A）。值得注意的是，MAF和DN也诱导所有DLBCL细胞中的细胞死亡，尽管不是显着的（补充图S2B）。使用成像流式细胞术方法，单细胞图像和基于流式细胞术的定量显示，KARPAS422，WSU-DLCL2和^OCI-LY1中的C₁₂FDG ⁺ EdU-γH2AX ^+<...

讨论

该方法通过明场成像和流式细胞术定量检查了化疗后四种不同DLBCL细胞系的衰老进入能力。在单细胞水平上，我们成功地在经过处理的KARPAS422和^WSU-DLCL2细胞中检测到主要的C₁₂FDG ⁺ EdU-Ki67 ⁺衰老群体，并且在较小程度上在OCI-LY1细胞中检测到，而SU-DHL6细胞系对治疗具有抗性。细胞系之间衰老进入能力的差异可以通过其独特的基因组缺陷^{来解释16，17}。然而，不适当的细胞培养密度或药物浓度也可能影响衰老诱导性。应仔细选择细胞密度和药物浓度的连续稀释度，以进行更全面的检查。值得注意的是，该方法足够灵敏，可以在没有额外遗传毒性刺激的情况下准确检测DLBCL细胞中自然发生的衰老群体（图3中C₁₂FDG ^{+ EdU-Ki67 +} DMSO处理的组）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 647 抗 H2A.X 磷酸化 （Ser139） 抗体	Biolegend	613407
抗 Ki-67 小鼠单克隆抗体 （Alexa Fluor 647）	Biolegend	350509
C12FDG（5-十二烷基氨基荧光素二-β;-D-吡喃半乳糖苷）	Fisher Scientific	11590276
氯喹-二磷酸盐	Sigma aldrich	C6628
清洁剂（Coulter Clenz）	贝克曼库尔特	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue流式细胞术检测试剂盒	Thermo Scientific	C10418
红霉素	Medchemexpress	HY-13062A
消泡剂（70%异丙醇）	Millipore	1.3704
图像分析软件（Amnis 创意 6.3）	Luminex	CN-SW69-12
仪器及成像软件 （Amnis ImageStreamX Mk II 成像流式细胞仪系统和 INSPIRE 软件）	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide 环己胺	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
多聚甲醛	Fisher Scientific	11473704
PETG（2-苯乙基-β;-D-硫代半乳糖苷）	Sigma aldrich	P4902
皂苷	Sigma aldrich	47036
护套	Millipore	BSS-1006-B
用于 ImageStream	Luminex	400041
灭菌器的 SpeedBead 套件（0.4-0.7% 次氯酸盐）	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	帝斯曼	ACC 575