本研究提出了一种通过嗜热菌蛋白酶E消化、完全甲基化及质谱分析相结合的方法，用于糖蛋白的糖组学分析。该方法能够分析所有类型的N-连接聚糖，包括细菌N-聚糖。
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摘要
摘要
蛋白质糖基化是最常见且最复杂的翻译后修饰之一。为了阐明糖链的特定功能、其结构与蛋白质功能之间的关系，人们已开发出多种技术。分析糖链的常用方法是利用肽-N-糖苷酶F（Peptide-N-Glycosidase F，PNGase F）通过外切糖苷酶切割，从糖蛋白或糖肽中释放N-连接糖链。然而，细菌中的糖链-蛋白质连接方式不同，目前尚无可用的酶能够从细菌糖蛋白中释放糖链。此外，游离糖链也已在哺乳动物细胞、细菌、酵母、植物和鱼类中被发现。本文介绍了一种可用于表征糖链的 N-连接的糖基化系统在 空肠弯曲菌 通过检测与天冬酰胺（Asn）连接的以及未与其靶蛋白结合的游离糖链。在该方法中，从总蛋白中提取 C. jejuni 使用更高酶与蛋白比例（2:1−3:1）和更长孵育时间（48−72 h）的Pronase E进行消化。随后，通过多孔石墨化碳柱纯化产生的Asn-聚糖和游离聚糖，进行全甲基化处理，并采用质谱分析。
引言
蛋白质N-糖基化是真核生物中最常见且最复杂的翻译后修饰之一1。N-糖链在蛋白质折叠过程中发挥关键作用，同时也影响生物合成运输过程中的蛋白质分选2。质谱技术已广泛应用于外切糖苷酶裂解释放的糖链分析（糖组学）。残留的去糖基化肽段（糖蛋白质组学）通常用于鉴定真核生物中糖基化肽段的序列3。在Campylobacter jejuni中发现N-连接糖链表明，N-糖基化不仅限于真核生物4,5,6,7,8。然而，对于细菌而言，目前缺乏有效的外切糖苷酶或内切糖苷酶来释放用于糖链分析的寡糖链。
已开发出一种替代方法，用于表征糖蛋白中的糖基化位点和聚糖结构，该方法基于非特异性蛋白水解，可降解大多数肽链骨架，生成仅含少数氨基酸的拟寡糖。已有多种非特异性酶被用于生成拟寡糖，其中发现Pronase E具有最高效且可重复的消化效果9。我们已建立一种基于Pronase E的糖组学策略，用于分析C. jejuni的N-聚糖10,11。拟寡糖可直接通过毛细管电泳质谱法（CE-MS）进行分析，或在完全甲基化后通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）进行分析。
本文描述了一种用于糖组学分析的通用方法，该方法利用非特异性的蛋白酶E消化和全甲基化，用于研究黏膜病原体C. jejuni的糖基化。该方法能够表征真核和细菌系统表达的N-连接聚糖，同时在鉴定N-连接糖基化通路中的新型中间产物方面也具有重要价值。
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方案
1. 培养 C. jejuni 11168H 及总蛋白提取
注意：C. jejuni 11168H 是 NCTC 11168 的一种高运动性克隆衍生物12。
- 通过加入约 5 mL 沪森-欣顿（Mueller-Hinton）培养基重悬细胞沉淀（约 0.15 g，NCTC），启动细胞培养。取少量初始肉汤管中的液体，滴加至沪森-欣顿琼脂平板上进行接种。在微需氧环境（即 5% O2、10% CO2 和 85% N2）中，于 37 °C 培养 18 小时。
- 用 1 mL 脑心浸液（BHI）肉汤收集细菌菌苔，并用 BHI 肉汤稀释至浓度约为 1 × 105 c.f.u./mL。在 37 °C 微需氧环境中，以 100 rpm 振荡培养 18 小时。
- 将培养板置于冰上 10 分钟以冷却细胞，随后在 4 °C 条件下以 4,500 × g 离心收集细胞。弃去上清液，并用 3 L 冰冷的 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8）洗涤细胞两次。
- 将细胞（108–1011 C. jejuni 细胞）重悬于 8 mL 冰冷的 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8）中，并通过超声处理进行裂解（参见材料表）。超声处理程序如下：每次脉冲 4 秒，间歇 1 秒，持续 1 分钟，共进行三次。
- 在 4 °C 条件下以 9,500 × g 离心 45 分钟，将上清液转移至另一离心管中。在 4 °C 条件下，用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5）对上清液中的蛋白质进行透析，每次 3 小时，共透析两次。
- 使用市售蛋白质检测试剂盒13测定蛋白质浓度（应处于 4–6 µg/µL 范围内）。
- 将 1 mg 蛋白质溶解于 1 mL 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5）中，加入 2.5 mg Pronase E 酶。在 37 °C 孵育 48 小时，随后将溶液在 100 °C 煮沸 5 分钟以灭活酶活性。
- 将蛋白质消化液储存于 -80 °C，以备后续使用。
2. 使用多孔石墨化碳（PGC）进行纯化
- 通过加入1 mL含0.1%三氟乙酸（TFA）的80%（v/v）乙腈（ACN）活化PGC小柱（100 mg，5 mL），重复2次。
- 用1 mL水洗涤PGC小柱3次。
- 将来自1 mg蛋白质的Pronase E消化产物上样至PGC小柱（体积取决于蛋白质浓度）。
- 每次用1 mL水洗涤小柱，共洗涤3次，以去除盐分。
- 先用1 mL含0.1% TFA的25% ACN洗脱Asn-聚糖，再用1 mL含0.1% TFA的50% ACN洗脱。
- 合并两部分洗脱液，使用冷冻真空浓缩仪（材料表）将样品干燥，用于后续处理。
注意：Asn-聚糖纯化过程中应使用质谱级溶剂。
3. Asn-聚糖的完全甲基化
- 在1.5 mL离心管中，用100 µL二甲基亚砜（DMSO）溶解干燥的Asn-聚糖。
- 通过将两粒NaOH颗粒与2 mL DMSO混合，制备DMSO-NaOH浆液。向样品中加入200 µL DMSO-NaOH浆液和100 µL碘甲烷。
- 盖紧管盖，使用涡旋混合器在室温下以3,000 rpm搅拌10分钟。
- 加入1 mL水以终止完全甲基化反应。
- 加入1 mL氯仿，涡旋1分钟，以萃取完全甲基化的Asn-聚糖。
- 在9,000 x g 下离心3分钟。弃去上清液，保留含有完全甲基化Asn-聚糖的下层氯仿相。
- 加入1 mL水并涡旋1分钟，洗涤有机层。在9,000 x g下离心3分钟，弃去上清液。重复此步骤2次。
- 将有机相置于通风橱中，用氮气流在室温下吹干。
- 将完全甲基化的Asn-聚糖在-80 °C下保存，用于质谱分析。
4. 电喷雾电离质谱法（ESI-MS）及 ESI-MS/MS 分析
- 将全甲基化的 Asn-聚糖溶解于 20 µL 的 50% 异丙醇水溶液（v/v）中。
- 使用长度为 90 cm 的未涂层熔融石英毛细管，以 50% 异丙醇水溶液作为鞘流液（流速 1 µL/min），进行 CE-ESI-MS 分析。
注意：CE-MS 是一种结合毛细管电泳（CE）与质谱分析（MS）的系统。CE 根据离子的离子迁移率实现离子分离。本方案中，CE 系统用于引入微量样品并实现在线脱盐。 - 将 ESI 电压设置为正离子模式下的 5 kV。
- 在 500 mbar 压力下进样 0.2 分钟，进样体积约为 100 nL，用于加载全甲基化的 Asn-聚糖样品。
- 使用质谱仪（材料表）并按照以下采集参数获取 MS 数据。
- 在全扫描 MS 模式下，设置驻留时间为每 0.1 m/z 单位 2.0 ms。在采用增强型产物离子扫描（EPI）的 MS2 和 MS3 实验中，设置扫描速度为 4,000 Da/s，并启用 Q0 捕获功能。将离子阱填充时间设为 动态，Q1 分辨率设为 单位分辨率。在 MS3 实验中，设置激发系数以确保仅选择单电荷前体离子的单一同位素峰。激发时间设置为 100 ms。
5. 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析全甲基化聚糖
- 将全甲基化Asn-聚糖溶解于10 µL的50%甲醇/水（v/v）中。
- 取1 µL溶解的Asn-聚糖与2 µL的2,5-二羟基苯甲酸溶液（10 mg/mL，溶于50%乙腈/水（v/v））混合。
- 取1 µL混合样品点样至384孔MALDI靶板上，待样品完全干燥。
- 将靶板插入配备脉冲氮激光器（337 nm）的MALDI-TOF质谱仪中，正离子模式下设置加速电压为20 kV。
- 将激光能量设为任意单位6,000，在正离子反射模式下采集质荷比（m/z）1,000至5,000范围内的数据。
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结果
基于蛋白酶E消化与全甲基化联用的方法被应用于总蛋白提取物中N-糖链的分析 C. jejuni 11168H 图1 展示了实验流程的流程图。在常规消化中，酶与糖蛋白的比例设定为1:100至1:20。此处，Pronase E与蛋白质的比例提高至2:1–3:1，并采用更长的消化时间，通过孵育实现彻底消化 37 °C 48小时。随后，通过PGC纯化耗尽消化产生的Asn-聚糖，并采用常规DMSO-NaOH法进行全甲基化。全甲基化Pronase E消化产物的MALDI-MS分析结果如图所示 图2三种苯甲基化反应时间，即., 5 分钟、10 分钟和 20 分钟的条件被考察。获得的质谱图谱表明，Protonase E 消化与完全甲基化相结合的方法具有可重复性。而位于 m/z 1755 对应于 Glc1GalNAc5Bac，该离子在 m/z 1866 仅比理论值高 111 Da。为验证该离子是否对应于 Glc 的全甲基化产...
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讨论
在实施这一通用糖组学策略的方案中，有两个关键步骤。第一个关键步骤是完成彻底消化。该方法高度依赖于Pronase E消化的完全性，因此必须使用较长的消化时间以及较高的酶与蛋白质比例。通常建议Pronase E与蛋白质的比例为2:1至3:1，孵育时间为48小时。已有研究表明，采用这种推荐的彻底消化方法可使糖链以单个氨基酸为主要成分10。彻底消化后的产物需通过PGC小柱进行纯化。该小柱不仅能保留糖链，还能保留未消化的酶。然而，由于酶蛋白具有高度疏水性，不会从小柱上被洗脱出来。
第二个关键步骤是完成甲基化。尽管基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）可用于分析天然形式的糖链，但将糖链转化为其甲基化衍生物更具优势。对全甲基化糖链的分析有助于确定分支结构及糖苷键连接方式。全甲基化还可通过稳定末端唾液酸化的寡糖中唾液酸，使质谱/质谱（MS/MS）裂解过程中产生的离子产物更加可预测。值得一提的是，经蛋白酶E释放并全甲基化的Asn-糖链的分子质量仅比游离寡糖高111 Da，这是由于发生了分子重排。对全甲基化Asn-糖链的核磁共振（NMR）光谱分析证...
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致谢
作者感谢 Kenneth Chan、David J. McNally、Harald Nothaft、Christine M. Szymanski、Jean-Robert Brisson 和 Eleonora Altman 提供的帮助和有益的讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,5-二羟基苯甲酸（DHB） | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 149357 | |
| 2-丙醇 | Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada) | AA22906K7 | |
| 4000 Q-Trap | AB Sciex (Concord, Canada) | 质谱仪 | |
| 4800 MALDI-TOF/TOF | Applied Biosystems (Foster City, CA) | 质谱仪 | |
| 乙腈（ACN） | Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada) | A996-4 | |
| 脑心浸液（BHI）肉汤 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 5121 | |
| C18 Sep-Pak 小柱 | Waters (Milford, MA). | WAT036945 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | CX1054 | |
| Difco | Fisher Science (Ottawa, Ontario,Canada) | DF0037-17-8 | Fisher Science |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 276855 | |
| Eppendorf 管 | Diamed (Missisauga, Ontario,Canada) | SPE155-N | |
| 冰醋酸 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A6283 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific, Ottawa, Ontario,Canada) | A544-4 | |
| 碘甲烷 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 289566 | |
| PGC 小柱 | Thermo Scientific(Waltham,MA) | 60106-303 | 多孔石墨化碳 |
| 蛋白酶 E | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 7433-2 | |
| 蛋白定量试剂盒 | Bio-rad (Mississauga, Ontario, Canada) | 5000001 | |
| 制冷式真空浓缩仪 | Thermo Scientific(Waltham,MA) | SRF110P2-230 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 367176 | |
| 超声波破碎仪 | Mandel Scientific (Guelph, Ontario,Canada) | XL 2020 | |
| 三氟乙酸（TFA） | Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada) | A11650 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T3253 |
参考文献
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- Hofmann, J., Hahm, H. S., Seeberger, P. H., Pagel, K. Identification of carbohydrate anomers using ion mobility-mass spectrometry. Nature. 526 (7572), 241-244 (2015).
- Kowarik, M., et al. N-linked glycosylation of folded proteins by the bacterial oligosaccharyltransferase. Science. 314 (5802), 1148-1150 (2006).
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- Nwosu, C. C., et al. Simultaneous and Extensive Site-specific N- and O-Glycosylation Analysis in Protein Mixtures. Analytical Chemistry. 85, 956-963 (2013).
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