本实验方案描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡，并对其表面抗原和蛋白载荷进行分析的方法。
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方法文章
从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
循环和组织驻留的细胞外囊泡（EVs）作为新型诊疗生物标志物具有广阔前景，同时在维持机体稳态以及多种疾病的发生发展中发挥着重要作用。尽管当前研究主要聚焦于起源于内体的内源性外泌体，但由质膜出芽形成的微囊泡在健康与疾病状态中的重要性也日益受到关注，其特征在于富含能够重现亲本细胞膜特征的表面分子。本文介绍了一种基于差速离心法的可重复性操作流程，用于从血浆及骨等实体组织中分离和表征EVs。该方案进一步描述了对EVs表面抗原及其携带蛋白的分析方法，从而可追溯其来源并鉴定与潜在功能相关的组分。该方法将有助于在生物学、生理学和病理学研究中对EVs进行相关性、功能性和机制性分析。
引言
细胞外囊泡（EVs）被定义为细胞释放的、由脂质双层膜包裹的细胞外结构1，其在多种生理和病理过程中发挥重要作用2。健康细胞释放的EVs大致可分为两类：一类是通过细胞内吞作用途径形成的外泌体（或小EVs）3，另一类是通过细胞质膜向外出芽形成的微囊泡（或大EVs）4。尽管许多研究集中于体外培养细胞收集的EVs功能in vitro5，但来源于循环系统或组织的EVs更为复杂且具有异质性，其优势在于能够真实反映生物体内的实际状态in vivo6。此外，几乎所有类型的组织在体内均可产生EVs in vivo，这些EVs可在组织内部充当信使，或通过各种体液（尤其是外周血）进行转移，从而实现系统性通讯7。循环系统和组织中的EVs也是疾病诊断和治疗的重要靶点8。
尽管近年来外泌体已被广泛研究，微囊泡也具有重要的生物学功能，并且无需超速离心即可轻松提取，从而促进了基础与临床研究9。值得注意的是，从循环系统和组织中分离出的....
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方案
动物实验严格按照第四军医大学机构动物护理和使用委员会指南以及ARRIVE指南进行。本研究采用8周龄的C57Bl/6小鼠（对雌雄无偏好）。分离血浆和组织EV的步骤如图1所示。以血浆为代表，描述从体液中分离EV的操作流程；以上颌骨为代表，说明从固体组织中分离EV的操作流程。
1. 血浆和上颌骨样本的制备
- 按照以下步骤准备血浆样本。
- 使用标准实验室天平测定小鼠的体重。
- 向1.5 mL离心管中加入20 µL、2 mg/mL的肝素，并使用混匀仪（见材料表）使肝素附着于管壁。
注意：也可直接使用抗凝管采集血液。 - 通过腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠（见材料表）对小鼠进行麻醉。用拇指和食指抓住小鼠颈部，用小指固定尾巴和左后肢，暴露腹部后使用1 mL注射器注射戊巴比妥钠。
- 通过捏压足垫，确认小鼠角膜反射和肢体反应消失，以判断其是否已充分麻醉。
- 使用弯头剪刀剃除眼部周围及睫毛处的毛发。
- 抓住小鼠颈部皮肤，将眼部周围的皮肤向后颈部按压，使眼球突出。使用眼科镊迅速夹住眼球，并用步骤1.1.2中准备的1.5 mL离心管收集流出的血液。通过颈椎脱臼法处死小鼠。
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结果
根据实验流程，可从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡（EVs）（图1）。一只8周龄小鼠的上颌骨质量约为0.1 ± 0.05 g，可从小鼠体内收集约300 µL血浆。按照实验方案步骤，分别可获得0.3 mg和3 µg的EVs。通过透射电镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）分析，EVs典型的形态特征为圆形或杯状膜性囊泡，直径范围为50–300 nm（图2）。流式细胞术（FC）可在有效对照条件下检测膜染料标记的EVs，FC分析显示EVs表面特定膜标志物的表达百分比，提示其来源于母细胞（图3）。Western blot分析分别显示血浆EVs和骨EVs中前列腺素D合成酶（PGD）和丙酮酸激酶M2型（PKM2）的表达，代表其蛋白质组成，反映代谢状态（图4）。EVs中Golgin84呈阴性表达，同时可检测到Mitofilin、α-Actinin-4、Flotillin-1、Caveolin-1和β-actin的存.......
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讨论
在研究细胞外囊泡（EVs）的特征、命运和功能时，以高得率和低污染的方式分离EVs至关重要。目前存在多种EVs提取方法，例如密度梯度离心法（DGC）、尺寸排阻色谱法（SEC）和免疫捕获检测。4,20这里采用了一种最常用的方法——差速离心法；该方法的优点在于耗时较短，能够从有限的样本中获得较高产量的细胞外囊泡（EVs），并易于分离，且可根据样本来源对方法进行优化。在分析循环EVs功能时，最好选择血浆，因为血浆能更真实地反映EVs的实际状态 体内，而非血清。这是因为在采集血清的过程中，凝血过程会释放大量血小板来源的细胞外囊泡（EVs）21，而血小板被去除 通过 血浆外泌体分离前的离心步骤22需要注意的是，用于血浆EV分离的抗凝剂选择仍存在争议。肝素的抗凝机制更接近生理状态，因此通过该方法分离得到的EV可能更能反映体内的真实情况 体内 状态。必须指出，肝素会导致PCR出现假阴性结果.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（32000974、81870796、82170988 和 81930025）以及中国博士后科学基金（2019M663986 和 BX20190380）的资助。我们感谢国家基础医学实验教学示范中心（AMFU）提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | Biosharp | 143174 | 透射电子显微镜 |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔二抗 | Yeason | 34306ES60 | 流式细胞术 |
| Alexa Fluor 488 标记的兔抗山羊二抗 | Invitrogen | A11008 | 流式细胞术 |
| 抗 CD18 抗体 | Abcam | ab131044 | 流式细胞术 |
| 抗 CD81 抗体 | Abcam | ab109201 | Western blot |
| 抗 CD9 抗体 | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| 抗 Mitofilin 抗体 | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 兔多克隆抗体 | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye 预染蛋白 Marker | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| 牛血清白蛋白 | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange 细胞膜染料 | Invitrogen | C10045 | 流式细胞术 |
| 化学发光试剂 | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| 弯头手术剪 | JZ 外科器械 | J21040 | EV 分离 |
| 电子天平 | 智科 | ZK-DST | EV 分离 |
| Epoch 全波长酶标仪 | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf 离心管 | Eppendorf | 3810X | EV 分离 |
| Flotillin-1 抗体 | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| 凝胶成像系统 | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| 载网 - 200 目 Formvar/碳膜铜网 | Polysciences | 24915 | 透射电子显微镜 |
| 肝素溶液 | StemCell | 7980 | EV 分离 |
| Liberase 研究级酶 | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV 分离 |
| 显微镊子 | JZ 外科器械 | JD1020 | EV 分离 |
| NovoCyte 流式细胞仪 | ACEA | N/A | 流式细胞术 |
| Omni-PAGE Hepes-Tris 凝胶（Hepes 4~20%，10 孔） | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | 流式细胞术 |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | 麻醉 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| 磷钨酸 | RHAWN | 12501-23-4 | 透射电子显微镜 |
| PKM2(d78a4) xp 兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| 聚乙烯（PE）膜 | 湘仪 | 200150055 | 透射电子显微镜 |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Roche | 3010040001 | Western blot |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 4693132001 | Western blot |
| 重组抗 PGD 抗体 | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA 裂解缓冲液 | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE 上样缓冲液 (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| 粒径标准微球 | Invitrogen | F13839 | 流式细胞术 |
| 台式高速微量离心机 | Hitachi | CT15E | EV 分离 |
| 透射电子显微镜 | HITACHI | H-7650 | 透射电子显微镜 |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie 涡旋混合器 | Scientific Industries | SI0425 | EV 分离 |
| ZetaView BASIC NTA - 纳米颗粒追踪分析视频显微镜 PMX-120 | Particle Metrix | N/A | 纳米颗粒追踪分析 |
| α-Actinin-4 兔单克隆抗体 | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
参考文献
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C.
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重印与许可
