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利用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝脏硬度

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DOI：

10.3791/63974

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2022年7月20日

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1Laboratory of Integrative Biology, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2CEITEC MU, Masaryk University, 3Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 4Laboratory of Biomathematics, Czech-BioImaging IPHYS, Institute of Physiology of the Czech Academy of Sciences

本文内容

摘要

我们介绍一种利用原子力显微镜测量正常和病变肝脏中富含胶原区域弹性模量的实验方案。同时使用偏振显微镜可对肝组织切片中富含胶原的区域进行高空间精度的定位。

摘要

基质硬化已被认为是肝纤维化进展的关键驱动因素之一。它对细胞行为的各个方面具有深远影响，例如细胞功能、分化和运动能力。然而，由于这些过程在整个器官中并非均匀分布，因此越来越需要在细胞水平上理解组织力学性质的变化。

为了能够监测肝小叶内富含胶原区域的硬化过程，本文提出了一种利用原子力显微镜（AFM）高空间精度测定肝组织弹性模量的实验方案。原子力显微镜是一种灵敏的方法，可用于表征局部力学特性，该特性以杨氏模量（也称为弹性模量）进行计算。将原子力显微镜与偏振显微镜相结合，可根据组织中胶原纤维的双折射特性，精确定位纤维化发生的区域。利用本方案，我们对纤维化小鼠肝脏中富含胶原的区域以及对照组小鼠肝脏相应区域的刚度进行了表征。

随着纤维化的进展，胶原蛋白阳性区域的硬度显著增加。本方案通过使用轻度固定的肝组织，提供了一种高度可重复的原子力显微镜（AFM）测量方法，可用于进一步理解疾病引发的局部组织力学性质变化及其对邻近细胞命运的影响。

引言

肝脏是维持生物体稳态的重要器官1,2。慢性肝病每年在全球范围内导致约200万人死亡3。其病因最常见为病毒感染、自身免疫性疾病、代谢综合征或与酒精滥用相关的疾病，并常伴随进行性肝纤维化。肝损伤会引发炎症反应，从而激活细胞在伤口愈合过程中沉积细胞外基质（ECM）。然而，在慢性损伤持续存在的情况下，过量的ECM会在肝脏内形成无法消退的瘢痕组织，进而导致肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌，最终发展为肝功能衰竭4。

肝细胞损伤会立即导致肝脏硬度增加5,6。这会直接影响肝细胞功能，激活肝星状细胞（HSCs）和门管区成纤维细胞，并促使它们转分化为沉积胶原的肌成纤维细胞7,8。纤维细胞外基质（ECM）的沉积进一步增加肝脏硬度，形成肝脏硬化与基质生成细胞激活之间的自我放大反馈环路。

因此，肝脏硬度已成为肝病预后的重要参数。生物力学组织特性的改变可在组织病理学分析诊断出纤维化之前被更早地检测到。因此，针对肝脏硬度的测量技术已在科研和临床应用中得到广泛发展。在临床环境中，瞬时弹性成像（TE）9,10,11,12,13 和磁共振弹性成像（MRE）14,15,16,17,18 已被用于通过检测整体肝脏硬度来无创性地诊断肝脏损伤的早期阶段19。

在瞬时弹性成像（TE）中，低振幅、低频（50 Hz）的超声波穿过肝脏，测量其传播速度，并据此计算组织的弹性模量13。然而，由于超声波在肝脏周围组织中的传播受到干扰，该技术不适用于腹水、肥胖或肋间隙较窄的患者9。

磁共振弹性成像（MRE）基于磁共振成像技术，利用20-200 Hz的机械剪切波作用于肝脏。随后采用特定的磁共振成像序列追踪组织内部的剪切波传播，并据此计算组织的硬度16。瞬时弹性成像（TE）和MRE技术所报告的硬度值均与通过肝活检获取的人肝组织样本经组织学METAVIR评分系统分级所得的肝纤维化程度具有良好相关性20（表1）。TE和MRE也已被应用于啮齿类动物模型，用于科研目的的肝脏硬度测量21,22,23。然而，由于这两种方法均通过组织对传播剪切波的响应来推导硬度值，所得数值可能并不能完全反映组织的绝对力学硬度。

为了直接对啮齿类动物肝脏进行力学表征，Barnes 等人开发了一种模型-凝胶-组织检测法（MGT 检测法），该方法将肝组织包埋在聚丙烯酰胺凝胶中24。该凝胶受到脉冲式均匀力的压缩，由此可计算出杨氏模量。MGT 检测法与一种适用于正常和纤维化肝脏的压痕检测法显示出良好的相关性24（表 1）。

表1：整体水平的肝脏硬度值。 TE与MRE相较于直接法 离体 使用压痕法和MGT检测对不同来源肝脏的弹性模量进行力学测量。E与G之间的关系由以下公式给出 E = 2G (1 + v），其中 v 是样品的泊松比；F0至F4代表METAVIR评分系统中的纤维化评分，其中F0表示无或轻度纤维化，F4表示肝硬化肝脏。缩写：TE = 瞬时弹性成像；MRE = 磁共振弹性成像；MGT = 模型-凝胶-组织；E = 弹性（杨氏）模量；G = 剪切模量。 请点击此处下载此表格。

通用肝脏硬度测量的主要缺点之一是无法提供肝脏内硬度异质性的细胞级分辨率。在纤维化进展过程中，富含胶原的区域相较于周围的实质组织表现出更高的刚性25,26。这种局部硬度梯度会影响定居的细胞，并在驱动肝星状细胞异质性方面发挥重要作用27。因此，为了更好地理解纤维化的进展，需要在显微水平上表征肝脏疾病发展过程中局部力学性质的变化。

原子力显微镜（AFM）能够以高分辨率和高力灵敏度测量组织的力学特性。AFM利用悬臂的针尖对样品表面进行压痕，施加的力可低至数皮牛顿，根据所用针尖的几何形状和尺寸，在微观或纳米尺度上诱导样品产生形变。样品对施加应变的力响应则通过测量悬臂的偏转来获得28。通过记录悬臂接近和回撤过程中的力-位移曲线，并结合适当的接触力学模型进行拟合，可评估样品局部的刚度29。

除了测量特定区域的硬度外，原子力显微镜（AFM）还能提供样品中特定结构的形貌信息，例如胶原纤维的结构。30,31,32已有多个研究描述了利用原子力显微镜（AFM）测量多种健康与病变组织（如皮肤）硬度的应用。32,33，肺34,35, 大脑36，乳腺37,38,39软骨40，或心脏41,42,43,44 来自患者和小鼠模型样本。此外，原子力显微镜（AFM）也已被用于 体外 用于测定细胞和细胞外蛋白质支架的刚度45,46,47.

由于生物样品具有柔软性和易碎性，利用原子力显微镜（AFM）测量其力学性质并非易事。因此，已有多种研究对不同的实验条件和设置进行了标准化，但所得的杨氏模量值仍存在显著差异（Mckee 等人综述48）。与其他软组织类似，不同肝纤维化等级下的肝脏杨氏模量值也表现出广泛的变化（表2）。杨氏模量数值的差异源于AFM操作模式、探针针尖、样品制备方法、样品厚度、压痕深度和施加力、测量过程中肝脏组织的环境条件以及数据分析方法的不同（表2）。

表2：细胞水平的肝脏硬度值。 使用原子力显微镜（AFM）获得的肝脏硬度值用于描述肝脏在细胞水平的机械特性。缩写：AFM = 原子力显微镜；E = 弹性（杨氏）模量；PFA = 多聚甲醛；PBS = 磷酸盐缓冲盐水。请点击此处下载该表格。

本文介绍了一种通过原子力显微镜（AFM）对肝脏组织中富含胶原的纤维化区域进行杨氏模量可重复测量的方案，结合偏振显微镜实现精确定位。我们采用四氯化碳（CCl4）在小鼠模型中诱导胶原蛋白在肝小叶中央区沉积49，可靠地模拟了人类肝纤维化的关键特征50。偏振显微图像能够利用胶原纤维的双折射特性显示肝脏中的胶原分布51，从而实现对肝小叶内目标区域的精确探针定位52。

方案

所有动物实验均依照分子遗传学研究所动物护理委员会批准的动物实验方案，并根据欧盟动物实验指令 2010/63/EU 进行。本方案的整体示意图见图1。

肝脏切片显微方法：悬臂梁装置、偏振、刚度图分析、力曲线。
图 1：从小鼠肝脏评估杨氏模量的原子力显微镜（AFM）整体示意图。（A）从小鼠（对照组或处理组）分离肝脏，随后进行切片并保存于 −80 °C（最长保存时间：2 周）。（B）将球形微珠粘附至悬臂梁，并在室温下过夜固化胶水（左图）；随后进行悬臂梁校准及样品安装（右图）。（C）对准偏振器与检偏器以清晰显示胶原纤维结构，然后将相机图像与原子力显微镜悬臂梁下方的测量区域进行叠加。（D）刚度图的采集与分析。缩略语：AFM = 原子力显微镜；PBS = 磷酸盐缓冲液；OCT = 最佳切割温度包埋剂；CCl4 = 四氯化碳。请点击此处查看该图的高清版本。

1. 样品制备 I

  1. 在麻醉下通过颈椎脱位处死小鼠后，从打开的腹腔中切除肝脏。分离左侧叶，并将肝叶的外侧一半通过在干冰上快速冷冻嵌入最佳切割温度（OCT）包埋剂中。将OCT包埋的组织在−80 °C下保存。
    注意：先前的研究表明，冷冻组织与新鲜组织的硬度值相似25,26。
  2. 使用冷冻切片机将30 µm厚的肝组织切片置于带正电荷的载玻片上，并将载玻片在−80 °C下保存，直至原子力显微镜（AFM）测量当天，保存时间不超过2周。

2. 仪器设置

  1. 将5.7 µm微珠固定至原子力显微镜（AFM）悬臂针尖（补充图S1，步骤1-5）
    注：微珠与悬臂的固定方法此前已由Norman等人46描述。
    1. 将直径为5.7 µm的三聚氰胺树脂微珠悬浮液均匀涂布于载玻片一半的区域，并在空气中干燥以蒸发溶剂（补充图S1，步骤1）。
    2. 在载玻片的另一半区域，使用10 µL移液枪头，涂布一条预混的、工作时间较长的环氧树脂细线（补充图S1，步骤1）。
    3. 根据制造商说明书，将悬臂探针装载至AFM探头。
    4. 将载玻片安装到位，并用装有悬臂探针的AFM探头覆盖。
      注：本研究中使用了SD-qp-BioT-TL-10型悬臂。
    5. 将预混环氧树脂胶移至载玻片中央，以较低作用力接近胶体（设定设定点为1 V以遵循本方案；补充图S1，步骤2）。
      注：在接近载玻片表面之前，需确保激光束对准悬臂针尖中心，这可通过监测总和电压是否较高来判断，具体操作参见第2节第3部分“AFM悬臂弹簧常数校准”中的步骤6-8。
    6. 当悬臂探针尖端接触胶体后，将其略微抬高至载玻片上方，以去除多余胶体。
    7. 随后，将悬臂针尖从载玻片收回，并移动载玻片使单个微珠位于中心位置（补充图S1，步骤3）。再次以较高作用力（设定点2 V）用AFM悬臂探针接近微珠，将微珠固定在悬臂探针中心，并保持至少10秒（补充图S1，步骤4）。
    8. 取出悬臂探针，并在室温下静置过夜以使胶体固化，或按照环氧树脂的说明书进行操作（补充图S1，步骤5）。
  2. 设置偏振器与检偏器
    1. 为定位肝组织切片中的感兴趣区域，需在显微镜上安装偏振器与检偏器。通过手动或自动方式旋转其中任一元件，使其振动方位角相对于另一元件处于0°至90°之间，以最小化透射光并最大化通过物镜的异常光线。确保在偏振图像中胶原纤维在暗背景上呈现明亮（图2），这可通过图像直方图峰值向亮像素偏移来反映。

显微图像、CV和PV分析，放大细节突出显示细胞结构比较。
图2：代表性显微图像显示，在偏振光显微镜下胶原纤维的可视化程度明显高于明场图像。 经CCl4处理3周的小鼠肝脏切片分别进行（A）明场和（B）偏振光显微观察。在偏振光图像中，双折射性胶原纤维呈白色，清晰可见，而明场图像中则不明显。红色框标示用于原子力显微镜（AFM）测量的富含胶原的区域。插图为红色框内区域的放大视图。比例尺 = 100 µm。缩略语：AFM = atomic force microscopy；CCl4 = carbon tetrachloride；CV = 中央静脉；PV = 门静脉。 请点击此处查看该图的高清版本。

注意：本方案中，原子力显微镜（AFM）探头可安装在任何合适的倒置显微镜上，且该显微镜需具备插入起偏器和检偏器的可能性。系统必须置于隔振装置中，以降低背景噪声。

  1. 校准原子力显微镜（AFM）悬臂的弹簧常数
    1. 根据制造商说明，将悬臂探针（按照第2节第1部分“将5.7 μm微球连接至AFM悬臂尖端”的步骤1-8制备）安装至AFM探头。
    2. 使用70%乙醇清洁悬臂，以防止测量过程中悬臂污染。用去离子水充分冲洗，以去除尖端残留的乙醇。
    3. 启用接触模式，并在软件中选择力图扫描作为测量方法。
    4. 通过点击相应按钮，在软件标签页中打开所有相关窗口（Z轴步进电机、电动载物台控制、数据查看器、力扫描图示波器、激光对准以及摄像头窗口）。
    5. 将一块洁净的载玻片置于用疏水标记笔划定的约2 cm × 4 cm区域内，加入1.2 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。将AFM探头安装在显微镜载物台上，并确保悬臂完全浸入PBS中。
    6. 将物镜聚焦于悬臂尖端。降低显微镜透射光强度，以便在显示器上更清晰地观察激光位置。
    7. 将激光对准悬臂的透明末端（微球附着于其下方），并通过调节AFM探头上的旋钮来调整反射镜，使探测器上的激光总强度最大化（由激光对准窗口中的总和值表示）。
    8. 使用AFM探头上的旋钮调节光电二极管探测器，使激光位于其中心位置。
    9. 在进行校准前，让悬臂稳定15分钟。
    10. 打开校准管理器，输入悬臂类型、悬臂尺寸和环境条件。点击校准以校准弹簧常数和灵敏度（也称为逆光学杠杆灵敏度，InvOLS）。将校准后获得的弹簧常数值与制造商声明值进行比对，确认其准确性。在非接触模式下校准悬臂（校准由软件基于Sader等人58提出的热力学定理自动完成）。
      注：悬臂的弹簧常数表示其刚度，定义为悬臂每单位形变长度所受的恢复力，单位为N/m。悬臂的灵敏度表示其偏转（单位：纳米）引起光电二极管响应的变化值（单位：伏特），通常以nm/V表示59。在非接触模式下，AFM控制软件在校准后会自动记录并拟合热噪声谱与流体动力学函数60。该拟合提供校准参数，即弹簧常数和InvOLS。本研究中所用SD-qp-BioT-TL-10悬臂的弹簧常数为制造商声明的0.09 N/m。

3. 样品制备 II

  1. 将冷冻切片（如第1节“样品制备I”所述，于−80 °C保存）在室温下解冻2分钟。
  2. 用预冷的含4%多聚甲醛（PFA）的1x PBS在4 °C固定切片10分钟，随后用1x PBS充分洗涤（5次）。用纸巾擦去切片周围的残留PBS，并用疏水性标记笔在肝组织切片周围标记出约2 cm × 4 cm的边界区域。向样本上加入1x PBS，覆盖整个组织区域（确保划定区域内含有约1.2 mL的1x PBS）。随后即可用于原子力显微镜（AFM）检测。
    注意：由于PFA为有害化学品，操作时必须小心，避免接触皮肤或眼睛。为避免其有毒气体挥发，所有涉及PFA的操作均须在经认证的化学通风橱或其他经批准的通风区域中进行。

4. 测量

  1. 通过前往启用自动保存功能 设置 标签并打勾 自动保存. 通过前往指定测量文件的保存路径及文件名 设置 标签，然后单击 保存设置.
  2. 加载样品（按照第3节样品制备II中的方法制备）。开启设备，使AFM悬臂逐渐接近组织表面 激光 并点击 方法 关键。当探针尖端接触组织表面后，回缩悬臂探针，使尖端保持在物镜的焦点范围内（通过点击 撤稿 键（该键使悬臂收回至压电陶瓷扫描仪行程的顶端）。若激光光斑偏离探测器中心位置，则需重新调整探测器对准。 激光准直 窗口
  3. 关闭 激光 并点击以将显微镜的光学视野与原子力显微镜测量图谱叠加 配件 标签，然后选择 直接覆盖光学校准在随后的窗口中，单击 下一步 对悬臂在特定区域进行扫描，连续拍摄一系列图像。点击 下一步 再次点击以进入下一个窗口。
  4. 在第一张图像中，手动单击悬臂末端的中心，以在软件中标示针尖位置。用于标示针尖位置的圆圈可通过指定其大小进行调整 半径 以提高准确性。单击 校准 自动检测所有图像中悬臂探针尖端的位置。通过浏览图像确认探针尖端检测的准确性。
  5. 点击 下一步 然后 完成 完成光学叠加，并保存光学校准期间捕获的图像序列。
  6. 收回 将悬臂进一步抬起，以避免其与载玻片上较高表面发生碰撞。移动载物台，使胶原蛋白丰富的区域位于视野中可见的绿色框内。 数据查看器 使用偏振图像标签。在指定的绿色框内，通过按住鼠标左键并拖动以绘制矩形，选中富含胶原的区域。在下方定义所选区域的尺寸、方向和分辨率 网格 左侧的标签。点击 确认新的扫描区域 将选定区域设置为测量区域。
  7. 保持 IGain 和 PGain-反馈回路的参数-保持默认值，除非系统出现显著的不稳定性，例如过度敏感。按照本方案，设置 IGain 在 50 Hz 和 PGain 在 0.001.
  8. 设置 设定点 在 1 nN.
    注意： 设定点 是静止状态下针尖与表面相互作用的力。对于大多数软样品（细胞、凝胶和组织）， 设定点 范围内的值 0.5-2.0 nN 是合适的。
  9. 选择 相对设定值 根据所研究材料的力学性能和悬臂的刚度。对于本方案，将该值设定为 5 nN.
    注意：相对设定点表示相互作用的最大作用力，即当力-距离曲线达到峰值且探针移动返回基线时的状态。对于软性材料（1–50 kPa），该参数以纳牛顿（nN）为单位设置。此外，对于软悬臂梁（弹簧常数为 0.05 N/m 至 0.35 N/m），可施加的最大作用力约为 50 nN。调节 设定值 和 相对设定值 相应地。
    1. 确保设定的给定值不会导致压痕深度超过球形压头的半径，否则在计算杨氏模量时无法正确定义压痕表面。在完成首次压痕实验后，计算压痕深度的平均值；参见第5节“数据分析”，了解如何处理记录的数据。调整 设定值 如有需要。
  10. 设置 调整基线 作为 5.
    注意：此处的 基线 指用于拟合逼近和回退曲线的多项式阶数。将基线设为5可使曲线拟合达到较高分辨率，从而确保在测量过程中捕捉到背景噪声。
  11. 选择悬臂在 Z 轴方向上的移动长度（Z轴长度）根据样品的表面形貌。按照本方案操作时，设置 Z轴长度 在 15 µm.
    注意：高值（例如 15 μm会降低测量灵敏度，但对于表面高度不规则的样品（如纤维化肝组织）通常必需。
  12. 设置 Z轴移动 至 恒定持续时间.
    注意： Z轴移动 也可以设置为 恒定速度 查看与……相关的数据 Z轴移动 (延伸速度 和 延长时间）以不同的模式。
  13. 设置 延长时间 至 1 s设置 延伸延迟 和 撤回延迟 作为 0.
    注意：使用延长速度 >5.0 µm/s 对于非常柔软的材料61，因为较低的压痕速度会使软表面产生更高的黏性且更低的弹性响应。 延伸延迟 和 撤回延迟 可用于研究悬臂梁尖端与基底之间特异性相互作用的参数（例如，固定在悬臂梁表面的蛋白质与固定在载玻片表面的蛋白质之间的相互作用）。
  14. 设置 采样率 作为 5000 Hz.
    注意：采样率指在完整的逼近- retract 曲线中记录数据点的频率。应将其设置为较高值（例如 5000 Hz以避免因曲线过渡极快而遗漏某些区域。
  15. 标记 Z 闭环 与一个 蜱虫 以实现反馈回路系统，确保样品表面与悬臂探针尖端之间的距离恒定。
  16. 取消选中以解除电动载物台的锁定 启动 并点击 方法 将悬臂靠近样品。单击 开始扫描 开始在步骤6中设定的区域采集力-距离曲线；第4节，测量。

5. 数据分析

  1. 使用开源软件“AtomicJ”（可从 https://sourceforge.net/projects/jrobust/ 下载）分析所获取的数据。 
    注：支持从 Agilent Technologies、JPK Instruments 或 Bruker 原子力显微镜采集的文件。
  2. 通过点击加载力曲线到程序中 处理力曲线和力图谱 AtomicJ 中的图标补充图 S2A，x）。在 处理助手，通过点击要分析的地图将其添加 添加 按钮（补充图 S2A，y）。单击 下一步 地图加载完成后（补充图 S2A，z）。
  3. 在下一个窗口中，根据下述步骤（对应于以下步骤）指定处理设置 补充图 S2B，步骤1-11）：
    1. 通过计算手动估算样品与悬臂之间的接触点，或使用一组拟合曲线参数自动估算。遵循本方案，请使用 自动的 接触点的估算
    2. 确定 接触点 悬臂与样品之间的 经典聚焦网格法.
    3. 选择 估计方法 根据测得力曲线的质量来获得接触点的最佳判定，这需要在数据处理优化过程中通过实验经验确定。遵循本方案时，使用 模型无关方法.
    4. 使用以下方法拟合力-压痕曲线： 经典方法 模型（使用 经典L2 用于 模型拟合 遵循本方案。
      注意： 模型拟合 和 接触估计器 是分别控制软件如何拟合曲线以及如何确定拟合曲线上接触点的参数。对于这些测量， 经典方法 采用该选项时，使用最小二乘回归法。该方法将力-压痕曲线中每个低力点作为候选接触点进行处理，并对候选接触点之前的区域拟合多项式，随后对采集的力-压痕数据拟合相应的接触模型。其中，残差平方和最小的点被确定为接触点。根据所获力曲线的质量，也可选用其他方法62,63.
    5. 设置 合适 模型对 移除 曲线
    6. 设置 泊松比 作为 0.45，适用于肝脏等软组织的推荐方法24.
    7. 使用以下方式设置曲线的拟合 基线程度 的 3 以及一个 接触度 的 1根据曲线与模型偏差的程度调整多项式拟合的阶数。
    8. 选择用于拟合撤回曲线的模型。使用 Sneddon 模型，该模型根据公式（1）和公式（2):
      弹性力学方程公式，描述应力-应变关系，是材料科学分析中的关键内容。   (1)
      δ = 对数方程，\( \frac{a}{2} \ln\left(\frac{R+a}{R-a}\right) \)；数学公式    (2)
      其中 F 是力， E 是杨氏模量， v 是样品的泊松比，δ 为压痕深度， a 是接触半径，且 R 为球体半径62,63.
    9. 填写 半径 微米为单位的球形尖端尺寸（2.9 µm 在此方案中）。
    10. 加载 弹簧常数 和 InvOLS 通过启用数据文件中的功能 读入 （勾选相应的方框）。
    11. 点击 完成.
      注意：分析后的数据以偏转角、高度、黏附力、接触力、形变、黏附力和 R 的分布图形式呈现2 值、斜率、杨氏模量、转变压痕、转变力以及为每条力曲线计算的接触位置（补充图 S3，左上角）。另外两个窗口显示力曲线和原始数值（补充图 S3，分别对应右上和下方面板。
  4. 排除悬臂梁未正确接近肝组织切片表面的力曲线。识别这些曲线的方法是：查看是否存在高噪声、异常形状和/或不完整的接近过程，如图中所示。 图3 并在其他地方进行了详细讨论46.

原子力显微镜力-距离曲线，刚度分析；弹性模量（10.5，1.78 kPa）；接近相与撤回相。
图3代表性力-位移曲线示例。 (A,B) 代表性的可解释力曲线（针对较硬样品（A；E = 10.5 kPa）和更软（B；E = 1.78 kPa）的区域，适用于分析。C-F) 由于以下原因需从分析中排除的代表性不可解读图表：(C-E）错误的方法或（F）噪声更高。如（中提供的图例所示A），红色曲线表示悬臂梁的接近过程，绿色曲线表示悬臂梁的回撤过程。黑色线条表示悬臂梁回撤曲线的拟合结果，其斜率对应于杨氏模量。红色和蓝色点分别对应接触点和转变点。接触点是悬臂梁在回撤过程中与基底保持接触的最后一个点，而转变点描述悬臂梁从接近阶段转为回撤阶段的转换位置。 请点击此处以查看此图的放大版本。

结果

采用本方案所述的原子力显微镜（AFM）技术，对来自对照小鼠以及轻度或重度纤维化小鼠的轻度固定的30 µm厚肝脏切片进行检测（纤维化模型分别通过注射CCl4持续3周或6周诱导49）。选择靠近中央静脉的胶原纤维区域进行刚度图谱的测量。在对照组肝脏中，分析了靠近中央静脉的区域，该区域对应于CCl4处理动物中通常形成胶原纤维的部位（图4A）。不同对照组肝脏之间以及单个肝脏切片内胶原富集区域的杨氏模量分布具有一致性和可重复性（图4B：左侧小提琴图）。

在 CCl4 处理的动物中，对应胶原沉积门脉周围区域的刚度图显示，其杨氏模量值显著高于对照组小鼠的相应区域（图 4B：对照组与 CCl4 处理 3 周小鼠的杨氏模量中位数分别为 1.9 kPa 与 2.6 kPa，p = 0.07；对照组与 CCl4 处理 6 周小鼠的杨氏模量中位数分别为 1.9 kPa 与 5.1 kPa，p = 0.02）。此外，随着 CCl4 处理时间的延长，杨氏模量值显著升高（图 4B；CCl4 处理 3 周与 6 周小鼠的杨氏模量中位数分别为 2.6 kPa 与 5.1 kPa，p = 0.04）。这表明随着纤维化进程的推进，胶原沉积区域逐渐变硬，且原子力显微镜（AFM）测量结果能够反映纤维生成过程。

为了评估OCT包埋的肝组织切片长期储存对胶原纤维力学性质的影响，我们检测了经CCl4处理的小鼠肝组织切片中胶原纤维的刚度，这些切片在切割后分别在−80 °C下储存了2周或3个月（图5）。原子力显微镜（AFM）测量结果显示，储存3个月的切片在胶原纤维富集区域的杨氏模量显著低于切片制备后2周内测量的切片（图5；2周与3个月储存时间的杨氏模量中位数分别为4.7 kPa与3.6 kPa；p < 0.001）。因此，在OCT包埋的肝叶制备成切片后，应尽快测量其肝组织力学性质。

杨氏模量分析、直方图和小提琴图显示了经 CCl4 处理后的刚度变化。
图4：原子力显微镜测量显示富含胶原的区域逐渐硬化，与长期 CCl 处理相关4 治疗 (A对照小鼠及经 CCl₄ 处理小鼠的肝脏切片4 用于测量富含胶原区域机械性能的样本为培养3周或6周的组织。偏振显微镜图像（左）中肝组织切片的框选区域为富含胶原的扫描区域（或对照组肝脏中的相应区域），用于后续原子力显微镜（AFM）测量30 µm x 100 µm，10 像素 × 36 像素）。右侧显示了与这些框选区域对应的带有颜色标尺的杨氏模量图，以及来自这些图的杨氏模量值的直方图；插图中的散点图展示了数值分布 >每种条件下为 10 kPa。肝脏硬化表现为直方图分布逐渐向右偏移，以及插图散点图中数据点频率更高。比例尺 = 20 µm. (B小提琴图显示了每种条件下三个区域测得的弹性模量分布（左）以及所有三张图的汇总弹性模量值（右）。小提琴图展示了中位数（红线）、25th 百分位数和第75百分位数（黑线）；圆点代表来自1-3区各个地图的平均值。所展示的p值采用Student's t检验计算得出 t- 对均值进行的检验。缩写：AFM = 原子力显微镜；CCl4 = 四氯化碳 请点击此处以查看此图的放大版本。

2 周与 3 个月储存后杨氏模量变化的显微镜图像及直方图
图5：肝脏切片的长期储存会导致富含胶原区域的刚度下降。 经CCl₄处理的小鼠肝脏切片4 2 周）贮存于 −80 °C 用于测量杨氏模量的样本培养时间为2周或3个月。偏振显微镜图像（左）中框出的部分表示用于原子力显微镜（AFM）测量的富含胶原的区域30 µm x 100 µm，10 像素 × 36 像素）。对应的杨氏模量图谱附颜色标尺（右侧）。直方图显示从每个样本的 4–6 个区域采集的杨氏模量值；插图中的散点图显示具体数值 >每种条件下为 10 kPa。比例尺 = 20 µm缩写：AFM = 原子力显微镜；CCl4 = 四氯化碳 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图 S1：使用三聚氰胺树脂微珠修饰悬臂梁的方法。（A）示意图展示了将球形微珠连接至悬臂梁尖端的过程。分步操作说明详见第2节第1部分“将5.7 µm微珠连接至原子力显微镜（AFM）悬臂梁尖端”。（B）从顶部（左）和侧方（右）观察连接在悬臂梁尖端的5.7 µm球形微珠的显微图像。比例尺 = 20 µm。缩写：AFM = atomic force microscopy（原子力显微镜）；RT = room temperature（室温）。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：AtomicJ 中的数据分析。（A）在 AtomicJ 中打开刚度图的步骤顺序。单击处理力曲线和图谱（x）可打开处理助手。通过单击添加（y）并选择所需文件，可将文件加载至处理助手中。单击下一步（z）进入下一步。（B）用于曲线拟合的参数、适用的接触力学模型以及测量过程中使用的原子力显微镜（AFM）设置。步骤 1–11 对应方案第 3 部分第 5 节“数据分析”中的相应子步骤。请点击此处下载该文件。

补充图 S3：AtomicJ 中分析数据的概览。 分析数据的预览显示了刚度图（左上窗口）、力曲线（右上窗口）和原始数据（下窗口）。缩写：AFM = 原子力显微镜。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案提供了一种可重复的原子力显微镜（AFM）测量正常及纤维化小鼠肝组织的逐步操作方法。结合偏振显微镜技术，可实现高空间精度，并利用胶原纤维的双折射特性对其进行可视化观察。此外，本文还详细描述了所获得力曲线的分析方法。AFM刚度测量可在细胞水平上进行，从而能够监测因纤维化疾病发展所导致的肝组织力学性质的局部变化。肝纤维化并非均匀影响整个器官的均一过程；相反，富含胶原的纤维间隔区域与胶原沉积较少或无胶原沉积的区域相互交错分布。因此，刚度变化具有局部微环境特异性，仅影响与损伤区域直接接触的邻近细胞。这种刚度异质性的微尺度特征在AFM杨氏模量图中也清晰可见，表现为高刚度点与接近正常刚度区域相邻。这种差异表明，即使在胶原瘢痕组织区域内，其力学性质也并非均一，因而需要在细胞水平上通过AFM进行精确表征（图4）。

本方案允许在肝脏样本采集后独立进行原子力显微镜（AFM）肝脏硬度测量，因为包埋于OCT中的完整肝叶可在−80 °C长期保存。然而，一旦组织被切片，建议在约2周内完成样品测量，因为我们观察到组织切片在更长时间储存后会逐渐软化（图5）。

配备偏振显微镜的原子力显微镜（AFM）可精确定位肝小叶结构中的感兴趣区域。然而，在解读结果时也需考虑其存在的一些局限性。本研究中获得的刚度值是在室温下测量的。我们假设温度对软组织力学性能的影响较小；但这一因素可能是导致本研究中肝脏组织力学性能数值与已报道的体内数值之间存在差异的原因之一。

此外，本方案允许对肝脏组织进行长达3小时的原子力显微镜（AFM）分析，该过程需要对组织进行温和固定。组织切片的温和固定以及冻融循环很可能会对杨氏模量的绝对值产生影响。因此，所报道的杨氏模量数值可能与 体内 数值。需要进一步研究以优化从肝组织切片测量杨氏模量绝对值的实验方案，这可能通过采用不同的肝组织固定方法来实现。64.

然而，我们观察到经四氯化碳（CCl4）处理3周的小鼠肝脏中富含胶原的区域，其刚度较处理6周的小鼠更高。此类变化与长期损伤过程中纤维化的进展相对应（图4），并表明利用本方案可探测不同处理之间的相对差异。这一结果与Calò等人的观察一致. ，他们发现轻度固定的肝组织切片中，富含胶原与缺乏胶原区域之间的刚度值差异与新鲜组织中的表现相似25。

我们使用了经直径为5.7 µm球形探针修饰的SD-qp-BioT-TL-10 悬臂梁（理论弹性系数约为0.09 N/m），以尽量减少测量过程中对肝组织的机械损伤。5.7 µm的微珠可实现对样品足够的压痕深度以探测其刚度，同时保持样品的完整性。经过多次优化后，也可使用更小直径的微珠，以获得更高分辨率的刚度图谱，但这可能导致杨氏模量值的进一步高估（更多细节参见Crichton等人的研究65）。使用指定的悬臂梁-微珠组合，我们能够对样品刚度进行宽范围表征，范围从数十Pa到约100 kPa。

采用Sneddon模型从力-距离曲线中推导杨氏模量，因为该模型可用于分析使用胶体探针产生的较深压痕62。与赫兹（Hertz）模型不同，Sneddon模型不受接触半径必须远小于球体半径这一条件的限制。该模型进一步假设样品厚度远大于压痕深度30,66。在本研究中，胶原蛋白富集区域的压痕深度约为2 µm，微珠直径为5.7 µm，样品厚度为30 µm；因此，采用Sneddon模型是合适的。对于其他类型的组织，可使用考虑探针与基底间黏附力的其他模型63。

AtomicJ 中的分析通过实施对样品有限厚度的校正，以在推导杨氏模量时尽量减少基底的贡献62,67。在分析所获得的力曲线时，我们采用了一个0.45的单一泊松比，该值此前已被推荐用于软组织器官24。这种近似对计算得到的杨氏模量值影响不大，因为当泊松比从0.4变化到0.5时，根据斯内登（Sneddon）方程计算出的杨氏模量值仅下降至原来的0.893倍。鉴于不同CCl4处理时长之间杨氏模量存在多倍差异，采用近似泊松比所引入的误差仅为边缘性。

我们采用回撤曲线来计算刚度值，因为我们关注的是组织对悬臂所施加载荷的弹性响应，而非对压痕的塑性响应68。由于软组织具有黏弹性响应，拟合回撤曲线可能会高估杨氏模量，这一点需加以注意。此外，我们观察到，使用接近曲线进行数据分析时，纤维化区域与对照区域之间的刚度值趋势相似，尽管其绝对值相应较低（数据未显示）。

在优化实验方案过程中，我们确定了几个对测量结果可重复性至关重要的步骤。首先，在将微珠固定到悬臂梁上时，必须确保微珠大致位于半透明针尖的中心位置，以避免压痕过程中可能出现的机械不平衡。其次，在使用PFA固定肝脏组织时，必须严格遵守解冻和固定的时间限制，改变该步骤的时间可能会显著影响组织切片的力学特性。第三，必须反复校准悬臂梁，并持续监测和输入实时温度值，以避免因温度波动导致刚度值出现人为假象。最后，单个肝脏切片自制备完成后测量时间不应超过3 h，因为覆盖的PBS在较长时间内可能发生蒸发。读者可参考故障排除表（表3）以解决原子力显微镜（AFM）测量过程中遇到的问题，相关内容亦在Norman等人的研究中进行了详细讨论46。

表3：故障排除指南。 请点击此处下载该表格。

本方案可实现对肝组织的可重复原子力显微镜探测。该方法有望揭示纤维化肝病在微观层面的发生及最终消退过程中的相关信息，并有助于开发针对慢性肝病进展过程中形成的纤维化瘢痕区域的治疗策略。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由捷克科学基金会（18-02699S）、捷克科学院机构研究项目（RVO 68378050）以及捷克教育青年体育部项目NICR EXCELES（LX22NPO05102）资助。CIISB、Instruct-CZ（隶属于Instruct-ERIC欧盟联盟），由捷克教育青年体育部基础设施项目LM2018127以及欧洲区域发展基金项目"UP CIISB"（编号：CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974）提供资金支持，为CF纳米生物技术中心（CEITEC MU）的测量工作提供了财务支持。我们同时感谢位于捷克共和国布拉格的捷克科学院分子遗传学研究所光学显微镜核心设施（Light Microscopy Core Facility, IMG CAS），该项目由捷克教育青年体育部（LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045）和RVO: 68378050-KAV-NPUI资助，为本文所展示的显微成像提供了支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
原子力显微镜探头布鲁克JPK NanoWizard 3
相机安道尔Zyla 5.5 USB（sCMOS，水冷）
The Imagingsource S/N:12310015
悬臂梁SD-qp-BioT-TL-10，NanosensorsS/N:73750F05
冷冻切片机Leica CM1950
环氧树脂胶（长工作时间）野牛环氧通用胶
三聚氰胺微珠；直径，5.7 umMicroparticles公司MF-R-5.7
显微镜Olympus IX81
疏水性  滑动标记器SuperHTPAP笔
软件JPK纳米向导  v6.1.151
AtomicJ v2.3.1
Superfrost 载玻片赛默飞世尔科技货号 J1800AMNZ
系统Ubuntu 14.04.5 LTS
减振隔离控制单元表格AVI-200-S

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肝纤维化富含胶原区域杨氏模量组织弹性力-距离曲线纤维生成软组织力学
利用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝脏硬度
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