利用三维体积视图图像检测与定量隧道纳米管

摘要

隧道纳米管（TNTs）主要是由F-肌动蛋白构成的、两端开放的膜性纳米管结构，可连接相邻细胞，介导细胞间通讯。TNTs区别于其他细胞突起的显著特征是这些纳米管悬浮于细胞之间。本文通过构建共聚焦z轴层扫图像的三维体积视图，对隧道纳米管进行表征。

摘要

近期研究发现，细胞能够进行直接的长距离细胞间物质传递 通过 纳米尺度的肌动蛋白-膜通道，即 "隧道纳米管" （膜纳米管）。膜纳米管被定义为开放末端、由脂质双层包裹的膜性突起结构，直径介于50 nm至1 µm之间，可在相邻细胞间形成连续性连接。膜纳米管最初在神经元细胞中被发现，但后续研究证实其存在于多种细胞类型及疾病中，如神经退行性疾病、病毒感染和癌症。一些研究也将相邻细胞间封闭末端、电耦合的膜纳米结构称为膜纳米管或膜纳米管样结构。

从膜连续性的角度阐明终点时的超微结构在技术上具有挑战性。此外，由于缺乏特异性标记物，使用传统方法对细胞间通讯进行研究，尤其是在鉴定隧道纳米管（TNTs）方面，也面临困难。TNTs 主要被定义为基于 F-肌动蛋白的、开放性膜突起结构。然而，一个主要局限在于，F-肌动蛋白存在于所有类型的细胞突起中，因此难以将 TNTs 与其他突起结构区分开来。基于 F-肌动蛋白的 TNTs 的一个显著特征是，这些结构悬浮于两个细胞之间，且不与基质接触。因此，可通过其是否悬浮于细胞之间，方便地区分出清晰的经 F-肌动蛋白染色的 TNTs 与其他突起结构，例如丝状伪足和神经突。

我们最近的研究表明，寡聚化淀粉样蛋白-β的内化_1-42 (oAβ) 通过 肌动蛋白依赖性内吞作用可激活p21活化激酶1（PAK1），进而介导富含F-肌动蛋白且共表达磷酸化PAK1的隧道纳米管（TNTs）在SH-SY5Y神经元细胞间的形成。本方案概述了一种三维体积分析方法，用于识别和表征经寡聚化β-淀粉样蛋白（oAβ）处理的神经元细胞中，由F-肌动蛋白与磷酸化PAK1免疫染色标记的膜突起所捕获的z轴层扫图像中的TNTs。此外，通过F-肌动蛋白与β-III微管蛋白免疫染色的膜通道，可将TNTs与正在发育的神经突及神经元突起区分开来。

引言

隧道纳米管（TNTs）是基于F-肌动蛋白的、主要为开放末端的膜性通道，在细胞间物质和细胞器的转运中发挥重要作用¹TNTs 的独特特征在于它们能够在不与基质接触的情况下连接相邻细胞，其长度超过 10–300 µm，直径在 50 nm 至 1 µm 之间。^2,3. 膜纳米管是瞬态结构，其寿命从几分钟到数小时不等。膜纳米管最初在PC12神经细胞中被发现¹；随后，大量研究证实了它们存在于多种细胞类型中 体外 和 体内^4,5多项研究揭示了隧道纳米管（TNTs）在多种疾病模型中的病理学意义，例如神经退行性疾病、癌症和病毒感染^6,7,8.

多项研究已在不同的细胞系统中证实了隧道纳米管（TNTs）的结构异质性⁹。这些差异主要基于细胞骨架组成、形成机制以及所转移的货物类型

方案

注意：在 DMEM/F-12 培养基中培养的 SH-SY5Y 细胞，用 10 µM 视黄酸分化 7 天后，在 37 °C（5% CO₂）条件下用 1 µM oAβ 寡聚体处理 2 小时。处理后，细胞用 Karnovsky 固定液固定，并用磷酸化 PAK1（Thr423）/PAK2（Thr402）抗体和 F-肌动蛋白结合性鬼笔环肽进行双重免疫荧光染色。随后，使用共聚焦激光扫描显微镜采集共聚焦 z 轴层扫图像。通过手动计数对隧道纳米管（TNTs）进行定量，并通过构建三维体积视图图像，根据其悬浮于两个细胞之间且不接触基质的特征，将其与其他神经突起/细胞突起区分开来（图 1）。

1. 细胞培养与分化

1. 在 DMEM/F12（Ham's）培养基中培养 SH-SY5Y 神经细胞，培养基配制比例为 1:1，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素-新霉素混合液（PSN）。将细胞接种于 35 mm 成像培养皿中，培养皿中央设有 14 mm 孔，孔底固定有 #1.5 盖玻片。接种密度为 12,000 个细胞/cm²，实验在细胞融合度达到 60%–70% 时进行。
2. 使用 10 µM 视黄酸（RA）对细胞进行部分诱导分化，RA 来自 100 mM 储存液（将 5 mg RA 溶于 15 mL 二甲基亚砜 ....

结果

本研究通过共聚焦显微镜z轴层扫图像构建三维体积视图，鉴定并表征SH-SY5Y神经细胞中由oAβ诱导形成的膜纳米管（图1）。细胞经F-actin与磷酸化PAK1双免疫荧光染色后，对染色细胞的共聚焦z轴层扫图像进行分析以识别膜纳米管（图2）。进一步分析微分干涉相差（DIC）图像，验证F-actin和磷酸化PAK1染色的膜纳米管结构确为细胞间的膜性通道（图3）。此外，细胞还进行了F-actin与β-III微管蛋白的双免疫染色（图4）。通过该染色方法，可将同时表达F-actin与β-III微管蛋白的类膜纳米管结构与仅表达F-actin的膜纳米管区分开来（图4）。通过构建三维体积视图图像，依据其悬浮于两个细胞之间且不接触培养基底的特征，将共表达磷酸化PAK1（即活化PAK1）与F-actin的膜纳米管与其他神经突起或细胞突起区分开来（

讨论

过去二十年中，许多研究人员一直致力于理解并表征隧道纳米管（TNTs）的结构¹⁸。由于缺乏特异性标记物，研究进展受到阻碍，因此迫切需要一种便捷、标准化的方法，用于识别、表征和定量TNTs。TNTs被定义为基于F-肌动蛋白的膜性通道，悬浮于两个细胞之间。研究表明，β-微管蛋白阳性、末端封闭的发育中神经突起可在两个远距离细胞之间延伸，并呈现出类似TNT的结构^12,13。因此，TNTs通过仅表达肌动蛋白、且作为悬浮于两个远距离细胞之间的膜性通道这一特征，与神经突起及其他类TNT结构相区分。研究人员在成像前固定过程中常常难以获得完整的TNT结构²⁴。为解决这一问题，我们采用含2.5%戊二醛的改良固定液（Karnovsky固定液）对本实验方案中使用的SH-SY5Y神经细胞进行固定²⁵。

每个免疫组织化学/免疫细胞化学实验的关键步骤都是样.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 培养皿，内含 14 mm 直径的 #1.5 盖玻片材质小室	Cellvis	D35-14-1.5-N	用于接种细胞以进行染色实验的成像培养皿
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	用于处理细胞的β-淀粉样蛋白寡聚体
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（H+L）	Invitrogen	A11070	磷酸化PAK1的二抗
生物安全柜	赛默飞世尔科技（MSC Advantage）	51025411	在细胞培养过程中提供无菌条件
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技公司（Heraeus Hera Cell 240）	51026556	用于在体温或接近体温条件下培养细胞
共聚焦激光扫描显微镜	ZEISS（卡尔·蔡司）	LSM 880	能够以超分辨率生成大尺寸样本的三维图像
DABCO [1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷]	默克	8034560100	抗淬灭剂
DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)	Sigma	D9542-1MG	核染剂
DMEM 培养基	Gibco	11965092	用于制备 100 μM 的 Aβ (1-42)
DMEM/F12（DMEM与Ham’s F12	Gibco	12500062	SH-SY5Y细胞培养基
DMSO（二甲基亚砜）细胞培养级	冷冻纯化	CP-100	用于溶解视黄酸的细胞培养级溶剂
DMSO（二甲基亚砜）分子生物学级	Himedia	MB058	用作冻干A的溶解剂之一β (1-42)
胎牛血清	Gibco	16000044	培养基主要添加剂（美国来源）
中性缓冲福尔马林固定液（10%）	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Karnovsky固定液中的组分
戊二醛（I 级，25% 水溶液）2O	Sigma	G5882	Karnovsky固定液中的组分
HFIP（1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇）溶液	TCI	H024	用于溶解 Aβ (1-42) 1 mg
图像处理/分析软件：FIJI（ImageJ）	美国国立卫生研究院（NIH）		用于处理和分析图像，并利用其名为的插件区分TNTs与神经突 "体积查看器".
冻干机	克里斯特，阿尔法	2.4 LDplus	0.05 mg 的 A 等分试样β (1-42) 可在 -20 保存 °冻干后仅含 C
青霉素-链霉素-新霉素混合液	赛默飞世尔科技	15640055	抗生素混合物
鬼笔环肽-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-肌动蛋白结合染色
磷酸化-PAK1（Thr423）/PAK2（Thr402）[兔]	CST	#2601	一抗
多克隆抗体抗微管蛋白 β3（TUBb3）	云克隆	PAE711Hu01	一抗
视黄酸	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	分化试剂
皂苷	默克	8047-15-2	免疫染色中孵育缓冲液所用的去垢剂
水浴超声波清洗器（四分之一加仑，带排水阀加热器）	超声波清洗机	3.0 L/3.2	用于溶解 A 的超声波破碎仪β (1-42) 储液，在制备100时加入DMSO后 µM Aβ (1-42)
ZEN 显微成像软件	ZEISS（卡尔·蔡司）		具有智能自动化的共聚焦显微镜成像软件