从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

摘要

本实验方案描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡，并对其表面抗原和蛋白载荷进行分析的方法。

摘要

循环和组织驻留的细胞外囊泡（EVs）作为新型诊疗生物标志物具有广阔前景，同时在维持机体稳态以及多种疾病的发生发展中发挥着重要作用。尽管当前研究主要聚焦于起源于内体的内源性外泌体，但由质膜出芽形成的微囊泡在健康与疾病状态中的重要性也日益受到关注，其特征在于富含能够重现亲本细胞膜特征的表面分子。本文介绍了一种基于差速离心法的可重复性操作流程，用于从血浆及骨等实体组织中分离和表征EVs。该方案进一步描述了对EVs表面抗原及其携带蛋白的分析方法，从而可追溯其来源并鉴定与潜在功能相关的组分。该方法将有助于在生物学、生理学和病理学研究中对EVs进行相关性、功能性和机制性分析。

引言

细胞外囊泡（EVs）被定义为细胞释放的、由脂质双层膜包裹的细胞外结构¹，其在多种生理和病理过程中发挥重要作用²。健康细胞释放的EVs大致可分为两类：一类是通过细胞内吞作用途径形成的外泌体（或小EVs）³，另一类是通过细胞质膜向外出芽形成的微囊泡（或大EVs）⁴。尽管许多研究集中于体外培养细胞收集的EVs功能in vitro⁵，但来源于循环系统或组织的EVs更为复杂且具有异质性，其优势在于能够真实反映生物体内的实际状态in vivo⁶。此外，几乎所有类型的组织在体内均可产生EVs in vivo，这些EVs可在组织内部充当信使，或通过各种体液（尤其是外周血）进行转移，从而实现系统性通讯⁷。循环系统和组织中的EVs也是疾病诊断和治疗的重要靶点⁸。

尽管近年来外泌体已被广泛研究，微囊泡也具有重要的生物学功能，并且无需超速离心即可轻松提取，从而促进了基础与临床研究⁹。值得注意的是，从循环系统和组织中分离出的细胞外囊泡（EVs）存在一个关键问题，即它们来源于不同类型的细胞¹⁰。由于微囊泡是由质膜出芽形成，且富含细胞表面分子⁹，因此利用亲代细胞的膜标志物来鉴定这些EVs的细胞来源是可行的。具体而言，可应用流式细胞术（FC）检测膜标志物。此外，研究人员还可分离EVs，并基于其功能分子 cargo 进行进一步分析。

本方案提供了从细胞外囊泡（EVs）中提取并进行表征的完整操作流程 体内 样品。EVs 被分离 通过 差速离心，以及细胞外囊泡（EVs）的表征包括形态学鉴定 通过 纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM），来源分析 通过 FC 及蛋白质货物分析 通过 western blot。以小鼠的血液血浆和上颌骨作为代表性样本。研究人员可参考本方案处理其他来源的EVs，并进行相应的调整。

方案

动物实验严格按照第四军医大学机构动物护理和使用委员会指南以及ARRIVE指南进行。本研究采用8周龄的C57Bl/6小鼠（对雌雄无偏好）。分离血浆和组织EV的步骤如图1所示。以血浆为代表，描述从体液中分离EV的操作流程；以上颌骨为代表，说明从固体组织中分离EV的操作流程。

1. 血浆和上颌骨样本的制备

1. 按照以下步骤准备血浆样本。
   1. 使用标准实验室天平测定小鼠的体重。
   2. 向1.5 mL离心管中加入20 µL、2 mg/mL的肝素，并使用混匀仪（见材料表）使肝素附着于管壁。
      注意：也可直接使用抗凝管采集血液。
   3. 通过腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠（见材料表）对小鼠进行麻醉。用拇指和食指抓住小鼠颈部，用小指固定尾巴和左后肢，暴露腹部后使用1 mL注射器注射戊巴比妥钠。
   4. 通过捏压足垫，确认小鼠角膜反射和肢体反应消失，以判断其是否已充分麻醉。
   5. 使用弯头剪刀剃除眼部周围及睫毛处的毛发。
   6. 抓住小鼠颈部皮肤，将眼部周围的皮肤向后颈部按压，使眼球突出。使用眼科镊迅速夹住眼球，并用步骤1.1.2中准备的1.5 mL离心管收集流出的血液。通过颈椎脱臼法处死小鼠。
      警告：注意毛发和睫毛，因其可能引起溶血。
   7. 轻轻将离心管上下颠倒数次，以防止血液凝固。
      警告：应尽快将离心管上下颠倒。
   8. 在4 °C条件下，以1,200 × g离心15分钟。
   9. 小心将上清液转移至新的洁净1.5 mL离心管中，立即使用血浆样本，或在4 °C下保存数小时。
   10. 用等体积的1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释上清液，并充分混匀。
       ​注意：上述采集血浆的方案为致死性操作。也可通过锁骨下静脉穿刺¹¹采集血液，无需处死小鼠。
2. 按照以下步骤准备上颌骨样本。
   1. 使用眼科镊和剪刀分离上颌骨，并用PBS冲洗，借助镊子去除软组织。
   2. 将上颌骨放入1.5 mL离心管中，用剪刀剪成小块（直径需小于1 mm），加入适量Liberase（5 µg/mL，见材料表）覆盖组织（通常8周龄小鼠的骨样本使用1 mL），在37 °C孵育30分钟。
   3. 在4 °C条件下，以800 × g离心10分钟。
   4. 用移液器小心将上清液转移至新的洁净1.5 mL离心管中。

2. 外泌体的提取

1. 将步骤 1.1.10 和步骤 1.2.4 中制备的样品在 2,500 × g 条件下于 4 °C 离心 15 分钟，以去除大块细胞碎片和残留的血小板。
2. 小心将上清液转移至新的洁净 1.5 mL 离心管中，并在 16,800 × g 条件下于 4 °C 离心 30 分钟。
   注意：离心速度可设置为超过 10,000 × g 以提取 EVs¹²。离心速度越高，获得的 EVs 数量越多。由于我们所用离心机的速度上限为 16,800 × g（见材料表），因此本方案中选择此速度。
3. 弃去上清液，每管沉淀物用 1 mL PBS 重悬。在 16,800 × g 条件下于 4 °C 离心 30 分钟。
4. 弃去上清液，每管沉淀物用 50 µL PBS 重悬。样品可在 4 °C 保存不超过 24 小时，但最好立即用于后续分析（步骤 3–5）。
   ​警告：不可在 -80 °C 保存，因为这会降低 EVs 的浓度并增加 EVs 的粒径¹³，从而影响后续对 EVs 的分析。

3. 细胞外囊泡的形态学鉴定

1. 进行NTA分析。
   1. 根据EVs的量（大致通过沉淀物的大小判断，50 µL血浆的颗粒为最低量），取5-50 µL重悬液（步骤2.4），用0.22 µm滤器过滤的PBS缓冲液稀释至10 mL，并用1 mL移液枪头充分混匀。将此最终悬液用于颗粒检测。
   2. 使用无菌1 mL注射器以适中且恒定的速度注入至少5 mL蒸馏水，直至检测界面显示的颗粒数少于5个。
      注意：当通过整个通道注入1 mL蒸馏水后，检测界面上会直接显示颗粒数量。如果颗粒数仍超过5个，则继续每次注入1 mL蒸馏水，直至满足标准。
   3. 将1 µL校准液溶于1 mL蒸馏水中，配制成原液，再取100 µL原液加入25 mL蒸馏水中，制备标准储备液（1:250,000）。将此工作试剂在4 °C保存，可使用1周。
   4. 使用标准储备液（步骤3.1.3）对NTA仪器进行校准。用1 mL无菌注射器注入1-5 mL工作校准液，冲洗仪器通道，直至检测界面显示的颗粒数在50-400之间（理想值约为300）。运行校准程序。
   5. 每次样品检测前，重复步骤3.1.2以冲洗仪器通道。
   6. 使用无菌1 mL注射器以恒定速度注入至少2 mL缓冲液冲洗仪器通道，直至检测界面显示的颗粒数少于10个。
   7. 以适中且恒定的速度（推荐速度为0.5-1 mL/s）注入1 mL步骤3.1.1制备的EV样品。
      注意：最佳颗粒浓度应使检测界面显示的颗粒数在50-400范围内，理想值约为300。若颗粒数过高，应立即重复步骤3.1.2冲洗仪器通道，以避免颗粒在通道壁上滞留，并根据步骤3.1.1调整EV样品浓度，然后从步骤3.1.5重新开始。
   8. 按照制造商说明书进行颗粒分析，并生成分析报告（见材料表）。
   9. 若样品珍贵，可用1 mL注射器将EV样品泵回，并收集至1.5 mL离心管中。重复步骤2.2提取EVs。
   10. 检测完所有样品后，向仪器通道注入至少2 mL缓冲液，再注入至少5 mL蒸馏水，直至检测界面显示的颗粒数少于5个。
   11. 使用无菌5 mL注射器以恒定速度（推荐速度为1 mL/s）注入至少10 mL空气，以清除通道中的水分。
2. 进行TEM分析。
   注意：以下步骤需使用新鲜的EV重悬液。Formvar-碳涂层电子显微镜载网有两面，工作面为中央网格发亮的一面。用于本实验流程提取EVs的最低血浆体积为50 µL。
   1. 将EV样品（步骤2.4）与等体积的4%多聚甲醛（PFA）混合。取4 µL EVs滴加于一张载网上，在室温（RT）孵育15分钟。
   2. 在聚乙烯薄膜上放置四滴PBS（每滴等于50 µL）（见材料表）。用洁净的显微镊子转移载网，并将载网的工作面依次在各滴PBS中清洗。
   3. 用滤纸吸除载网上残留的多余PBS。
   4. 将载网的工作面浸入1%磷钨酸（见材料表）中2分钟，然后重复步骤3.2.2。
      警告：由于磷钨酸具有毒性，该操作必须在通风橱中进行，且废弃的磷钨酸需专门回收，不得直接丢弃。
   5. 将载网正面朝上放置于铺有滤纸的10 cm培养皿中。载网可在室温下保存数年。
   6. 按照制造商说明书在电子显微镜下观察载网（见材料表）。
      ​注意：为确保观察到单个颗粒，必须调整EVs的浓度，且悬液应澄清无明显浑浊。滴样前应充分混匀样品。代表性TEM和NTA分析结果见图2。

4. 细胞外囊泡（EVs）的来源分析

注意：确定细胞外囊泡（EVs）的细胞来源需要使用典型细胞膜标志物的抗体。进行以下操作步骤所需的血浆最小体积为 300 µL。基于 EVs 的脂质双分子层结构，可使用膜染料对其进行标记。对于血液血浆样本，选择淋巴细胞标志物 CD18¹⁴ 作为代表；对于上颌骨样本，则以破骨细胞相关受体（osteoclast-associated receptor, OSCAR）作为破骨细胞的示例¹⁵。在进行流式细胞术（FC）之前，需确保流式细胞仪已针对 EVs 检测进行了适配¹⁶，因为不同流式细胞仪对检测下限尺寸的要求存在显著差异。

1. 将样品（步骤 2.4）用 500 µL PBS 重悬，取 50 µL 转移至新的洁净 1.5 mL 离心管中作为空白对照（管 A），另取 50 µL 转移至另一新的洁净 1.5 mL 离心管中作为 FITC 简单染色管（管 B）。向原管中加入 0.5 µL 膜染料用于膜染色，室温孵育 5 分钟。
2. 将主离心管在16,800 x g条件下离心30分钟 g （4 °C）。弃去上清液，用 200 µL PBS 重悬沉淀。
3. 将每个50 µL样品均分至四个1.5 mL离心管中，分别用于PE染色管（C管）、表面标志物染色（D管）和仅二抗对照（E管）。
4. 在骨EV样本中加入OSCAR的一抗，在血浆EV样本中加入CD18抗体（参见 材料表将溶液分别加入 B 管（步骤 4.1）和 D 管（步骤 4.3）中（稀释比例为 1:100）。在 4 °C 下孵育 1 小时。
5. 将离心管在16,800 x g条件下离心30分钟 g （4 °C）。弃去上清液，用 500 µL PBS 重悬沉淀，然后在 16,800 x g 条件下再次离心 30 分钟 g （4 °C）以去除多余的一抗。
6. 弃去上清液，用 50 µL PBS 重悬沉淀，随后加入 FITC 标记的二抗（参见 材料表），分别按1:200稀释（E管）。向B管（步骤4.1）和D管（步骤4.3）中加入相同的二抗。所有管于4 °C避光孵育1小时。
   注意：也可使用直接荧光标记的抗体进行流式细胞术检测，但需设置相应的同型对照。
7. 稀释一滴0.2、0.5和1 µm的微球（参见 材料表) 悬浮液分别加入1 mL PBS中，先依次检测各尺寸的微球，以确认用于EVs的设门范围。使用适当的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），设置流式细胞仪的阈值，用于寻找微球和EV群体。
   1. 将终止条件设置为计算100,000个膜染色颗粒。分析样品 通过 根据制造商说明使用流式细胞仪（参见 材料表。代表性结果如图所示 图3.
      ​注意：具有荧光通道的NTA设备也可用于来源分析，其样品制备方法与FC相同。

5. 细胞外囊泡蛋白质含量分析

注意：EVs 中蛋白质含量的分析操作如下进行 通过 western blot。例如，选择血浆和骨来源的细胞外囊泡（EVs）来分析6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）和丙酮酸激酶M2（PKM2）以评估代谢状态。Golgin84（高尔基体标志物）用作阴性对照，Flotillin（膜蛋白）、Caveolin（小窝蛋白的整合膜蛋白）和β-actin（细胞骨架蛋白）¹⁷ 作为细胞样本的阳性对照用于EVs分析。选择Mitofilin和α-Actinin-4作为大EV标志物，而CD9和CD81作为小EV标志物，以示EV亚群的存在。¹⁸Apoa1被选作血浆脂蛋白颗粒的标志物¹⁹有关相应试剂的详细信息，请参见 材料表.

1. 将沉淀（步骤 2.4）重悬于 50 µL RIPA 裂解缓冲液中，冰上孵育 30 分钟。
2. 按照制造商说明书，使用 BCA 蛋白检测试剂盒在 96 孔微孔板中测定所有样品的蛋白浓度（参见材料表）。
   1. 用 0.9% 的生理盐水（NS）（含 0.9% (w/v) 氯化钠）将 2 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）稀释至 0.5 mg/mL。将 0.5 mg/mL 的 BSA 和 0.9% NS 按照表 1所示体积分别加入三个重复孔中。
   2. 取 2 µL 样品（步骤 5.1）分别加入含 18 µL NS 的三个重复孔中。
   3. 通过将 BCA 试剂 A 与试剂 B 按 50:1 的比例混合配制工作液。每孔加入 200 µL 工作液，轻轻振荡 30 秒。
   4. 将 96 孔微孔板在 37 °C 孵育 20–25 分钟。
   5. 使用分光光度计在 596 nm 处测定吸光度（OD）（参见材料表）。
   6. 导出数据。
   7. 绘制标准曲线并计算样品的蛋白浓度。
3. 根据测定结果，用 0.9% NS 和 5× SDS-PAGE 上样缓冲液（250 mM Tris·HCl，pH 6.8，10% SDS，30% (v/v) 甘油，10 mM DTT，0.05% (w/v) 溴酚蓝，参见材料表）将样品稀释至 1 µg/µL。用封口膜密封管口，在 100 °C 加热 5 分钟。
4. 将样品和蛋白 Marker 加入浓度梯度为 4%–20% 的 Hepes-Tris 凝胶中（参见材料表）。
   注意：根据目标蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。
5. 在电泳缓冲液中以 80 V 电压电泳，直至蛋白条带连成一条线，然后切换至 120 V 继续电泳 1 小时，直至上样染料迁移至凝胶底部。
   注意：电泳时间可能因所用设备或凝胶类型及浓度不同而有所变化。
6. 将凝胶转移至已预先在甲醇中孵育 20 秒的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（参见材料表）上。使用湿转系统在 200 mA 条件下转膜 1 小时。
   警告：确保转膜系统中无气泡，并保持 PVDF 膜湿润。
   注意：转膜时间可能因目标蛋白分子量而异；通常每 1 KD 需要 1 分钟。
7. 在 50 mL 离心管中，将 2.5 g BSA（参见材料表）加入 50 mL Tris 缓冲盐水-Tween（TBST）（在 2 L PBS 溶液中加入 2 mL Tween）中，配制成 5% BSA 封闭缓冲液。振荡至粉末完全溶解。在室温下振荡封闭膜 2 小时。
8. 将膜与用 TBST 稀释至适当浓度的特异性一抗（Mitofilin，1:1000；α-Actinin-4，1:1000；CD9，1:1000；CD81，1:1000；Apoa1，1:1000；Golgin84，1:1000；Flotillin-1，1:1000；Caveolin-1，1:1000；PGD，1:1000；PKM2，1:1000；β-actin，1:3000）在 4 °C 过夜孵育。
9. 用洗涤缓冲液（在 2 L PBS 溶液中加入 2 mL Tween）洗涤膜 4 次，每次 15 分钟，然后在室温下振荡孵育合适的二抗（1:4000）1 小时。
10. 用洗涤缓冲液再次洗涤膜 4 次，每次 15 分钟，然后使用化学发光试剂盒和凝胶成像系统对膜进行成像（参见材料表）。

结果

根据实验流程，可以从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡（EVs）（图1）。一只8周龄小鼠的上颌骨质量约为0.1 ± 0.05 g，可从小鼠中收集约300 µL血浆。按照实验步骤操作后，分别可获得0.3 mg和3 µg的EVs。通过透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）分析，EVs典型的形态特征为圆形或杯状膜性囊泡，直径范围为50–300 nm（图2）。流式细胞术（FC）可在有效对照条件下检测膜染料标记的EVs，FC分析显示EVs表面特定膜标志物的表达百分比，提示其来源于亲代细胞（图3）。Western blot分析分别显示血浆EVs和骨组织EVs中PGD和PKM2的表达，代表其蛋白质组成，反映代谢状态（图4）。EVs中Golgin84呈阴性表达，同时可检测到Mitofilin、α-Actinin-4、Flotillin-1、Caveolin-1和β-actin的存在，这些蛋白通常富集于质膜...

讨论

在研究细胞外囊泡（EVs）的特征、命运和功能时，以高得率和低污染的方式分离EVs至关重要。目前存在多种EVs提取方法，例如密度梯度离心法（DGC）、尺寸排阻色谱法（SEC）和免疫捕获检测。^4,20这里采用了一种最常用的方法——差速离心法；该方法的优点在于耗时较短，能够从有限的样本中获得较高产量的细胞外囊泡（EVs），并易于分离，且可根据样本来源对方法进行优化。在分析循环EVs功能时，最好选择血浆，因为血浆能更真实地反映EVs的实际状态 体内，而非血清。这是因为在采集血清的过程中，凝血过程会释放大量血小板来源的细胞外囊泡（EVs）²¹，而血小板被去除 通过 血浆外泌体分离前的离心步骤²²需要注意的是，用于血浆EV分离的抗凝剂选择仍存在争议。肝素的抗凝机制更接近生理状态，因此通过该方法分离得到的EV可能更能反映体内的真实情况 体内 状态。必须指出，肝素会导致PCR出现假阴性结果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	Biosharp	143174	透射电子显微镜
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔二抗	Yeason	34306ES60	流式细胞术
Alexa Fluor 488 标记的兔抗山羊二抗	Invitrogen	A11008	流式细胞术
抗 CD18 抗体	Abcam	ab131044	流式细胞术
抗 CD81 抗体	Abcam	ab109201	Western blot
抗 CD9 抗体	Huabio	ET1601-9	Western blot
抗 Mitofilin 抗体	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 兔多克隆抗体	Abclone	A14211	Western blot
BCA 蛋白定量试剂盒	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye 预染蛋白 Marker	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
牛血清白蛋白	MP Biomedical	218072801	Western blot
Caveolin-1 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask Orange 细胞膜染料	Invitrogen	C10045	流式细胞术
化学发光试剂	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
弯头手术剪	JZ 外科器械	J21040	EV 分离
电子天平	智科	ZK-DST	EV 分离
Epoch 全波长酶标仪	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf 离心管	Eppendorf	3810X	EV 分离
Flotillin-1 抗体	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
凝胶成像系统	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
载网 - 200 目 Formvar/碳膜铜网	Polysciences	24915	透射电子显微镜
肝素溶液	StemCell	7980	EV 分离
Liberase 研究级酶	Sigma-Aldrich	5401127001	EV 分离
显微镊子	JZ 外科器械	JD1020	EV 分离
NovoCyte 流式细胞仪	ACEA	N/A	流式细胞术
Omni-PAGE Hepes-Tris 凝胶（Hepes 4~20%，10 孔）	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR(D-19) 抗体	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	流式细胞术
PBS (2x)	ZHHC	PW013	Western blot
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	57-33-0	麻醉
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	Western blot
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	Western blot
磷钨酸	RHAWN	12501-23-4	透射电子显微镜
PKM2(d78a4) xp 兔单克隆抗体	Cell Signaling	4053t	Western blot
聚乙烯（PE）膜	湘仪	200150055	透射电子显微镜
聚偏二氟乙烯膜	Roche	3010040001	Western blot
蛋白酶抑制剂	Roche	4693132001	Western blot
重组抗 PGD 抗体	Abcam	ab129199	Western blot
RIPA 裂解缓冲液	Beyotime	P0013	Western blot
SDS-PAGE 上样缓冲液 (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
粒径标准微球	Invitrogen	F13839	流式细胞术
台式高速微量离心机	Hitachi	CT15E	EV 分离
透射电子显微镜	HITACHI	H-7650	透射电子显微镜
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Vortex Mixer Genie 涡旋混合器	Scientific Industries	SI0425	EV 分离
ZetaView BASIC NTA - 纳米颗粒追踪分析视频显微镜 PMX-120	Particle Metrix	N/A	纳米颗粒追踪分析
α-Actinin-4 兔单克隆抗体	Abclone	A3379	Western blot
β-actin	Cwbio	CW0096M	Western blot