方法文章

从血浆和实体组织中分离和分析可追溯和功能化的细胞外囊泡

DOI:

10.3791/63990

2022年10月17日

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本协议描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡的方法,随后对表面抗原和蛋白质货物进行分析。

摘要

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

循环和组织驻留的细胞外囊泡(EVs)作为新型治疗诊断生物标志物代表了有希望的靶标,它们成为维持机体稳态和广泛疾病进展的重要参与者。虽然目前的研究重点是具有内体起源的内源性外泌体的特征,但从质膜中起泡的微囊泡在健康和疾病中越来越受到关注,其特征是丰富的表面分子概括了亲本细胞的膜特征。在这里,提出了一种基于差速离心的可重复程序,用于从血浆和实体组织(例如骨骼)中提取和表征EV。该协议进一步描述了电动汽车表面抗原和蛋白质货物的后续分析,因此可以追溯其衍生物,并识别与潜在功能相关的组件。该方法将有助于在生物学、生理学和病理学研究中对 EV 进行相关、功能和机理分析。

引言

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已经提出细胞外囊泡(EV)来定义细胞释放的脂质双层封闭的细胞外结构1,其在各种生理和病理事件中起重要作用2。健康细胞释放的EV大致可分为两大类,即通过细胞内内吞运输途径3形成的外泌体(或小EV)和细胞质膜向外出芽形成的微囊泡(或大EV)4。虽然许多研究集中在体外5中从培养细胞中收集的EV的功能,但来自循环或组织的EV更加复杂和异质,其优点是反映了体内生物的真实状态6。此外,几乎所有种类的组织都可以在体内产生EV,这些EV可以作为组织内的信使或通过各种体液(尤其是外周血)转移,以促进全身交流7。循环和组织中的电动汽车也是疾病诊断和治疗的目标8

近年来,外泌体的研究深入,微囊泡也具有重要的生物学功能,无需超速离心即可轻松提取,从而促进了基础和临床研究9。值得注意的是,关于从循环和组织中分离的EV的一个关键问题是它们来自不同的细胞类型10。由于微囊泡从质膜中吹出并具有丰富的细胞表面分子9,因此使用亲本细胞膜标记物来鉴定这些EV的细胞起源是可行的。具体而言,流式细胞术(FC)技术可用于检测膜标志物。此外,研究人员可以分离电动汽车并根据功能货物进行进一步分析。

本协议为从体内样品中提取和表征EV提供了全面的程序。EV通过差速离心分离,EV的表征包括通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)和透射电子显微镜(TEM)进行形态学鉴定,通过FC进行原产地分析,以及通过蛋白质印迹进行蛋白质货物分析。以小鼠的血浆和上颌骨为代表。研究人员可以参考其他来源的电动汽车的该协议并进行相应的修改。

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方案

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动物实验按照《第四军医大学机构动物护理使用委员会指南》和《ARRIVE指南》进行。在本研究中,使用8周龄的C57Bl / 6小鼠(对雌性或雄性都没有偏好)。分离血浆和组织EV所涉及的步骤如图 1所示。血浆以代表描述EV从体液中分离的过程。以上颌骨为代表,解释EV与实体组织的分离过程。

1. 血浆和上颌骨样本的制备

  1. 按照以下步骤制备血浆样品。
    1. 使用标准实验室天平确定小鼠的体重。
    2. 将 20 μL、2 mg/mL 肝素加入 1.5 mL 离心管中,并使用混合器装置(参见 材料表)让肝素附着在管壁上。
      注意:抗凝管也可以直接用于收集血液。
    3. 通过腹膜内注射50mg / kg戊巴比妥钠麻醉小鼠(见 材料表)。用拇指和食指抓住小鼠的脖子,然后用小指固定尾巴和左后腿,露出腹部后用1mL注射器注射戊巴比妥钠。
    4. 根据捏住脚垫时没有角膜反射和肢体反应,确认鼠标已正确麻醉。
    5. 用弯曲的剪刀剃掉脸上的头发和眼睛的睫毛。
    6. 抓住鼠标的颈部皮肤,将眼睛周围的皮肤按到脖子后面,使眼球突出。使用眼科镊子快速夹住眼球,并用步骤1.1.2中制备的1.5 mL离心管收集血液流出。通过使颈椎脱臼来牺牲小鼠。
      注意:小心头发和睫毛,因为它们可能会导致溶血。
    7. 轻轻地将管子倒置几次以防止血液凝固。
      注意:尽快将管子倒置。
    8. 在4°C下以1,200× g 离心血液样品15分钟。
    9. 小心地将上清液转移到新的清洁的1.5mL离心管中,并立即使用血浆样品或在4°C下储存数小时。
    10. 用等体积的1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释上清液并充分混合。
      注意:上面提供的收集血浆的方案是致命的。血液也可以通过锁骨下静脉穿刺11 收集,而不会牺牲小鼠。
  2. 按照以下步骤准备上颌骨样本。
    1. 用眼科镊子和剪刀分离上颌骨,并用PBS清洗,用镊子去除软组织。
    2. 将上颌骨放入 1.5 mL 离心管中,用剪刀将骨切成小块(直径必须小于 1 毫米)。加入一定量的Libase(5μg/ mL,参见 材料表)以覆盖组织(对于来自8周龄小鼠的骨样品通常为1mL),然后在37°C下孵育30分钟。
    3. 将样品在4°C下以800× g 离心10分钟。
    4. 用移液管小心地将上清液转移到新的清洁的1.5 mL离心管中。

2. 电动汽车的提取

  1. 将样品(在步骤1.1.10和步骤1.2.4中制备)在2,500×g(4°C)下离心15分钟,以除去大的细胞碎片和剩余的血小板。
  2. 小心地将上清液转移到新的清洁的1.5mL离心管中,并在16,800× g (4°C)下离心30分钟。
    注意:离心速度可以设置为超过 10,000 x g 以提取 EV12。离心机的速度越高,可以获得的EV数量就越多。由于我们使用的离心机的速度限制为16,800 x g (参见 材料表),因此我们在此协议中选择了此速度。
  3. 弃去上清液,并用 1 mL PBS 重悬每个管中的沉淀。在16,800× g (4°C)下离心30分钟。
  4. 弃去上清液,用 50 μL PBS 重悬于每个管中。将这些样品在4°C下储存少于24小时,或优选立即用于以下分析(步骤3-5)。
    注意:在-80°C下储存是不可接受的,因为这会降低EV的浓度并增加EV的粒径13,从而影响以下EV分析。

3. 电动汽车的形态鉴定

  1. 执行 NTA 分析。
    1. 根据EV的量(大致根据颗粒的大小判断,50μL血浆的颗粒最小),转移5-50μL重悬(步骤2.4),在10 mL缓冲溶液中稀释(PBS用0.22μm过滤器过滤),并与1 mL微量移液器吸头充分混合。使用这种最终悬浮液进行颗粒测量。
    2. 使用无菌 1 mL 注射器以中等和恒定的速度注入至少 5 mL 蒸馏水,直到检测界面上显示的颗粒数小于 5。
      注意:通过整个通道注入 1 mL 蒸馏水后,颗粒数直接显示在检测界面上。如果该数字仍超过5,请继续注射1 mL蒸馏水,直到满足标准。
    3. 将 1 μL 校准溶液复溶于 1 mL 蒸馏水中以生成一级溶液,然后将 100 μL 初级溶液与 25 mL 蒸馏水中制备标准储备溶液 (1:250,000)。将此工作试剂在4°C下储存1周。
    4. 用标准储备溶液校准NTA仪器(步骤3.1.3)。用 1 mL 无菌注射器注入 1-5 mL 的工作校准溶液以冲洗机器通道,直到检测界面上显示的颗粒数在 50-400 之间(最好在 300 左右)。运行校准程序。
    5. 重复步骤3.1.2,在每次样品测量前冲洗机器通道。
    6. 使用无菌 1 mL 注射器注入至少 2 mL 缓冲溶液以恒定速度冲洗机器通道,直到检测界面上显示的颗粒数小于 10。
    7. 以中等和恒定的速度(推荐速度为0.5-1 mL / s)注入步骤3.1.1中制备的1 mL EV样品。
      注意:最佳颗粒浓度是使检测界面上显示的颗粒数范围为50-400,优选在300左右。如果颗粒数量过多,重复步骤3.1.2立即冲洗机器通道,以避免颗粒滞留在通道壁上,并按步骤3.1.1调整EV样品的浓度,然后从步骤3.1.5开始重复。
    8. 根据制造商的说明进行颗粒分析并生成分析报告(参见 材料表)。
    9. 如果样品珍贵,请使用 1 mL 注射器回泵 EV 样品,并将其收集在 1.5 mL 离心管中。重复步骤 2.2 以提取 EV。
    10. 检测所有样品后,向机器通道注入至少2 mL缓冲溶液,然后注入至少5 mL蒸馏水,直到检测界面上显示的颗粒数小于5。
    11. 使用无菌 5 mL 注射器以恒定速度(推荐速度为 1 mL/s)注入至少 10 mL 空气以去除通道中的水分。
  2. 执行透射电镜分析。
    注意:使用新鲜的EV悬架执行以下步骤。formvar-carbon涂层电子显微镜网格有两面,工作面在中心网格中发光。在以下过程中,提取 EV 的最小血浆体积为 50 μL。
    1. 将EV样品(步骤2.4)与等体积的4%多聚甲醛(PFA)混合。将 4 μL EV 沉积在一个网格上,并在室温 (RT) 下孵育 15 分钟。
    2. 将四滴PBS(一滴等于50μL)放在聚乙烯薄膜上(见 材料表)。用干净的微型镊子转移网格,并在PBS中将网格的工作侧从一滴清洗到另一滴。
    3. 使用滤纸去除网格中残留的多余PBS。
    4. 将网格的工作侧孵育到1%磷钨酸(见 材料表)中2分钟,然后重复步骤3.2.2。
      注意:由于磷钨酸有毒,此过程需要在通风橱中操作,多余的磷钨酸需要专门回收而不是直接丢弃。
    5. 将网格面朝上放入覆盖有滤纸的 10 厘米培养皿中。网格可以在室温下存储数年。
    6. 按照制造商的说明在电子显微镜下观察网格(见 材料表)。
      注意:为确保观察到单个颗粒,必须调整EV的浓度,并且悬浮液需要清晰,没有明显的浊度。在滴下之前,样品应充分混合。代表性的TEM和NTA分析如图 2所示。

4. EV的产地分析

注意:鉴定EV的细胞来源需要对典型的细胞膜标志物应用抗体。在以下过程中,提取 EV 的最小血浆体积为 300 μL。 基于EV的脂质双层结构,可以使用膜染料来标记它们。对于血浆样品,选择淋巴细胞14 的CD18作为代表。对于上颌骨样本,选择破骨细胞15 的破骨细胞相关受体(OSCAR)作为示例。在FC之前,确保流式细胞仪适用于EVs16的测量,因为不同流式细胞仪之间的下限尺寸差异很大。

  1. 用 500 μL PBS 重悬样品(步骤 2.4),并将 50 μL 转移到新的清洁的 1.5 mL 离心管中作为空白对照(管 A),将另外 50 μL 转移到新的清洁 1.5 mL 离心管中作为 FITC(管 B)的简单染色管。向原管中加入 0.5 μL 膜染料进行膜染色。在室温下孵育5分钟。
  2. 将主管在16,800× g (4°C)下离心30分钟。弃去上清液并用 200 μL PBS 重悬沉淀。
  3. 将每个 50 μL 样品分成四个 1.5 mL 离心管,用于 PE(试管 C)、表面标志物染色(试管 D)和仅二抗对照(试管 E)的简单染色管。
  4. 将骨EV样品中的OSCAR一抗以及血浆EV样品中的CD18抗体(参见 材料表)分别添加到试管B(步骤4.1)和试管D(步骤4.3)(以1:100稀释)。在4°C孵育1小时。
  5. 将试管在16,800× g (4°C)下离心30分钟。弃去上清液,用500μLPBS重悬沉淀,然后在16,800× g (4°C)下再次离心30分钟以除去额外的一抗。
  6. 弃去上清液并用 50 μL PBS 重悬沉淀,然后分别加入 FITC 偶联的二抗(参见 材料表)(以 1:200 稀释)(管 E)。将相同的二抗添加到试管B(步骤4.1)和试管D(步骤4.3)中。将所有试管在4°C黑暗中孵育1小时。
    注意:直接荧光偶联标记抗体也可用于通过适当的同种型对照处理FC检测。
  7. 将一滴 0.2、0.5 和 1 μm 大小的珠子(参见 材料表)悬浮液分别稀释到 1 mL PBS 中,并首先运行每个尺寸的珠子以确保为 EV 选择的门。设置流式细胞仪的阈值,以使用合适的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)搜索磁珠和EV群。
    1. 将终端条件设置为计算 100,000 个膜染色颗粒。按照制造商的说明通过流式细胞仪 分析 样品(见 材料表)。代表性结果如图 3所示。
      注意:具有荧光通道的NTA设备也可用于来源分析,样品制备与FC相同。

5. 电动汽车的蛋白质含量分析

注意:EV内蛋白质含量的分析 是通过蛋白质印 迹进行的。例如,选择血浆和骨EV来分析6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)和丙酮酸激酶M2(PKM2)的代谢状态。与细胞样品相比,Golgin84(高尔基体细胞器)用作阴性对照,Floylin(膜蛋白)、Caveolin(洞穴的整合蛋白)和β-肌动蛋白(细胞骨架)17 被用作EV的阳性对照。Mitofilin和α-肌动蛋白-4被选为大的EV标志物,而CD9和CD81被选为小的EV标志物来证明EV亚群18。Apoa1被选为血浆脂质文章标记19。有关相应的试剂详细信息,请参阅 材料表

  1. 将沉淀(步骤2.4)重悬于50μL的RIPA裂解缓冲液中,并在冰上孵育30分钟。
  2. 按照制造商的说明,通过BCA蛋白质测定定量96孔微孔板中所有样品的蛋白质浓度(参见 材料表)。
    1. 将 2 mg/mL 的牛血清白蛋白 (BSA) 与 0.9% 的生理盐水 (NS)(含有 0.9% (w/v) 氯化钠)稀释到 0.5 mg/mL 中。将0.5 mg/mL的BSA和0.9%的NS加入到具有一定体积的三个重复孔中,如 表1所示。
    2. 滴下 2 μL 样品(步骤 5.1),并将 18 μL NS 分别加入三个重复孔中。
    3. 通过将BCA试剂A与试剂B(50:1试剂A:B)混合来制备工作溶液。 向每个孔中加入 200 μL 工作溶液并轻轻摇动 30 秒。
    4. 将96孔微孔板在37°C孵育20-25分钟。
    5. 用分光光度计测量596nm处的OD(见 材料表)。
    6. 导出数据。
    7. 绘制标准曲线并计算样品的蛋白质浓度。
  3. 根据结果,用0.9%的NS和5x SDS-PAGE上样缓冲液(250 mM Tris·盐酸,pH 6.8,10%SDS,30%(v / v)甘油,10 mM DTT,0.05%(w / v)溴酚蓝,见 材料表)。用薄膜密封管,并在100°C下加热5分钟。
  4. 将样品和蛋白质分子量标准加载到4%-20%Hepes-Tris凝胶的梯度浓度中(参见 材料表)。
    注意:根据目标蛋白质的分子量选择凝胶百分比。
  5. 在电泳缓冲液中以80 V电泳凝胶,直到蛋白质形成一条线,然后切换到120 V1小时,直到上样染料位于凝胶底部。
    注意:运行时间可能因所用设备或凝胶的类型和浓度而异。
  6. 将凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(参见 材料表)上,在甲醇中预孵育20秒。使用湿转印系统在200mA下转印1小时。
    注意: 确保传输系统内没有气泡,并保持 PVDF 膜湿润。
    注意:转印时间可能因目标蛋白的分子量而异;1 KD 通常需要 1 分钟。
  7. 通过将 2.5 g BSA(参见 材料表)加入 50 mL Tris 缓冲盐水吐温 (TBST)(2 mL 吐温添加到 2 L PBS 溶液中)到 50 mL 离心管中来制备 5% BSA 封闭缓冲液。搅拌直至粉末溶解。在室温下搅拌将该缓冲液中的膜封闭2小时。
  8. 用TBST稀释的特异性一抗孵育膜至适当浓度(丝裂蛋白,1:1000;α-肌动蛋白-4,1:1000;CD9, 1:1000;CD81, 1:1000;阿波阿1, 1:1000;戈尔金84,1:1000;弗洛西林-1,1:1000;卡沃林-1,1:1000;PGD,1:1000;PKM2, 1:1000;β-肌动蛋白,1:3000)在4°C下过夜。
  9. 在洗涤缓冲液(2mL吐温加入2LPBS溶液)中洗涤膜四次(每次15分钟),并在室温下以1:4000在室温下搅拌将膜与合适的二抗孵育1小时。
  10. 在洗涤缓冲液中洗涤膜四次(每次15分钟),并使用化学发光试剂盒和凝胶成像系统对膜进行成像(参见 材料表)。

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结果

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

根据实验工作流程,可以从外周血和实体组织中提取EV(图1)。8周龄小鼠的上颌骨约为0.1±0.05g,可以从小鼠中收集约300μL血浆。按照协议步骤,可以分别收集0.3 mg和3 μg的EV。通过TEM和NTA分析,EV的典型形态特征是直径范围为50-300nm的圆形杯形膜囊泡(图2)。FC可以在有用的对照下检测膜染料标记的EV,FC分析显示了EV上表达的特定膜标志物的百分比,这意味着它们来自亲本细胞(图3)。蛋白质印迹分析显示PGD和PKM2的表达分别代表血浆EV和骨EV中的蛋白质含量,表明代谢状态(图4)。Golgin84 在 EV 中的阴性表达也通过存在丝裂蛋白、α-肌动蛋白-4、氟氏蛋白-1、Caveolin-1 和 β-肌动蛋白来检测,后者通常富集在质膜衍生的大 EV(微囊泡)中。也可以检测到小的EV标志物CD9,而CD81表达低或不存在,血浆EV中缺乏Apoa1(

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讨论

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在研究电动汽车的特性、命运和功能时,隔离高产量和低污染的电动汽车至关重要。有多种方法可以提取 EV,例如密度梯度离心 (DGC)、体积排阻色谱 (SEC) 和免疫捕获测定420。这里使用了最常用的方法之一,差速离心;这样做的优点是不耗时,它可以产生高产量的EV,易于从有限的样品中分离出来,并且能够根据所使用的样品源修改方法。为了分析循环EV的功能,最好选择血浆,这样可以更好地反映EV在体内的真实状态,而不是血清。这是因为许多血小板来源的EV将在凝块形成过程中释放以收集血清21,而在从血浆中分离EV之前通过离心去除血小板22。必须注意的是,血浆EV分离的抗凝选择仍然存在争议。肝素的抗凝血机制与生理学关系更密切;因此,分离的EV可能更能反映体内状态。必须提到的是,肝素会导致假阴性PCR读数并阻断细胞23<...

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披露

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作者没有利益冲突需要披露。

致谢

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了中国国家自然科学基金(32000974,81870796,82170988和81930025)和中国博士后科学基金(2019M663986和BX20190380)的资助。我们感谢国家基础医学实验教学示范中心(AMFU)的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% 多聚甲醛 Biosharp143174透射电子显微镜
Alexa fluor 488 抗山羊二抗Yeason34306ES60流式细胞术
Alexa fluor 488 抗兔二抗InvitrogenA11008流式细胞术
抗 CD18 抗体Abcamab131044流式细胞术
抗 CD81 抗体Abcamab109201Western blot
抗 CD9 抗体HuabioET1601-9Western blot
抗丝裂蛋白抗体Abcamab110329Western blot
APOA1 兔 pAbAbcloneA14211Western blot
BCA 蛋白检测试剂盒TIANGENPA115Western blot
BLUeye 预染蛋白分子量标准Sigma-Aldrich94964-500ULWestern blot
牛血清白蛋白MP 生物医学218072801Western blot
Caveolin-1 抗体Santa Cruz Biotechnologysc-53564Western blot
CellMask 橙色质膜染色InvitrogenC10045流式细胞术
化学发光Amersham BiosciencesN/AWestern blot
弯曲手术剪刀JZ 手术器械J21040EV 隔离
电子天平智科ZK-DSTEV 隔离
Epoch 分光光度计BioTekN/AWestern blot
Eppendorf 管Eppendorf3810XEV 分离
Flotillin-1 抗体PTM BIOPTM-5369Western blot
凝胶成像系统Tanon4600Western blot
Golgin84Novusnbp1-83352Western blot
网格 - Formvar/碳涂层 - 铜 200 目Polysciences24915透射电子显微镜
肝素溶液StemCell 7980EV 分离
Liberase 研究级Sigma-Aldrich5401127001EV 分离
显微镜镊子JZ 手术器械JD1020EV 分离
NovoCyte 流式细胞仪ACEAN/A流式细胞仪
Omni-PAGE Hepes-Tris 凝胶 Hepes 4~20%,10 孔EpizymeLK206Western blot
OSCAR(D-19) 抗体Santa Cruz BiotechnologySC-34235流式细胞术
PBS (2x)ZHHCPW013Western blot
戊巴比妥钠Sigma-Aldrich57-33-0麻醉
过氧化物酶 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG (H+L)Jacson115-035-003蛋白质印迹
过氧化物酶 AffiniPure 山羊抗兔 IgG (H+L)Jacson111-035-003Western blot
磷酸钨酸RHAWN12501-23-4透射电子显微镜
PKM2(d78a4) xp 兔  mAb Cell Signaling4053tWestern blot
聚乙烯 (PE) 膜Xiang yi200150055透射电子显微镜
聚偏二氟乙烯膜 罗氏3010040001Western 印迹
抑制剂罗氏4693132001蛋白质印迹
抗 PGD 抗体Abcamab129199蛋白质印迹
RIPA 裂解缓冲液BeyotimeP0013蛋白质印迹
SDS-PAGE 上样缓冲液 (5x)CwbioCW0027S蛋白质印迹
大小微珠InvitrogenF13839流式细胞术
台式高速微量离心机日立CT15EEV 分离
透射电子显微镜HITACHIH-7650透射电子显微镜
Tween-20MP Biomedicals19472Western blot
涡旋混合器 GenieScientific IndustriesSI0425EV 分离
ZetaView BASIC NTA - 纳米粒子示踪视频显微镜 PMX-120Particle MetrixN/A纳米粒子示踪分析
&α;-肌动蛋白-4 兔单克隆A3379Western blot
&β;-肌动蛋白CwbioCW0096MWestern blot
剂 蛋白酶重组抗体

参考文献

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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