基于非特异性蛋白水解的细菌糖蛋白糖组学策略

摘要

本研究提出了一种通过嗜热菌蛋白酶E消化、完全甲基化及质谱分析相结合的方法，用于糖蛋白的糖组学分析。该方法能够分析所有类型的N-连接聚糖，包括细菌N-聚糖。

摘要

蛋白质糖基化是最常见且最复杂的翻译后修饰之一。为了阐明糖链的特定功能、其结构与蛋白质功能之间的关系，人们已开发出多种技术。分析糖链的常用方法是利用肽-N-糖苷酶F（Peptide-N-Glycosidase F，PNGase F）通过外切糖苷酶切割，从糖蛋白或糖肽中释放N-连接糖链。然而，细菌中的糖链-蛋白质连接方式不同，目前尚无可用的酶能够从细菌糖蛋白中释放糖链。此外，游离糖链也已在哺乳动物细胞、细菌、酵母、植物和鱼类中被发现。本文介绍了一种可用于表征糖链的 N-连接的糖基化系统在 空肠弯曲菌 通过检测与天冬酰胺（Asn）连接的以及未与其靶蛋白结合的游离糖链。在该方法中，从总蛋白中提取 C. jejuni 使用更高酶与蛋白比例（2:1−3:1）和更长孵育时间（48−72 h）的Pronase E进行消化。随后，通过多孔石墨化碳柱纯化产生的Asn-聚糖和游离聚糖，进行全甲基化处理，并采用质谱分析。

引言

蛋白质N-糖基化是真核生物中最常见且最复杂的翻译后修饰之一¹。N-糖链在蛋白质折叠过程中发挥关键作用，同时也影响生物合成运输过程中的蛋白质分选²。质谱技术已广泛应用于外切糖苷酶裂解释放的糖链分析（糖组学）。残留的去糖基化肽段（糖蛋白质组学）通常用于鉴定真核生物中糖基化肽段的序列³。在Campylobacter jejuni中发现N-连接糖链表明，N-糖基化不仅限于真核生物^4,5,6,7,8。然而，对于细菌而言，目前缺乏有效的外切糖苷酶或内切糖苷酶来释放用于糖链分析的寡糖链。

已开发出一种替代方法，用于表征糖蛋白中的糖基化位点和聚糖结构，该方法基于非特异性蛋白水解，可降解大多数肽链骨架，生成仅含少数氨基酸的拟寡糖。已有多种非特异性酶被用于生成拟寡糖，其中发现Pronase E具有最高效且可重复的消化效果⁹。我们已建立一种基于Pronase E的糖组学....

方案

1. 培养 C. jejuni 11168H 及总蛋白提取

注意：C. jejuni 11168H 是 NCTC 11168 的一种高运动性克隆衍生物¹²。

1. 通过加入约 5 mL 沪森-欣顿（Mueller-Hinton）培养基重悬细胞沉淀（约 0.15 g，NCTC），启动细胞培养。取少量初始肉汤管中的液体，滴加至沪森-欣顿琼脂平板上进行接种。在微需氧环境（即 5% O₂、10% CO₂ 和 85% N₂）中，于 37 °C 培养 18 小时。
2. 用 1 mL 脑心浸液（BHI）肉汤收集细菌菌苔，并用 BHI 肉汤稀释至浓度约为 1 × 10⁵ c.f.u./mL。在 37 °C 微需氧环境中，以 100 rpm 振荡培养 18 小时。
3. 将培养板置于冰上 10 分钟以冷却细胞，随后在 4 °C 条件下以 4,500 × g 离心收集细胞。弃去上清液，并用 3 L 冰冷的 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8）洗涤细胞两次。
4. 将细胞（10⁸–10¹¹ C. jejuni 细胞）重悬于 8 m....

结果

基于蛋白酶E消化与全甲基化联用的方法被应用于总蛋白提取物中N-糖链的分析 C. jejuni 11168H 图1 展示了实验流程的流程图。在常规消化中，酶与糖蛋白的比例设定为1:100至1:20。此处，Pronase E与蛋白质的比例提高至2:1–3:1，并采用更长的消化时间，通过孵育实现彻底消化 37 °C 48小时。随后，通过PGC纯化耗尽消化产生的Asn-聚糖，并采用常规DMSO-NaOH法进行全甲基化。全甲基化Pronase E消化产物的MALDI-MS分析结果如图所示 图2三种苯甲基化反应时间，即., 5 分钟、10 分钟和 20 分钟的条件被考察。获得的质谱图谱表明，Protonase E 消化与完全甲基化相结合的方法具有可重复性。而位于 m/z 1755 对应于 Glc₁GalNAc₅Bac，该离子在 m/z 1866 仅比理论值高 111 Da。为验证该离子是否对应于 Glc 的全甲基化产.......

讨论

在实施这一通用糖组学策略的方案中，有两个关键步骤。第一个关键步骤是完成彻底消化。该方法高度依赖于Pronase E消化的完全性，因此必须使用较长的消化时间以及较高的酶与蛋白质比例。通常建议Pronase E与蛋白质的比例为2:1至3:1，孵育时间为48小时。已有研究表明，采用这种推荐的彻底消化方法可使糖链以单个氨基酸为主要成分¹⁰。彻底消化后的产物需通过PGC小柱进行纯化。该小柱不仅能保留糖链，还能保留未消化的酶。然而，由于酶蛋白具有高度疏水性，不会从小柱上被洗脱出来。

第二个关键步骤是完成甲基化。尽管基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）可用于分析天然形式的糖链，但将糖链转化为其甲基化衍生物更具优势。对全甲基化糖链的分析有助于确定分支结构及糖苷键连接方式。全甲基化还可通过稳定末端唾液酸化的寡糖中唾液酸，使质谱/质谱（MS/MS）裂解过程中产生的离子产物更加可预测。值得一提的是，经蛋白酶E释放并全甲基化的Asn-糖链的分子质量仅比游离寡糖高111 Da，这是由于发生了分子重排。对全甲基化Asn-糖链的核磁共振（NMR）光谱分析证.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,5-二羟基苯甲酸（DHB）	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	149357
2-丙醇	Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)	AA22906K7
4000 Q-Trap	AB Sciex (Concord, Canada)		质谱仪
4800 MALDI-TOF/TOF	Applied Biosystems (Foster City, CA)		质谱仪
乙腈（ACN）	Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)	A996-4
脑心浸液（BHI）肉汤	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	5121
C18 Sep-Pak 小柱	Waters (Milford, MA).	WAT036945
氯仿	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	CX1054
Difco	Fisher Science (Ottawa, Ontario,Canada)	DF0037-17-8	Fisher Science
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	276855
Eppendorf 管	Diamed (Missisauga, Ontario,Canada)	SPE155-N
冰醋酸	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A6283
甲醇	Fisher Scientific, Ottawa, Ontario,Canada)	A544-4
碘甲烷	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	289566
PGC 小柱	Thermo Scientific(Waltham,MA)	60106-303	多孔石墨化碳
蛋白酶 E	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	7433-2
蛋白定量试剂盒	Bio-rad (Mississauga, Ontario, Canada)	5000001
制冷式真空浓缩仪	Thermo Scientific(Waltham,MA)	SRF110P2-230
氢氧化钠	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	367176
超声波破碎仪	Mandel Scientific (Guelph, Ontario,Canada)	XL 2020
三氟乙酸（TFA）	Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)	A11650
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	T3253