从血浆和实体组织中分离和分析可追溯和功能化的细胞外囊泡

摘要

本协议描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡的方法，随后对表面抗原和蛋白质货物进行分析。

摘要

循环和组织驻留的细胞外囊泡（EVs）作为新型治疗诊断生物标志物代表了有希望的靶标，它们成为维持机体稳态和广泛疾病进展的重要参与者。虽然目前的研究重点是具有内体起源的内源性外泌体的特征，但从质膜中起泡的微囊泡在健康和疾病中越来越受到关注，其特征是丰富的表面分子概括了亲本细胞的膜特征。在这里，提出了一种基于差速离心的可重复程序，用于从血浆和实体组织（例如骨骼）中提取和表征EV。该协议进一步描述了电动汽车表面抗原和蛋白质货物的后续分析，因此可以追溯其衍生物，并识别与潜在功能相关的组件。该方法将有助于在生物学、生理学和病理学研究中对 EV 进行相关、功能和机理分析。

引言

已经提出细胞外囊泡（EV）来定义细胞释放的脂质双层封闭的细胞外结构¹，其在各种生理和病理事件中起重要作用²。健康细胞释放的EV大致可分为两大类，即通过细胞内内吞运输途径³形成的外泌体（或小EV）^和细胞质膜向外出芽形成的微囊泡（或大EV）4。虽然许多研究集中在体外⁵中从培养细胞中收集的EV的功能，但来自循环或组织的EV更加复杂和异质，其优点是反映了体内^生物体的真实状态6。此外，几乎所有种类的组织都可以在体内产生EV，这些EV可以作为组织内的信使或通过各种体液（尤其是外周血）转移，以促进^{全身交流7}。循环和组织中的电动汽车也是疾病诊断和治疗的目标⁸。

近年来，外泌体的研究深入，微囊泡也具有重要的生物学功能，无需超速离心即可轻松提取，从而促进了基础和临床研究⁹。值得注意的是，关于从循环和组织中分离的EV的一个关键问题是它们来自不同的细胞类型¹⁰。由于微囊泡从质膜中吹出并具有丰富的细胞表面分子⁹，因此使用亲本细胞膜标记物来鉴定这些EV的细胞起源是可行的。具体而言，流式细胞术（FC）技术可用于检测膜标志物。此外，研究人员可以分离电动汽车并根据功能货物进行进一步分析。

本协议为从体内样品中提取和表征EV提供了全面的程序。EV通过差速离心分离，EV的表征包括通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）进行形态学鉴定，通过FC进行原产地分析，以及通过蛋白质印迹进行蛋白质货物分析。以小鼠的血浆和上颌骨为代表。研究人员可以参考其他来源的电动汽车的该协议并进行相应的修改。

方案

动物实验按照《第四军医大学机构动物护理使用委员会指南》和《ARRIVE指南》进行。在本研究中，使用8周龄的C57Bl / 6小鼠（对雌性或雄性都没有偏好）。分离血浆和组织EV所涉及的步骤如图 1所示。血浆以代表描述EV从体液中分离的过程。以上颌骨为代表，解释EV与实体组织的分离过程。

1. 血浆和上颌骨样本的制备

1. 按照以下步骤制备血浆样品。
   1. 使用标准实验室天平确定小鼠的体重。
   2. 将 20 μL、2 mg/mL 肝素加入 1.5 mL 离心管中，并使用混合器装置（参见 材料表）让肝素附着在管壁上。
      注意:抗凝管也可以直接用于收集血液。
   3. 通过腹膜内注射50mg / kg戊巴比妥钠麻醉小鼠（见 材料表）。用拇指和食指抓住小鼠的脖子，然后用小指固定尾巴和左后腿，露出腹部后用1mL注射器注射戊巴比妥钠。
   4. 根据捏住脚垫时没有角膜反射和肢体反应，确认鼠标已正确麻醉。
   5. 用弯曲的剪刀剃掉脸上的头发和眼睛的睫毛。
   6. 抓住鼠标的颈部皮肤，将眼睛周围的皮肤按到脖子后面，使眼球突出。使用眼科镊子快速夹住眼球，并用步骤1.1.2中制备的1.5 mL离心管收集血液流出。通过使颈椎脱臼来牺牲小鼠。
      注意:小心头发和睫毛，因为它们可能会导致溶血。
   7. 轻轻地将管子倒置几次以防止血液凝固。
      注意:尽快将管子倒置。
   8. 在4°C下以1，200× g 离心血液样品15分钟。
   9. 小心地将上清液转移到新的清洁的1.5mL离心管中，并立即使用血浆样品或在4°C下储存数小时。
   10. 用等体积的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释上清液并充分混合。
       注意:上面提供的收集血浆的方案是致命的。血液也可以通过锁骨下静脉^穿刺11 收集，而不会牺牲小鼠。
2. 按照以下步骤准备上颌骨样本。
   1. 用眼科镊子和剪刀分离上颌骨，并用PBS清洗，用镊子去除软组织。
   2. 将上颌骨放入 1.5 mL 离心管中，用剪刀将骨切成小块（直径必须小于 1 毫米）。加入一定量的Libase（5μg/ mL，参见 材料表）以覆盖组织（对于来自8周龄小鼠的骨样品通常为1mL），然后在37°C下孵育30分钟。
   3. 将样品在4°C下以800× g 离心10分钟。
   4. 用移液管小心地将上清液转移到新的清洁的1.5 mL离心管中。

2. 电动汽车的提取

1. 将样品（在步骤1.1.10和步骤1.2.4中制备）在2，500×g（4°C）下离心15分钟，以除去大的细胞碎片和剩余的血小板。
2. 小心地将上清液转移到新的清洁的1.5mL离心管中，并在16，800× g （4°C）下离心30分钟。
   注意:离心速度可以设置为超过 10，000 x g 以提取 EV¹²。离心机的速度越高，可以获得的EV数量就越多。由于我们使用的离心机的速度限制为16，800 x g （参见 材料表），因此我们在此协议中选择了此速度。
3. 弃去上清液，并用 1 mL PBS 重悬每个管中的沉淀。在16，800× g （4°C）下离心30分钟。
4. 弃去上清液，用 50 μL PBS 重悬于每个管中。将这些样品在4°C下储存少于24小时，或优选立即用于以下分析（步骤3-5）。
   注意:在-80°C下储存是不可接受的，因为这会降低EV的浓度并增加EV的粒径¹³，从而影响以下EV分析。

3. 电动汽车的形态鉴定

1. 执行 NTA 分析。
   1. 根据EV的量（大致根据颗粒的大小判断，50μL血浆的颗粒最小），转移5-50μL重悬（步骤2.4），在10 mL缓冲溶液中稀释（PBS用0.22μm过滤器过滤），并与1 mL微量移液器吸头充分混合。使用这种最终悬浮液进行颗粒测量。
   2. 使用无菌 1 mL 注射器以中等和恒定的速度注入至少 5 mL 蒸馏水，直到检测界面上显示的颗粒数小于 5。
      注意:通过整个通道注入 1 mL 蒸馏水后，颗粒数直接显示在检测界面上。如果该数字仍超过5，请继续注射1 mL蒸馏水，直到满足标准。
   3. 将 1 μL 校准溶液复溶于 1 mL 蒸馏水中以生成一级溶液，然后将 100 μL 初级溶液与 25 mL 蒸馏水中制备标准储备溶液 （1:250，000）。将此工作试剂在4°C下储存1周。
   4. 用标准储备溶液校准NTA仪器（步骤3.1.3）。用 1 mL 无菌注射器注入 1-5 mL 的工作校准溶液以冲洗机器通道，直到检测界面上显示的颗粒数在 50-400 之间（最好在 300 左右）。运行校准程序。
   5. 重复步骤3.1.2，在每次样品测量前冲洗机器通道。
   6. 使用无菌 1 mL 注射器注入至少 2 mL 缓冲溶液以恒定速度冲洗机器通道，直到检测界面上显示的颗粒数小于 10。
   7. 以中等和恒定的速度（推荐速度为0.5-1 mL / s）注入步骤3.1.1中制备的1 mL EV样品。
      注意:最佳颗粒浓度是使检测界面上显示的颗粒数范围为50-400，优选在300左右。如果颗粒数量过多，重复步骤3.1.2立即冲洗机器通道，以避免颗粒滞留在通道壁上，并按步骤3.1.1调整EV样品的浓度，然后从步骤3.1.5开始重复。
   8. 根据制造商的说明进行颗粒分析并生成分析报告（参见 材料表）。
   9. 如果样品珍贵，请使用 1 mL 注射器回泵 EV 样品，并将其收集在 1.5 mL 离心管中。重复步骤 2.2 以提取 EV。
   10. 检测所有样品后，向机器通道注入至少2 mL缓冲溶液，然后注入至少5 mL蒸馏水，直到检测界面上显示的颗粒数小于5。
   11. 使用无菌 5 mL 注射器以恒定速度（推荐速度为 1 mL/s）注入至少 10 mL 空气以去除通道中的水分。
2. 执行透射电镜分析。
   注意:使用新鲜的EV悬架执行以下步骤。formvar-carbon涂层电子显微镜网格有两面，工作面在中心网格中发光。在以下过程中，提取 EV 的最小血浆体积为 50 μL。
   1. 将EV样品（步骤2.4）与等体积的4%多聚甲醛（PFA）混合。将 4 μL EV 沉积在一个网格上，并在室温 （RT） 下孵育 15 分钟。
   2. 将四滴PBS（一滴等于50μL）放在聚乙烯薄膜上（见 材料表）。用干净的微型镊子转移网格，并在PBS中将网格的工作侧从一滴清洗到另一滴。
   3. 使用滤纸去除网格中残留的多余PBS。
   4. 将网格的工作侧孵育到1%磷钨酸（见 材料表）中2分钟，然后重复步骤3.2.2。
      注意:由于磷钨酸有毒，此过程需要在通风橱中操作，多余的磷钨酸需要专门回收而不是直接丢弃。
   5. 将网格面朝上放入覆盖有滤纸的 10 厘米培养皿中。网格可以在室温下存储数年。
   6. 按照制造商的说明在电子显微镜下观察网格（见 材料表）。
      注意:为确保观察到单个颗粒，必须调整EV的浓度，并且悬浮液需要清晰，没有明显的浊度。在滴下之前，样品应充分混合。代表性的TEM和NTA分析如图 2所示。

4. EV的产地分析

注意:鉴定EV的细胞来源需要对典型的细胞膜标志物应用抗体。在以下过程中，提取 EV 的最小血浆体积为 300 μL。 基于EV的脂质双层结构，可以使用膜染料来标记它们。对于血浆样品，选择淋巴细胞¹⁴ 的CD18作为代表。对于上颌骨样本，选择破骨细胞¹⁵ 的破骨细胞相关受体（OSCAR）作为示例。在FC之前，确保流式细胞仪适用于EVs¹⁶的测量，因为不同流式细胞仪之间的下限尺寸差异很大。

1. 用 500 μL PBS 重悬样品（步骤 2.4），并将 50 μL 转移到新的清洁的 1.5 mL 离心管中作为空白对照（管 A），将另外 50 μL 转移到新的清洁 1.5 mL 离心管中作为 FITC（管 B）的简单染色管。向原管中加入 0.5 μL 膜染料进行膜染色。在室温下孵育5分钟。
2. 将主管在16，800× g （4°C）下离心30分钟。弃去上清液并用 200 μL PBS 重悬沉淀。
3. 将每个 50 μL 样品分成四个 1.5 mL 离心管，用于 PE（试管 C）、表面标志物染色（试管 D）和仅二抗对照（试管 E）的简单染色管。
4. 将骨EV样品中的OSCAR一抗以及血浆EV样品中的CD18抗体（参见 材料表）分别添加到试管B（步骤4.1）和试管D（步骤4.3）（以1:100稀释）。在4°C孵育1小时。
5. 将试管在16，800× g （4°C）下离心30分钟。弃去上清液，用500μLPBS重悬沉淀，然后在16，800× g （4°C）下再次离心30分钟以除去额外的一抗。
6. 弃去上清液并用 50 μL PBS 重悬沉淀，然后分别加入 FITC 偶联的二抗（参见 材料表）（以 1:200 稀释）（管 E）。将相同的二抗添加到试管B（步骤4.1）和试管D（步骤4.3）中。将所有试管在4°C黑暗中孵育1小时。
   注意:直接荧光偶联标记抗体也可用于通过适当的同种型对照处理FC检测。
7. 将一滴 0.2、0.5 和 1 μm 大小的珠子（参见 材料表）悬浮液分别稀释到 1 mL PBS 中，并首先运行每个尺寸的珠子以确保为 EV 选择的门。设置流式细胞仪的阈值，以使用合适的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）搜索磁珠和EV群。
   1. 将终端条件设置为计算 100，000 个膜染色颗粒。按照制造商的说明通过流式细胞仪 分析 样品（见 材料表）。代表性结果如图 3所示。
      注意:具有荧光通道的NTA设备也可用于来源分析，样品制备与FC相同。

5. 电动汽车的蛋白质含量分析

注意:EV内蛋白质含量的分析 是通过蛋白质印 迹进行的。例如，选择血浆和骨EV来分析6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）和丙酮酸激酶M2（PKM2）的代谢状态。与细胞样品相比，Golgin84（高尔基体细胞器）用作阴性对照，Floylin（膜蛋白）、Caveolin（洞穴的整合蛋白）和β-肌动蛋白（细胞骨架）¹⁷ 被用作EV的阳性对照。Mitofilin和α-肌动蛋白-4被选为大的EV标志物，而CD9和CD81被选为小的EV标志物来证明EV亚群¹⁸。Apoa1被选为血浆脂质文章标记¹⁹。有关相应的试剂详细信息，请参阅 材料表。

1. 将沉淀（步骤2.4）重悬于50μL的RIPA裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。
2. 按照制造商的说明，通过BCA蛋白质测定定量96孔微孔板中所有样品的蛋白质浓度（参见 材料表）。
   1. 将 2 mg/mL 的牛血清白蛋白 （BSA） 与 0.9% 的生理盐水 （NS）（含有 0.9% （w/v） 氯化钠）稀释到 0.5 mg/mL 中。将0.5 mg/mL的BSA和0.9%的NS加入到具有一定体积的三个重复孔中，如 表1所示。
   2. 滴下 2 μL 样品（步骤 5.1），并将 18 μL NS 分别加入三个重复孔中。
   3. 通过将BCA试剂A与试剂B（50:1试剂A:B）混合来制备工作溶液。 向每个孔中加入 200 μL 工作溶液并轻轻摇动 30 秒。
   4. 将96孔微孔板在37°C孵育20-25分钟。
   5. 用分光光度计测量596nm处的OD（见 材料表）。
   6. 导出数据。
   7. 绘制标准曲线并计算样品的蛋白质浓度。
3. 根据结果，用0.9%的NS和5x SDS-PAGE上样缓冲液（250 mM Tris·盐酸，pH 6.8，10%SDS，30%（v / v）甘油，10 mM DTT，0.05%（w / v）溴酚蓝，见 材料表）。用薄膜密封管，并在100°C下加热5分钟。
4. 将样品和蛋白质分子量标准加载到4%-20%Hepes-Tris凝胶的梯度浓度中（参见 材料表）。
   注意:根据目标蛋白质的分子量选择凝胶百分比。
5. 在电泳缓冲液中以80 V电泳凝胶，直到蛋白质形成一条线，然后切换到120 V1小时，直到上样染料位于凝胶底部。
   注意:运行时间可能因所用设备或凝胶的类型和浓度而异。
6. 将凝胶转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（参见 材料表）上，在甲醇中预孵育20秒。使用湿转印系统在200mA下转印1小时。
   注意: 确保传输系统内没有气泡，并保持 PVDF 膜湿润。
   注意:转印时间可能因目标蛋白的分子量而异;1 KD 通常需要 1 分钟。
7. 通过将 2.5 g BSA（参见 材料表）加入 50 mL Tris 缓冲盐水吐温 （TBST）（2 mL 吐温添加到 2 L PBS 溶液中）到 50 mL 离心管中来制备 5% BSA 封闭缓冲液。搅拌直至粉末溶解。在室温下搅拌将该缓冲液中的膜封闭2小时。
8. 用TBST稀释的特异性一抗孵育膜至适当浓度（丝裂蛋白，1:1000;α-肌动蛋白-4，1:1000;CD9， 1:1000;CD81， 1:1000;阿波阿1， 1:1000;戈尔金84，1:1000;弗洛西林-1，1:1000;卡沃林-1，1:1000;PGD，1:1000;PKM2， 1:1000;β-肌动蛋白，1:3000）在4°C下过夜。
9. 在洗涤缓冲液（2mL吐温加入2LPBS溶液）中洗涤膜四次（每次15分钟），并在室温下以1:4000在室温下搅拌将膜与合适的二抗孵育1小时。
10. 在洗涤缓冲液中洗涤膜四次（每次15分钟），并使用化学发光试剂盒和凝胶成像系统对膜进行成像（参见 材料表）。

结果

根据实验工作流程，可以从外周血和实体组织中提取EV（图1）。8周龄小鼠的上颌骨约为0.1±0.05g，可以从小鼠中收集约300μL血浆。按照协议步骤，可以分别收集0.3 mg和3 μg的EV。通过TEM和NTA分析，EV的典型形态特征是直径范围为50-300nm的圆形杯形膜囊泡（图2）。FC可以在有用的对照下检测膜染料标记的EV，FC分析显示了EV上表达的特定膜标志物的百分比，这意味着它们来自亲本细胞（图3）。蛋白质印迹分析显示PGD和PKM2的表达分别代表血浆EV和骨EV中的蛋白质含量，表明代谢状态（图4）。Golgin84 在 EV 中的阴性表达也通过存在丝裂蛋白、α-肌动蛋白-4、氟氏蛋白-1、Caveolin-1 和 β-肌动蛋白来检测，后者通常富集在质膜衍生的大 EV（微囊泡）中。也可以检测到小的EV标志物CD9，而CD81表达低或不存在，血浆EV中缺乏Apoa1（

讨论

在研究电动汽车的特性、命运和功能时，隔离高产量和低污染的电动汽车至关重要。有多种方法可以提取 EV，例如密度梯度离心 （DGC）、体积排阻色谱 （SEC） 和免疫捕获测定^4，20。这里使用了最常用的方法之一，差速离心;这样做的优点是不耗时，它可以产生高产量的EV，易于从有限的样品中分离出来，并且能够根据所使用的样品源修改方法。为了分析循环EV的功能，最好选择血浆，这样可以更好地反映EV在体内的真实状态，而不是血清。这是因为许多血小板来源的EV将在凝块形成过程中释放以收集血清²¹，而在从血浆中分离EV之前通过离心去除血小板²²。必须注意的是，血浆EV分离的抗凝选择仍然存在争议。肝素的抗凝血机制与生理学关系更密切;因此，分离的EV可能更能反映体内状态。必须提到的是，肝素会导致假阴性PCR读数并阻断细胞^23，<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	Biosharp	143174	透射电子显微镜
Alexa fluor 488 抗山羊二抗	Yeason	34306ES60	流式细胞术
Alexa fluor 488 抗兔二抗	Invitrogen	A11008	流式细胞术
抗 CD18 抗体	Abcam	ab131044	流式细胞术
抗 CD81 抗体	Abcam	ab109201	Western blot
抗 CD9 抗体	Huabio	ET1601-9	Western blot
抗丝裂蛋白抗体	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 兔 pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA 蛋白检测试剂盒	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye 预染蛋白分子量标准	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
牛血清白蛋白	MP 生物医学	218072801	Western blot
Caveolin-1 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask 橙色质膜染色	Invitrogen	C10045	流式细胞术
化学发光	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
弯曲手术剪刀	JZ 手术器械	J21040	EV 隔离
电子天平	智科	ZK-DST	EV 隔离
Epoch 分光光度计	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf 管	Eppendorf	3810X	EV 分离
Flotillin-1 抗体	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
凝胶成像系统	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
网格 - Formvar/碳涂层 - 铜 200 目	Polysciences	24915	透射电子显微镜
肝素溶液	StemCell	7980	EV 分离
Liberase 研究级	Sigma-Aldrich	5401127001	EV 分离
显微镜镊子	JZ 手术器械	JD1020	EV 分离
NovoCyte 流式细胞仪	ACEA	N/A	流式细胞仪
Omni-PAGE Hepes-Tris 凝胶 Hepes 4~20%，10 孔	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR（D-19） 抗体	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	流式细胞术
PBS （2x）	ZHHC	PW013	Western blot
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	57-33-0	麻醉
过氧化物酶 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG （H+L）	Jacson	115-035-003	蛋白质印迹
过氧化物酶 AffiniPure 山羊抗兔 IgG （H+L）	Jacson	111-035-003	Western blot
磷酸钨酸	RHAWN	12501-23-4	透射电子显微镜
PKM2（d78a4） xp 兔  mAb	Cell Signaling	4053t	Western blot
聚乙烯 （PE） 膜	Xiang yi	200150055	透射电子显微镜
聚偏二氟乙烯膜	罗氏	3010040001	Western 印迹
抑制剂	罗氏	4693132001	蛋白质印迹
抗 PGD 抗体	Abcam	ab129199	蛋白质印迹
RIPA 裂解缓冲液	Beyotime	P0013	蛋白质印迹
SDS-PAGE 上样缓冲液 （5x）	Cwbio	CW0027S	蛋白质印迹
大小微珠	Invitrogen	F13839	流式细胞术
台式高速微量离心机	日立	CT15E	EV 分离
透射电子显微镜	HITACHI	H-7650	透射电子显微镜
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
涡旋混合器 Genie	Scientific Industries	SI0425	EV 分离
ZetaView BASIC NTA - 纳米粒子示踪视频显微镜 PMX-120	Particle Metrix	N/A	纳米粒子示踪分析
&α;-肌动蛋白-4 兔单克隆	A3379	Western blot
&β;-肌动蛋白	Cwbio	CW0096M	Western blot