使用一步水相交联共纳米聚合方法合成刺激响应性纳米凝胶

摘要

纳米凝胶是一种用于递送生物制剂的优良且多功能的纳米颗粒平台。采用一步交联共纳米聚合策略，在水相条件下合成了能够包载基于蛋白质的有效成分的响应性聚乙二醇基聚合物纳米凝胶。本文介绍了这些新型纳米颗粒的最佳制备方法及其表征过程。

摘要

由交联聚合物纳米颗粒组成的纳米凝胶因其多功能的自下而上合成方法和良好的生物相容性，已被开发用于递送多种化学和生物治疗剂。尽管迄今为止已有多种方法被用于纳米凝胶的合成，但极少有方法能够在不使用可能破坏生物有效载荷完整性的剧烈有机溶剂或高温条件的情况下完成合成。相比之下，本文所介绍的方法可在温和反应条件下实现负载蛋白质的亚100 nm级纳米凝胶的合成。本文介绍了一种利用水相单步交联共聚技术合成纳米凝胶，并非共价包封基于蛋白质的有效载荷的方法。在该技术中，我们首先通过静电作用将基于蛋白质的有效载荷与阳离子型季铵盐单体结合，随后在过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺的作用下同时进行交联和共聚，形成能够包埋蛋白质有效载荷的纳米凝胶。采用动态光散射（DLS）测定纳米凝胶的粒径和多分散系数，通过透射电子显微镜（TEM）评估其表面形貌。通过计算包封效率来确定纳米凝胶内包埋的蛋白质质量。此外，还通过生物还原实验评估纳米凝胶通过氧化还原响应性结构单元逐步降解实现的可控释放能力。我们提供了纳米颗粒优化的示例数据，以展示采用该技术进行纳米凝胶合成与表征过程中的所有注意事项。总体而言，所获得的纳米凝胶粒径均一，平均粒径为57 nm，多分散系数为0.093。包封效率高达76%。此外，在谷胱甘肽存在条件下，纳米凝胶通过新型氧化还原响应组分的逐步降解，在48小时内实现了高达86%的包封蛋白的可控释放。

引言

纳米凝胶是一类三维、亚微米级的水凝胶，具有交联的聚合物网络结构，能够在其核壳结构中容纳大量液体，同时不破坏其形态完整性¹。通常，纳米凝胶通过在非均相胶体体系（如油包水反相微乳液）中，采用物理或化学交联方式对功能单体进行聚合而合成^2,3。两亲性共聚物可在水性环境中自组装形成纳米级结构。然而，这些结构必须通过化学交联策略加以稳定，例如引入二硫键或基于酰胺的偶联反应、点击化学，或通过物理手段（如疏水作用、静电作用或氢键作用）以及光诱导方式进行稳定⁴。在这些策略中，先通过物理自组装形成聚合物结构，再进行化学交联的方法已被证实为一种成功的纳米凝胶制备技术⁵。尽管历史上首个纳米凝胶由Vingradov等人⁶、Akiyoshi等人⁷和Lemieux等人⁸于20世纪90年代提出，但近年来，已开发出多种由天然和合成聚合物组成的智能纳米凝胶，并被广泛探索用于各类生物医学应用⁹。

纳米凝胶具有强大的载物保留能力、较大的比表面积、体内稳定性，以及可定制的化学和机械性能¹⁰。纳米凝胶的合成具有可扩展性，且可基于水相进行。此外，纳米凝胶较高的含水量使其成为敏感生物载物的有效载体¹¹。同时，其高比表面积可满足多种生物偶联需求，从而允许连接靶向基团以实现主动靶向。值得注意的是，纳米凝胶设计的多功能性使其可采用多种刺激响应性单体，从而精确调控其理化性质⁹。这种独特的可工程化特性使得纳米凝胶的设计得以合理优化，而这一点在传统使用的脂质体、胶束或聚合物囊泡中难以实现^12,13。通过在特定设计的单体中引入刺激响应性基元，可使纳米凝胶在响应多种生理相关刺激（如pH、氧化还原条件、酶等）时触发其载物的可控释放^9,14。这类智能纳米凝胶相较于传统纳米凝胶更具优势，因其具有更优异的稳定性，可延长血液循环时间，并能耐受生理环境以维持载物完整性，进而在目标部位实现可控释放¹⁵。事实上，由于其多功能特性，纳米凝胶已在生物医学领域获得广泛关注，在开发用于多种诊疗和诊断应用的刺激响应性纳米凝胶方面取得了显著进展^2,16,17。

生物制剂可代表一类由蛋白质、肽和/或核酸组成的药品，因其卓越的选择性而彻底改变了治疗领域，从而成为增长最快的治疗药物类别¹⁸。事实上，此类药物市场的快速增长在美国食品药品管理局（FDA）批准数量的急剧上升中得到了明显体现，2023年生物制剂约占全部药物批准总数的40%¹⁹。除了其特异性和高效性之外，新药靶点的快速发现、更高效的生物工程工艺以及对这些药物在体内的命运（in vivo fate）的深入了解也推动了其应用的增加²⁰。传统的生物制剂包括干扰RNA、替代蛋白、细胞因子和激素，通常通过重组DNA技术生产²¹。自1982年人源重组胰岛素获批以来，生物制剂已广泛应用于多种疾病的治疗，包括癌症（如曲妥珠单抗、阿维鲁单抗）、炎症性肠病（如阿达木单抗、赛妥珠单抗）以及罕见遗传病（如米波美森、美而赞、阿而赞、法布赞）²¹。尽管生物制剂与其靶点之间高度特异性的相互作用理论上应能抵消脱靶效应，但在临床应用中仍出现了与不良反应相关的若干担忧²²。这些不良反应可分为两类：药理作用过度（靶点过度激活）和免疫原性。此外，生物制剂还存在半衰期短、生物利用度有限、易受蛋白酶降解、保质期较短以及生产成本高昂等问题，限制了其治疗效果²¹。传统缓解这些问题的方法包括对生物制剂进行共价修饰，但这可能损害其功能，从而降低疗效²³。相比之下，纳米医学方法通过将治疗性载荷包裹于纳米颗粒中，可带来多种药理学优势，其中最重要的是通过增强渗透与滞留（EPR）效应实现对炎症部位的被动靶向²⁴。其他与纳米颗粒相关的优点还包括延长血液循环时间、降低清除率、提高制剂灵活性、增强血管通透性以及促进细胞摄取²⁵。尽管目前有大量不同类型的纳米颗粒制剂正在研究用于递送生物类载荷，但能够模拟纳米凝胶多功能性的仍属少数。实际上，纳米凝胶的载药能力超过了脂质体和胶束类纳米颗粒，且其胶体稳定性优于大多数无机纳米颗粒。因此，纳米凝胶为多种生物治疗药物的递送提供了一个极具价值的平台。

我们此前已成功将一种抗氧化酶递送至新型基质金属蛋白酶响应性交联聚合物纳米凝胶中，所采用的温和包封策略在酶释放后仍能保持其生物活性²⁶在本研究中，我们展示了用于递送基于蛋白质的载荷的氧化还原响应型纳米凝胶的优化合成方法。值得注意的是，该合成方法可在温和条件下实现纳米凝胶的制备，从而包封目标载荷，无需使用剧烈的有机溶剂或高温。我们利用细胞内环境中的氧化还原稳态来调控包封载荷的释放。^27,28通常，天然存在的抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）可调控细胞外和细胞内的氧化还原电位，其浓度分别在2–20 µM和1–10 mM之间。^29,30迄今为止，已有大量氧化还原响应性纳米颗粒被报道，使其成为实现药物可控释放的一种成熟且可靠的策略。 体内^27,28事实上，已通过使用含二硫键的交联剂在聚合物纳米材料中引入了二硫键^31,32含二硫键单体的可生物降解聚合物的自组装³³以及氧化还原响应性聚合物前药或药物/聚合物偶联物^34,35因此，本研究探讨在聚合物纳米颗粒中引入一种独特的、对谷胱甘肽（GSH）高度敏感的二硫交联剂，从而实现对包封蛋白载荷的可控释放。

在本研究中，纳米凝胶的设计围绕以下标准展开，以实现特异性和载荷递送：小尺寸（约100 nm）和均匀的尺寸分布（多分散指数（PI）< 0.2）、负电荷表面（ζ电位 < −30 mV）、高载药效率以及在生理条件下的长期胶体稳定性。<0.3）以确保有效穿透内皮层并 体内 稳定性²⁷；蛋白质负载物的高效包封，以及响应谷胱甘肽（GSH）的负载物可控释放。我们报道了GSH响应性交联纳米凝胶的合成，该纳米凝胶可形成均一的、粒径小于100 nm的纳米颗粒，对目标蛋白质负载物的包封效率达76%。

方案

1. 氧化还原响应性交联剂的合成

1. 加入2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐（44.79 mg，0.270 mmol）和三乙胺（0.063 mL）至3 mL无水二氯甲烷中，在惰性N₂氛围下搅拌20 min₂ 25 mL 圆底烧瓶中的气体
2. 溶解4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-十六氧杂-28,29-二硫代六十五烷二酸二-N-琥珀酰亚胺酯（100 mg，0.045 mmol）溶于1 mL无水二氯甲烷中，加入烧瓶。
3. 向烧瓶中加入 4 mL 无水二氯甲烷。用铝箔包裹反应烧瓶，并在 N₂ 氛围下搅拌放置₂ 在室温下
4. 通过薄层色谱法确认产物的生成。采用该方法确认产物生成时，需确保起始物料的参考信息正确无误。
   1. 薄层色谱是一种基于亲和性的方法，用于从反应混合物中分离目标化合物。在此实验中，使用高极性且具有吸附性的硅胶板作为固定相。将起始原料样品和反应混合物样品点样于硅胶板的一端，然后将硅胶板垂直放入含有洗脱剂（流动相：5% 甲醇 : 二氯甲烷）的密闭玻璃烧杯中。 关键词：薄层色谱，硅胶板，固定相，反应混合物，点样，洗脱剂，流动相，甲醇，二氯甲烷
   2. 通过毛细作用，流动相沿硅胶板向上移动，样品中的各组分因其对固定相和流动相的亲和力不同而迁移不同的距离。当溶剂前沿迁移至板长的3/4时^th 的平板，取下并干燥。分离的化合物在平板上呈现为斑点。计算保留因子（R_f) 目标化合物的比移值（Rf）计算公式为：化合物迁移距离／溶剂迁移距离。此处，R_f 产物的比移值（Rf）为0.35。可使用紫外光或染色法（高锰酸钾）显色以观察斑点。
5. 浓缩混合物 在真空中 通过快速柱层析纯化（5% 甲醇：二氯甲烷等度洗脱体系）³⁶将反应混合物加至填充有硅胶（固定相）的玻璃柱顶部，然后用溶剂体系（流动相）洗脱。³⁶收集所有流分，并使用薄层色谱（TLC）进行分析，根据先前确定的R值区分产物流分。_f 值
6. 使用旋转蒸发仪（温度：40 °C）浓缩纯化后的组分，先将真空压力调至大气压以除去低沸点的二氯甲烷。当溶剂液面不再下降时，将真空压力调至337 mbar以除去甲醇，得到淡黄色油状物，随后对该产物进行进一步表征以确认目标产物的生成³⁷.
7. 进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析³⁸, ¹H NMR（在氘代二甲基亚砜（DMSO-d₆))³⁹, ¹³C NMR³⁹ 基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-ToF）⁴⁰ 在进行下一步操作前，需通过分析确认产物的生成。
   1. 进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析时，将1 mg油样加载至仪器以获取光谱。
   2. 对于核磁共振（NMR）分析，将10 mg产物重新溶解于0.75 mL相应的NMR溶剂中，转移至NMR管内并密封严实以防止泄漏。将样品装入NMR仪器，随后获取谱图。³⁹.
   3. 进行质谱分析时，将1 mg产物密封于样品瓶中，用DMSO溶解后上机检测。
      注意：红外分析可提供目标产物中关键官能团的信息，即在1650 cm⁻¹处出现的尖锐峰所对应的羰基伸缩振动（C=O）^-1 表明酰胺键的形成，从而凸显产物的生成。 ¹H NMR 和 ¹³C 可提供有关化学环境的信息，因此可通过鉴定化合物中存在的化学环境来确定目标产物的化学组成。最后，质谱法可用于验证目标产物的精确质量。

2. 用谷胱甘肽检测二硫交联剂的裂解

1. 将二硫交联剂（终浓度为4.55 mg/mL）与还原剂谷胱甘肽（终浓度[GSH]：10 mM）在1.5 mL玻璃小瓶中混合，总体积为1 mL，孵育24 h。
2. 为确认二硫键连接子的断裂，将样品管送至进行MALDI-ToF分析^26,40.

3. 氧化还原响应性纳米凝胶的合成

1. 确保用于反应的所有玻璃器皿均无灰尘，先用经滤膜（0.20 µm）过滤的去离子水清洗，随后通过通风橱侧边的压缩空气接口，使用压缩空气将玻璃器皿吹干。在压缩空气出口处安装牢固的喷嘴以方便操作。牢固握住反应小瓶，将喷嘴插入瓶内，开启压缩空气，向瓶内释放可控气流。观察干燥过程，确保干燥充分，并检查是否存在残留污染物或水分。
2. 用去离子水填充一个10 mL玻璃小瓶，并用橡胶隔垫密封。通过向水中通入N₂气泡以去除氧气₂ 在开始反应前，需通入氮气至少30分钟。为此，先用氮气充满一个气球₂ 气体，并在气球上连接一根针；将气球置于隔膜上，用针刺穿橡胶隔膜，使 N₂ 流。将一个出口针连接到烧瓶上，以确保氮气持续流动₂.
3. 将牛血清白蛋白（BSA；2 mg，30 nmol）或Cy7标记的BSA（2 mg，30 nmol）溶解于1 mL脱氧去离子水中，加入另一洁净的10 mL玻璃小瓶中。
4. 加入[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵（AETC）溶液（12.00 mg/10.86 µL，0.060 mmol）至烧瓶中，并用另一橡胶隔垫密封。确保反应混合物始终处于持续的N₂气流下₂ 通入气体并搅拌30分钟。
5. 将丙烯酰胺（9.21 mg，0.13 mmol）溶解于1 mL脱氧去离子水中，加入小瓶中的混合物。
6. 将二硫交联剂（4.44 mg，0.004 mmol）溶于1 mL去离子水中，加入小瓶中的混合物。用N₂吹洗混合物₂ 气体处理20分钟。
7. 将十二烷基硫酸钠（2 mg，0.007 mmol）溶于1 mL脱氧去离子水中，通过N₂ 用惰性气体冲洗注射器，并将混合物搅拌30分钟。
   注意：通过用 N 冲洗注射器₂ 我们尽量减少反应混合物暴露于大气中的氧气，以避免抑制自由基聚合反应。
8. 添加 N,N,N',N'-四甲基乙二胺（1.5 µL，0.010 mmol），在N₂氛围下使反应混合物脱氧3分钟₂ 气体
9. 将过硫酸铵（1 mg，0.004 mmol）溶于1 mL脱氧去离子水中，加入反应混合物。确保 N₂ 气体通入反应混合物中持续10分钟。
   注意：如果 N₂ 若省略加样步骤，反应瓶中很可能形成白色颗粒物。这些是较大颗粒和/或聚集体，会干扰后续任何表征分析。
10. 在氮气氛围下密封烧瓶₂ 在常温下搅拌反应3小时30分钟。
11. 为终止反应，取下烧瓶的密封装置，使反应混合物继续搅拌至少10分钟。此举将使反应混合物暴露于大气中的氧气水平₂ 气体，从而淬灭反应混合物中任何残留的自由基。当混合物呈现清澈的蓝色乳光外观时，反应结束。
12. 为了纯化纳米凝胶，将反应混合物加入一个15 mL离心过滤装置（100 kDa截留分子量）中，并加入去离子水至填满离心过滤装置。在1000 × g条件下离心反应混合物 x g 10分钟。这将去除小于100 kDa的未反应化学物质（或未包封的有效载荷），并浓缩纳米凝胶样品。
13. 当离心单元中的水位下降后，加入 2 mL 去离子水稀释纳米凝胶样品，并离心以浓缩产物。重复此步骤 3 次。
14. 将样品储存于 2-8 °C，以防止包封蛋白降解。
15. 进行FT-IR和 ¹H NMR（在氘代二甲基亚砜（DMSO-d₆)) 分析以确认聚合反应^39,41将1 mL纳米凝胶溶液加入1.5 mL样品瓶中，冷冻干燥以制备样品。冷冻干燥过程包括将样品冻结，随后施加真空，使冻结的溶剂通过升华去除，最终留下粉末状残留物。冷冻干燥完成后，将样品重新溶解于相应的核磁共振（NMR）溶剂中，转移至NMR样品管并严密封口。按照前述方法将样品装入NMR仪器中。³⁹进行FT-IR分析时，应将1 mg干燥粉末装入仪器以获取光谱。

4. 纳米凝胶形貌表征

1. 动态光散射（DLS）
   注意：使用动态光散射仪（DLS）在25 °C、632.8 nm激光波长和173°信号检测角下测定水合粒径（nm）、多分散系数（PI）和泽塔电位。每次运行包含25次子扫描循环。
   1. 流体动力学粒径（nm）测量
      1. 使用过滤的去离子水清洗比色皿或一次性折叠毛细管池。向比色皿中吹入压缩空气（适用于动态光散射和Zeta电位测量），以确保其无大颗粒灰尘。
      2. 用至少50–100 µL样品填充比色皿，并用750–1000 µL过滤去离子水稀释。使用Zeta电位比色皿时，应确保样品填充过程中无气泡产生，以免干扰测量结果。
      3. 将比色皿放入DLS仪器中，并确保其已正确插入。操作时，打开DLS仪器的样品室盖。用手握住比色皿的顶部边缘，避免在光学窗口上留下指纹。确保比色皿已稳妥地置于比色皿 holder 中，位置水平且与仪器的光路对齐。关闭样品室盖，以防止环境光干扰。
         注意：稀释液需使用孔径为0.45 µm的注射器滤器过滤。
      4. 单击以在相应的DLS仪器软件上开始粒径测量。
      5. 选择与样品对应的结果，以获得z均值（平均粒径）、平均多分散系数（PI）、每秒千计数（kcps）、zeta电位及相关图谱。确保相关函数呈现平滑的S形曲线，这表明样品均一。
      6. 分析完成后，从DLS中取出比色皿。
2. 透射电子显微镜（TEM）
   1. 将10 µL纳米颗粒溶液（0.077 mg/mL）滴加到覆有碳膜的铜网上，室温下晾干1小时。
   2. 用过滤的去离子水清洗载网，然后加入5 µL过滤的1%醋酸铀酰水溶液染色2分钟。
   3. 用滤纸吸去多余的染色剂后，将载网在室温下干燥过夜。次日使用明场相机在45,000倍放大倍数下采集透射电子显微镜图像。
   4. 使用提供的软件进行图像处理（分辨率：2048 x 2048 像素）。

5. 使用微量双辛可宁酸（BCA）法定量纳米凝胶内包封的蛋白（BSA）

1. 根据微BCA法测定试剂盒说明书（制造商网站提供）中的实验方案，基于预定义的蛋白质浓度绘制标准曲线⁴².
2. 合成后，使用截留分子量为100 kDa的15 mL离心过滤装置（1000 x g， 10 分钟），具体步骤见 3.12–3.14。
3. 收集滤液，并使用microBCA法（方案详见试剂盒生产商网站）进行分析。使用酶标仪在562 nm处测定吸光度。由于该测定值与未包封蛋白浓度相关，据此可确定包封蛋白的质量。包封效率（EE）%的计算公式如下：
   

4. 
   

结果

聚乙二醇（PEG）二硫代二丙烯酸酯交联剂的合成与表征 该氧化还原响应性交联剂通过2-氨基乙基甲基丙烯酸酯对N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯的亲核取代反应，形成酰胺键而合成（图1）。目标产物的合成主要通过¹H NMR（补充图1）进行验证，测试时将样品溶解于氘代DMSO中，通过PEG链段在δ3.48–3.53处的亚甲基共振峰以及(N)CH₂-CH₂基团在δ3.59–3.65处的三重峰组合，可确认产物的生成。此外，还采用FT-IR（补充图2）、MALDI-ToF（补充图3）和¹³C NMR（补充图4）对所得产物进行了进一步表征。

在将交联剂（4.55 mg/mL）包载入纳米凝胶之前，于 PBS 中加入 GSH（11 mM），在 37 °C 下孵育 24 小时，...

讨论

生物制药行业对靶向特异性生物制剂日益增长的需求推动了对能够提升其性能技术的需求 体内 药理学特性，同时防止其在生理条件下的快速降解，并抵消任何不良副作用。基于此，本文描述了一种制备载蛋白纳米凝胶的简便合成方法。如实验方案所示，在进行纳米凝胶合成之前，需先合成氧化还原响应型交联剂。随后加入其余关键单体，并在添加十二烷基硫酸钠（SDS）后 原位 由自由基聚合引发 N,N,N',N'四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（APS）。高溶解性的丙烯酰胺（AM）可在水相环境中维持纳米凝胶的稳定性，2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵（AETC）盐可维持目标蛋白载荷的静电模板作用，并减少其过早释放²⁶此外，聚乙二醇二硫代二丙烯酸酯交联剂可实现有效载荷的可控释放^28,32随后通过纯化方法去除SDS，包括用去离子水洗涤三次后离心，或透析。

全球许多研究人员已采用多种不同的合成策略制备了聚合...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学品
2-( 丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液	Sigma Aldrich	496146
2-氨基乙基甲基丙烯酸盐盐酸盐	Sigma Aldrich	516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41, 44,47,50,53-十六氧杂-28,29-二硫代六十五烷二酸二-N-琥珀酰亚胺酯	Sigma Aldrich	671630
丙烯酰胺	Sigma Aldrich	23701
过硫酸铵	Sigma Aldrich	248614
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	B6917
Cy7标记的牛血清白蛋白	Nanocs	BS1-S7-1
氘代二甲基亚砜	Sigma Aldrich	547239
二氯甲烷	Sigma Aldrich	270997 (无水) 和 D65100
谷胱甘肽	Sigma Aldrich	G4251
甲醇	Sigma Aldrich	34860
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺	Sigma Aldrich	411019
磷酸盐缓冲液	ThermoFisher	10010023
十二烷基硫酸钠	Sigma Aldrich	436143
三乙胺	Sigma Aldrich	471283
醋酸铀酰	Agar Scientific	AGR1260A
纳米凝胶合成与表征所需设备
Amicon Ultra-15 离心过滤装置（100 kDa 截留分子量）	Merck Millipore	C7715
相机	Olympus	Veleta
碳支持铜网	Agar Scientific	AGS160
透析管（100 kDa 截留分子量）	Spectrum labs	11405949
动态光散射	Malvern	Zetasizer Nano Ultra
冷冻干燥机	Labconco	WZ-03336-01
红外光谱仪	Agilent	Cary 630 FTIR
iTEM 软件	Olympus
质谱仪	Waters	Micromass MALDI microMX MALDI Q-ToF
MF-MilliporeTM 膜过滤器（0.45/0.2μm 孔径）	Merck Millipore, UK	HAWP04700, GSWP04700
Micro BCA 蛋白检测试剂盒	ThermoFisher	23235
酶标仪	Beckman	Coulter-PARADIGM
质子与碳-13 核磁共振数据	Bruker	400 MHz AV-400 NMR 波谱仪
旋转蒸发仪	Buchi	R-114 旋转蒸发系统
一次性针头	Sterican	4665643
Suba-Seal 隔垫	Sigma Aldrich	Z124575
透射电子显微镜	Phillips	CM 100 TEM
紫外-可见分光光度计	Nanodrop	Nanodrop One/One C 微量