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骨骼肌内脂肪形成及其细胞来源的检测指南

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DOI：

10.3791/63996

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2022年5月26日

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Myology Institute, University of Florida College of Medicine

本文内容

摘要

健康肌肉组织被肌内脂肪取代是多种人类疾病和病理状态的显著特征。本方案阐述了如何对肌内脂肪进行可视化、成像和定量分析，从而为深入研究肌内脂肪形成的潜在机制提供严谨的方法支持。

摘要

纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）是一类间充质基质细胞，在骨骼肌稳态维持和再生过程中发挥关键作用。FAPs 构建并维持作为肌纤维分子支架的细胞外基质。此外，FAPs 对肌纤维再生至关重要，因为它们分泌多种肌肉干细胞（MuSCs）可感知的有益因子。然而，在疾病状态下，FAPs 是肌内脂肪和纤维化瘢痕组织的细胞来源。这种脂肪性纤维化是肌少症和杜氏肌营养不良等神经肌肉疾病的标志性特征。目前确定 FAPs 为何及如何分化为肌内脂肪的一个重要障碍，是脂肪细胞的有效保存及其在冷冻组织切片中的后续可视化。传统的骨骼肌组织处理方法（例如速冻）无法充分保存单个脂肪细胞的形态，从而阻碍了准确的观察与定量分析。为克服这一难题，已建立了一种严谨的实验方案，可在骨骼肌切片中良好保存脂肪细胞形态，实现肌内脂肪的可视化、成像和定量分析。该方案还详细说明了如何对部分肌肉组织进行 RT-qPCR 处理，使研究者能够通过检测脂肪生成相关基因表达水平的差异，验证所观察到的脂肪形成变化。此外，该方案还可调整用于肌肉样本的整体免疫荧光染色以可视化脂肪细胞。最后，本方案阐述了如何对表达 Pdgfrα 的 FAPs 进行遗传谱系示踪，以研究 FAPs 的脂肪生成转化过程。该方案可稳定获得高分辨率且形态准确的脂肪细胞免疫荧光图像，并结合 RT-qPCR 进行验证，从而实现对肌内脂肪进行可靠、严谨且可重复的可视化与定量分析。综上所述，本文所述的分析流程是我们深入理解 FAPs 如何分化为肌内脂肪的第一步，也为验证预防脂肪形成的新干预手段提供了框架。

引言

健康肌肉组织被脂肪性纤维化浸润是杜氏肌营养不良症（DMD）及其他神经肌肉疾病，以及肌肉减少症、肥胖症和糖尿病的显著特征1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。尽管这些疾病状态下脂肪浸润增加与肌肉功能下降密切相关，但我们对肌内脂肪形成的原因和机制仍了解有限。FAPs 是存在于大多数成体器官（包括骨骼肌）中的一类多能间充质基质细胞群体11,12。然而，随着年龄增长或在慢性疾病中，FAPs 会生成纤维化瘢痕组织并分化为脂肪细胞，这些脂肪细胞位于单个肌纤维之间，形成肌内脂肪13,14,15,16,17,18,19,20。

为了开始抑制肌内脂肪的形成，需要明确FAPs转化为脂肪细胞的机制。PDGFRα 是 "金标准" 领域内用于鉴定多种物种肌肉中FAPs的标记物13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27因此，多个由他莫昔芬诱导的小鼠Cre品系，在特定基因启动子的调控下 Pdgfrα 启动子，已成功构建，可用于对FAPs进行基因操作 体内 利用Cre-LoxP系统27,28,29例如，通过将这种可诱导的Cre品系与遗传报告基因相结合，可对FAPs进行谱系示踪，我们已成功将该策略应用于肌肉和白色脂肪组织中FAPs的命运图谱绘制20,30除了谱系示踪外，这些Cre品系还为研究成纤维脂肪前体细胞向脂肪细胞的转化提供了有价值的工具。

明确脂肪生成过程中脂肪前体细胞（FAPs）转化为肌内脂肪的机制，其主要障碍之一在于难以严格且可重复地量化在不同条件下形成的肌内脂肪含量。关键在于平衡肌肉和脂肪组织的保存，并将其与可用的染色方法相匹配，以实现对脂肪细胞的可视化。例如，骨骼肌通常在未经固定的情况下迅速冷冻，这种方法可较好地保存肌纤维，但会破坏脂肪细胞的形态结构（图1）。相比之下，固定后进行石蜡包埋虽能呈现最佳的组织学结构（包括脂肪细胞），但会完全去除脂质，从而使大多数亲脂性染料（如常用的油红O染料）无法使用。

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图1：快速冷冻与固定肌肉组织中肌内脂肪的代表性图像。 （A）实验设置的示意图。免疫荧光图像显示了甘油损伤后21天的快速冷冻（B）和固定（C）TA组织中的脂肪细胞（黄色）、肌纤维（灰色）和细胞核（青色）。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

本文所述方案可有效保持肌纤维和脂肪细胞的形态，实现多种细胞类型的可视化与分析。该方法基于对经多聚甲醛（PFA）固定的肌肉组织中的脂肪细胞进行免疫荧光染色，可实现多种抗体的共染。此外，该方案还可轻松适用于通过整体组织成像（whole-mount imaging）在完整组织中空间展示肌内脂肪，从而提供脂肪在肌肉内所处细胞微环境的信息。同时，本方案可与我们近期发表的方法相结合，用于测定固定肌肉组织中肌纤维的横截面积31，这是评估肌肉健康状况的重要指标。本文还概述了将该方法与遗传谱系示踪技术结合，以命运图谱方式追踪FAPs向脂肪细胞分化的过程。因此，本方案具有良好的通用性，可在组织切片和完整组织中对FAPs及其向肌内脂肪的分化进行严谨且可重复的评估。

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图2示意图解实验方案概览。 胫骨前肌组织处理的示意图，其中三分之一的胫骨前肌被切除后立即速冻并匀浆化，用于后续RNA提取和转录分析 通过 RT-qPCR。其余三分之二的TA组织经PFA固定后，用于冷冻切片或整装肌纤维的免疫染色。 请点击此处以查看此图的放大版本。

方案

所有动物实验方案均经佛罗里达大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. FAPs 的遗传谱系示踪

注意：如果不需要对 FAPs 进行遗传谱系示踪，则可以跳过步骤 1。

  1. 为进行FAPs的谱系示踪，需获取必要的小鼠等位基因。
    注意：已有多个由Pdgfrα启动子控制的他莫昔芬诱导型Cre小鼠品系被成功用于靶向FAPs，包括来自Hogan29、Rando27和Bergles32实验室的品系。作为Cre活性的遗传报告系统，存在多种Rosa26报告等位基因，例如Rosa26EYFP33。尽管建议各实验室自行确定最有效的Cre-报告基因组合，但通过将PdgfrαCreERT2小鼠（29，Jax# 032770）与Rosa26EYFP报告小鼠（33，Jax# 006148）杂交，所获得的PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP小鼠可高效且特异性地标记FAPs20。为追踪成熟FAPs的命运，建议在给予他莫昔芬前，等待小鼠至少达到约10周龄。谱系示踪实验可在雄性和雌性小鼠中进行。
  2. 通过口服灌胃给予他莫昔芬
    1. 在玉米油中配制40 mg/mL的他莫昔芬溶液，并在灌胃前一天充分涡旋混匀。于37 °C旋转杂交炉中孵育过夜。
      警告：他莫昔芬为致癌物，应小心操作。操作时务必佩戴手套，称量粉末时应佩戴口罩，以防吸入风险。
    2. 按照规程清洁操作区域，将灌胃针连接至1 mL注射器。吸取200 µL他莫昔芬溶液至注射器中。
    3. 将10周龄的PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP 小鼠（两性均可使用）置于平坦表面，用一只手牢固抓住其尾根部。用另一只手的拇指和食指抓住小鼠身体中部，然后轻轻并稍加压力地向肩部后方滑动手指，直至刚好越过肩部。
    4. 用拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤，提起小鼠并翻转手掌，使小鼠面向操作者，并将尾巴夹在持鼠手的小指与无名指之间。
    5. 此时应确保小鼠头部和四肢被充分固定，无法自由活动。将灌胃针插入小鼠口腔，并轻轻向后倾斜其头部，以便更易进入食道。
    6. 小心缓慢地将针插入食道。若遇阻力，切勿强行推进；针头应能顺畅滑入。缓慢注射他莫昔芬溶液。灌胃后观察小鼠15–20分钟，确保未出现异常情况。
      注意：连续两天给予他莫昔芬通常可实现约75%–85%的FAPs重组效率，且不会引起明显不良反应。建议在给予他莫昔芬后等待1–2周再诱导损伤，以确保体内残留的他莫昔芬被清除，且任何残留蛋白已完成降解。

2. 胫骨前肌（TA）损伤

注意：为了研究肌内脂肪，建议使用基于甘油的损伤模型（50% 甘油溶于无菌生理盐水），该模型可导致大量肌内脂肪形成34,35,36,37。

  1. 通过添加异氟烷并确保通向小鼠室和鼻罩的管道畅通，准备麻醉机。使用70%乙醇或过氧化氢溶液（根据具体方案）清洁麻醉室及操作区域。
  2. 将氧气流速设置为2.5 L/min，异氟烷浓度设置为2.5%。将小鼠放入麻醉室中，等待约5分钟使其进入麻醉状态。
  3. 将小鼠仰卧置于洁净的加热垫上，并将鼻部插入鼻罩。使用棉签蘸取兽用眼药膏轻轻涂抹于眼睛表面，以防止麻醉期间角膜干燥。持续监测麻醉深度，并在造模前对小鼠进行足趾夹捏测试，确认其已完全麻醉。
  4. 使用新的酒精棉片擦拭待注射腿部，进行消毒。
  5. 用胰岛素注射器抽取30–50 µL的50%甘油溶液（根据小鼠体型调整体积）。用棉签轻轻向上梳理胫骨前肌（TA）区域的毛发，以暴露注射部位。
    注意：酒精棉片擦拭后毛发仍湿润时更易梳理，有助于更清晰地观察目标区域。
  6. 定位胫骨前肌（位于胫骨外侧，略突出于皮肤表面，可通过轻柔触诊感知），从远端靠近踝关节处将针头刺入TA肌肉。将针头完全插入肌肉后，在缓慢回撤针头的同时缓慢注射甘油，有助于损伤大部分肌纤维。
    注意：针头应尽量与腿部平行进针，角度略微抬高为宜。成功的损伤通常会在拔针后引起足背屈，这是由于TA肌肉收缩所致。若观察到小鼠脚趾张开，则可能误将甘油注射至趾长伸肌（EDL）。
  7. 将小鼠放回笼中，观察15–20分钟，确保其从麻醉中顺利恢复。
  8. 将针头丢弃至锐器盒中，切勿重新盖上针帽。
    注意：甘油注射后的镇痛处理应遵循机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案。损伤后5天（dpi）即可观察到脂肪细胞；至7 dpi时，所有脂肪细胞均已形成；至21 dpi时，脂肪细胞已完全成熟。

3. 组织收获

  1. 在开始取材前，配制4%多聚甲醛（PFA）于1×PBS中，并置于冰上预冷。
  2. 将用于肌肉固定的培养板（12孔或24孔板）置于冰上，并向每孔加入4% PFA，确保每孔中PFA体积为待固定组织体积的10–20倍。
  3. 在甘油损伤后第7至21天，根据机构指南实施小鼠安乐死（例如，异氟烷过量麻醉后行颈椎脱位）。
  4. 开始取材用于组织学或RNA提取的组织。
    注意：动物处死后10–15分钟内应迅速将组织进行速冻或放入PFA固定（图2）。
  5. 用70%乙醇充分喷洒小鼠将要切割的区域，以减少毛发对解剖区域和器械的污染。
  6. 使用剪刀在靠近骨盆处围绕腿部顶端环形剪开皮肤（图3A）。
  7. 从上向下轻轻将腿部皮肤拉至脚踝处（图3B）。
    注意：胫前肌（TA）呈泪滴状，远端肌腱清晰，附着于内侧楔骨和第一跖骨。该肌肉位于胫骨外侧，向上延伸至膝关节下方。
  8. 在取材TA前，先用尖头镊子去除其外层结缔组织（肌外膜）（图3C）。建议使用解剖显微镜以更清晰地观察肌外膜。
  9. 从肌肉底部开始，将镊子从远端肌腱下方轻轻滑入，并沿向膝关节方向缓慢上提（图3D）。到达肌肉末端时停止；切勿强行越过膝下部位的阻力点。
  10. 若在到达膝下前即遇到明显阻力，应立即停止操作，并继续清除残留的结缔组织层。
    注意：在TA肌腱外侧另有一条远端肌腱连接趾长伸肌（EDL），该肌肉为位于TA外侧的细长肌肉。操作时应确保仅将镊子插入TA肌腱下方，以防误取EDL；但EDL也可在固定后方便地去除。
  11. 当镊子已将TA部分提起后，用相同手法持解剖刀切断TA与膝下部位的连接（图3E）。再用剪刀剪断踝部肌腱，完整取出TA。操作过程中仅可接触肌腱部分，避免损伤肌纤维。
  12. 在远离肌腱的一端切下约1/3的TA组织（图3F），放入微量离心管中，并通过浸入液氮进行速冻处理（图3H）。
  13. 将剩余2/3的组织浸入标记好的含4% PFA的孔板中用于组织学分析（图3I）。务必记录首个和最后一个组织样本放入固定液的时间。置于摇床上，4 °C孵育2–2.5小时。
  14. 固定时间取决于组织类型及其大小，需根据实际情况确定。通常在4 °C下固定2–2.5小时可良好保存脂肪细胞形态，同时避免组织过度固定。
    注意：若计划将TA用于整体免疫荧光染色，请跳过本方案后续步骤，直接进入第7节“整体免疫荧光染色”。
  15. 固定完成后，吸除各孔中的PFA，用预冷的1×PBS冲洗组织2–3次，随后每次用预冷的1×PBS洗涤5分钟，共洗涤2–3次。
  16. 吸除孔中PBS，加入足量的30%蔗糖（溶于1×PBS）使组织漂浮。4 °C摇床上孵育过夜。

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图3：组织取材流程示意图。（A）在腿部基部切开皮肤，（B）暴露后肢肌肉。（C）去除胫骨前肌（TA）的肌外膜后，（D）使用镊子部分分离肌肉，以确保肌外膜已完全去除。（E）用手术刀将TA肌从腿部切下，并切断肌腱后取出。（G）将TA肌切割为三分之一和三分之二两部分后，（H）其中三分之一迅速浸入液氮中，用于RT-qPCR分析，（I）剩余的三分之二部分则用4%多聚甲醛（PFA）固定，用于组织学分析。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 包埋

  1. 通过标记并加入足够的包埋介质，准备用于包埋的标本模具，确保组织能完全浸没其中。
  2. 从孔板中取出组织，在纸巾上吸去多余的蔗糖溶液，然后转移至盛有冷冻介质的标本模具中。
    注意：了解模具在冷冻切片机上将被切片的方向会有所帮助。这样操作者可在模具中以特定方向放置组织，使目标区域易于切取。对于胫骨前肌（TA），应将最厚的一端（与肌腱相对的一端）朝向将要切片的表面放置，以便于在肌肉最粗的部分（肌腹）进行切片，并实现肌纤维的横截面切割。
  3. 通过将盛有异戊烷的容器部分浸入液氮中，制备异戊烷悬浆。确保容器中有足够的液态异戊烷，能够浸没约一半高度的标本模具。
  4. 小心地将模具放入异戊烷悬浆中开始冷冻，确保约一半模具被浸没，并且模具从四个侧面均匀冻结。
  5. 在模具顶部完全冻结之前，及时将其从异戊烷中取出。所需时间取决于所使用的模具类型。
  6. 在继续冷冻其他组织块时，将已冷冻的模具保存在盛有干冰的容器中，随后储存在 -80 °C 环境下。
    注意：用于冷冻的异戊烷可重复使用。将其装入玻璃瓶中，但需待异戊烷恢复至室温（RT）后再拧紧瓶盖，否则压力变化可能导致玻璃瓶破裂。

5. 切片

  1. 将冷冻切片机温度设置为 -22 至 -24 °C，将含有 TA 的模具放入冷冻切片机中，并至少等待 30 分钟以完成温度平衡。在此期间，标记一系列带正电荷的显微镜载玻片。
  2. 插入防卷板，并将其与冷冻切片机对齐，使防卷板与组织块接触处的缺口尽可能少。固定防卷板。
  3. 将新的冷冻切片机刀片插入刀片夹中并固定。
    注意：刀片锋利。在操作冷冻切片机其他部件或冷冻模具时，请盖住刀片。
  4. 从模具中取出冷冻组织块。在冷冻切片机卡盘上均匀涂抹一层包埋介质，并将组织块置于介质中。静置 1–3 分钟，直至包埋介质完全冻结（呈不透明白色）。
    注意：对于 TA，当组织块固定在卡盘上时，最厚的区域（腹部）应可见。
  5. 将带有组织块的冷冻切片机卡盘放入冷冻切片机中。打开刀片盖，推进冷冻切片机，使其刚好接触刀片。以 25 µm 的厚度切片，直至组织不再被包埋介质遮挡。
    注意：切片过程中，调整冷冻切片机的角度和/或载物台的位置，以确保切片厚度均匀。可收集数张切片以确认切片厚度的一致性。建议用户在切至 TA（腹部）目标区域之前，先确定合适的防卷板位置，以便尝试多个防卷板位置，使切片平直展开，避免浪费组织。
  6. 将切片厚度调整为 10–12 µm，并将切片收集到已标记的显微镜载玻片上。建议采用连续切片法，将相邻切片收集在 6–10 张载玻片（标记为 1–x）上，以便进行多种标记物染色。如有需要，可在切片收集到载玻片前使用细刷将其展平。
    注意：若切片发生卷曲，请检查冷冻切片机温度是否稳定在 -22 至 -24 °C 范围内。若切片出现垂直条纹，可能是防卷板或刀片有缺口所致；可通过调整防卷板位置和/或更换新刀片来解决。
  7. 在每张载玻片上收集完同一切片平面的相邻切片后，将切片厚度调回 25 µm，推进组织块 150–200 µm，然后再次将切片厚度调至 10–12 µm，重新开始切片。
    注意：这种连续切片方法可使用户在 TA 的不同深度进行观察、成像和定量分析；每张载玻片上收集 3–4 张连续切片即可。
  8. 将载玻片和组织块在 -80 °C 下保存。

6. 组织切片的免疫荧光（IF）染色

注意：由于不同批次和生产商的抗体浓度可能存在差异，建议在对目标切片进行染色前，先在测试切片上评估几种不同浓度的抗体，以进行优化。

  1. 在室温或37 °C温板上解冻/干燥载玻片10-20分钟。
  2. 使用疏水性笔在载玻片纸质部分边缘（与玻璃接触处）画线。
  3. 将载玻片放入考普林瓶中，用含0.1% Tween20的1x PBS（PBST）在摇床上洗涤3-5次，每次至少5分钟，以重新水化组织切片。
    注意：此时必须确保载玻片始终浸没在PBST中（至疏水线处），切勿让其暴露于空气中，否则组织切片会干燥。
  4. 将载玻片置于加湿 chamber 的支架上，每张载玻片加310-350 µL封闭液（含5%驴血清和0.3% Triton X-100的1x PBS），室温孵育1-2小时。
    注意：由于封闭液中含有0.3% Triton X-100，已具备足够的通透化效果，因此无需额外进行通透步骤。当使用来源于小鼠的一抗（如下列的PAX7和MYOD1）时，建议在封闭液中加入鼠源性抗体封闭步骤，即加入Fab片段（1:50），以减少二抗与非目标抗体之间的非特异性结合，从而降低背景信号。
  5. 在进行下一步前，将所需一抗用封闭液稀释，具体如下：
    1. 用于脂肪细胞染色及全切片成像的一抗：将兔抗Perilipin以1:1000比例稀释。
    2. 用于脂肪细胞谱系追踪的一抗：将鸡抗GFP以1:1000比例稀释，兔抗Perilipin以1:1000比例稀释。
    3. 用于FAPs谱系追踪的一抗：将鸡抗GFP以1:1000比例稀释，山羊抗PDGFRα以1:250比例稀释。
    4. 用于肌源性标志物检测的一抗：将小鼠抗PAX7以1:25比例稀释，或小鼠抗MYOD1以1:250比例稀释，同时将兔抗LAMININ以1:1000比例稀释。
      注意：尽管上述抗体已在此方案中成功验证，但其他用于标记FAPs、脂肪细胞和/或其它细胞类型的标志物及抗体也可能适用于本方案。强烈建议在首次使用某种一抗时设置阴性对照载玻片（即省略一抗），以验证抗体的特异性。其余所有步骤照常进行，包括添加二抗，但在下一步中仅使用封闭液代替含一抗的封闭液。
  6. 弃去载玻片上的封闭液，加入含一抗的封闭液310-350 µL，置于加湿 chamber 中，4 °C孵育过夜。
  7. 次日，弃去含一抗的封闭液，将载玻片放入考普林瓶中。用PBST漂洗2-3次，并在摇床上用PBST洗涤3-5次，每次至少5分钟。
  8. 在最后一次洗涤期间，用封闭液配制所需二抗或直接偶联物。应尽量避免这些抗体暴露于光线下，以防光漂白。
    1. 稀释二抗/直接偶联物：488 nm驴抗鸡（1:1000）、驴抗兔（1:1000）或驴抗小鼠（1:1000）；568 nm驴抗山羊（1:1000）、驴抗兔（1:1000）或Phalloidin（肌纤维，1:100）；DAPI染色剂（细胞核，1:500）。
  9. 在加湿 chamber 中，向每张载玻片加入含二抗和/或直接偶联物的封闭液310-350 µL，室温孵育1-2小时。此后所有步骤均需避光处理。
  10. 弃去含二抗的封闭液，将载玻片放入考普林瓶中。先用PBST漂洗一次，再在摇床上用PBST洗涤3-5次，每次至少5分钟。保持考普林瓶加盖，避免光照。
  11. 通过轻敲载玻片边缘并在纸巾上擦拭背面的方式尽可能去除水分，但切勿使组织切片干燥。
  12. 在载玻片顶部水平边缘滴加三至四滴水性封片剂，轻轻盖上盖玻片。若盖玻片下出现气泡，切勿按压或移动；任何压力或移动都可能破坏脂肪细胞脆弱的细胞结构。
  13. 封片剂需在避光条件下静置过夜后再进行成像。

7. 整体免疫荧光染色

  1. 固定约 1 小时后（见步骤 3.14），使用尖头镊子从固定的胫骨前肌（TA）中剥离肌纤维。
  2. 将分离的纤维放入 24 孔板中，用 PBST 洗涤 3 次，每次 3 分钟。所有后续孵育步骤中，均需盖上盖子以防止蒸发。
  3. 在室温（200–300 µL）下，将样品置于含 1% Triton X-100 的 1× PBS 中，在摇床上孵育 1 小时，以促进抗体更好地渗透。
  4. 用 PBST 多次漂洗后，加入封闭液（200–300 µL），在 4 °C 下于旋转摇床（nutator）或摇床上封闭过夜。
  5. 用封闭液将一抗稀释至所需浓度（通常将推荐浓度加倍是一个良好的起始点），将样品（200–300 µL）在 4 °C 下于旋转摇床或摇床上孵育过夜。
  6. 在室温下于摇床上用 PBST 对样品进行严格洗涤，当天频繁更换溶液，共洗涤 4–6 次，每次 30–60 分钟。
  7. 用封闭液将二抗稀释至所需浓度（通常 1:500 效果良好），同时加入核染料，将样品（200–300 µL）在 4 °C 下于旋转摇床或摇床上孵育过夜。
  8. 在室温下于摇床上用 PBST 对样品进行严格洗涤，当天频繁更换溶液，共洗涤 4–6 次，每次 30–60 分钟；或在 4 °C 下过夜洗涤。
  9. 封片时，轻轻吸去多余的 PBST，然后将纤维置于载玻片上的一至两滴封片剂中（图 4A）。为抬高盖玻片（18 mm × 18 mm），可在边缘添加少量黏土支脚，以防止纤维被压碎并固定盖玻片。建模用化合物在此用途中效果良好。盖玻片固定后，从边缘继续添加封片剂，直至盖玻片下完全充满。
    注意：除使用含抗荧光淬灭剂的封片剂外，也可将组织依次通过浓度递增的甘油溶液（PBS 中含 30% 至 80% 甘油）进行处理。
  10. 成像前需等待 1–2 天，以使封片剂充分固化。

8. 肌内脂肪成像

  1. 打开显微镜并启动成像软件。将切片固定在载物台上。
    注意：对肌肉切片中的脂肪细胞进行成像时，通常使用5倍或10倍物镜结合宽场显微镜即可。若要观察间质脂肪组织（WM-IF），则需要使用共聚焦显微镜。
  2. 使用任意通道识别待成像区域。
  3. 在成像软件中，调节每个通道的增益和曝光时间。
  4. 在每个通道中采集整个组织的图像（根据所用显微镜和软件选择自动或手动模式），并将各个图像拼接，生成完整的胫骨前肌（TA）横截面复合图像。
    注意：建议在同一块胫骨前肌（TA）的不同深度位置采集两到三个不同切面的图像。通过分别定量每个切面中的脂肪细胞，再报告其平均值，可避免因注射误差等因素导致的局部肌内脂肪含量差异对结果的影响。

9. 脂肪细胞的定量分析

  1. 如果尚未安装，请添加 细胞计数仪 ImageJ 插件（https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html）。 
  2. 将图像作为 TIF 文件或原始显微镜文件导入 ImageJ。在 ImageJ 中将每个通道作为单独的 TIF 文件查看。
    注意：如果使用 LIF 或类似的显微镜文件类型，在 Bio-Formats 导入 选项，选择 超堆栈 用于 查看堆栈 并勾选该框 拆分通道. 点击 好的 以打开文件。同时，确保 自动缩放 未勾选该复选框。
  3. 确保每个通道的图像均为8位格式（且为灰度）： 图像 > 类型 > 8位.
  4. 合并 DAPI（蓝色）、GFP（绿色）、PERILIPIN（红色）和 PHALLOIDIN（灰色）图像： 图像 > 颜色 > 合并通道.
  5. 检查天平（分析 > 设置比例尺）单位为微米。使用徒手选择工具，勾勒出每个横截面的损伤区域和未损伤区域，然后进行测量（分析 > 测量）并在电子表格中记录损伤区域与未损伤区域。
    注意：受损肌肉可识别为无肌纤维的区域，或存在含有中央细胞核的肌纤维的区域。
  6. 启动细胞计数器： 插件 > 细胞计数器 > 初始化.
  7. 选择计数类型，然后逐一计数每个脂肪细胞。将脂肪细胞总数记录在电子表格中，随后计算每1 mm²的脂肪细胞数量2 受伤区域的

10. 使用 RT-qPCR 分析脂肪生成相关基因表达

  1. RNA 提取
    1. 开始前，将无 RNase 水预热至 45 °C，并为每个样品准备新鲜的 70% 乙醇（每样品 350 µL）。
    2. 向含有样品的每个试管中加入 1,000 µL 硫氰酸胍（参见步骤 3.12）。必须使用适用于珠磨仪的试管。
      注意：硫氰酸胍具有毒性。请佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱中操作。
    3. 向每个试管中加入三颗中等大小的珠子，或一颗大珠子和一颗小珠子。
    4. 使用珠磨仪以 50 Hz 频率均质组织 2–4 分钟。根据组织类型和样品大小，可能需要长达 10 分钟。
    5. 加入 200 µL 氯仿。
      注意：氯仿具有毒性。请佩戴个人防护装备，并在通风橱中操作。
    6. 将样品振荡 15 秒，室温孵育 2–3 分钟。
    7. 在 12,000 x g 条件下离心 15 分钟。用移液器吸取 350 µL 清亮上清液（含 RNA 的上层），转移至含有 350 µL 70% 乙醇的新微量离心管中。注意避免吸取下层的蛋白质和/或 DNA 层。
    8. 将最多 700 µL 的混合液转移至置于 2 mL 收集管中的小型离心柱中。随后按照试剂盒说明书继续进行 RNA 提取。
    9. 根据预期得率，使用 30–50 µL 无 RNase 水洗脱 RNA。将 RNA 置于冰上，并使用分光光度计测定得率。将 RNA 储存于 -80 °C。
      备注：可省略 DNase 处理步骤，因为小心地仅吸取上层 350 µL RNA 液相即可有效防止 DNA 污染。除 RT-qPCR 分析外，所提取的 RNA 也可用于 RNA 测序，此时强烈建议增加 DNase 处理步骤。
  2. cDNA 合成
    1. 使用最多 1 µg RNA，按照 cDNA 合成试剂盒说明书进行 cDNA 合成。
    2. 程序完成后，加入 80 µL 无 RNase 水。将样品储存在 -20 °C。
  3. 脂肪细胞特异性基因的 RT-qPCR 检测
    1. 采用 384 孔板格式，将 1 µL 引物（终浓度约 1 µM）加入每个孔底部。预先干燥引物有助于获得更紧密的技术重复。盖好后静置，直至引物完全蒸发（可将板置于 37 °C 加热块上以加快蒸发）。
    2. 设置每个样品的反应体系，包含 4 至 8 个技术重复，每孔总体积为 5 µL：2.5 µL 荧光染料法 RT-PCR 预混液、2.1 µL 无 RNase 水和 0.4 µL cDNA（约 1 ng）。采用以下热循环条件：95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火/延伸 25 秒，共 40 个循环。
    3. 通过计算 ΔΔCT 方法将原始 CT（循环阈值）值归一化至内参基因（如 Hprt 和 Pde12）水平，具体方法见文献38。引物序列参见文献20。
      备注：应遵循 RT-qPCR 分析的标准操作规范，包括设置无逆转录酶对照（-RT 控制）、PCR 反应对照以及引物验证。

结果

肌内脂肪的免疫荧光可视化
按照上述步骤并参考图1A，取自甘油损伤后21天的胫骨前肌（TA）组织切片，部分样本在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻后立即保存，另一部分则用4%多聚甲醛（PFA）固定2.5小时。经冷冻切片和染色处理后，对两个样本均在肌肉中段（即TA最大横截面区域）进行成像。未固定的TA样本中的PERILIPIN+脂肪细胞（图1B）与固定后的切片（图1C）相比，形态发生显著改变，导致其识别、观察以及后续定量分析更加困难且可能不准确。值得注意的是，首次检测到PERILIPIN+脂滴约在损伤后第5天，大多数脂肪细胞在第7天时已形成。至损伤后21天，脂肪细胞已完全成熟。

由于每块胫骨前肌（TA）中的脂肪含量与诱导损伤的严重程度密切相关，因此必须对TA造成足够严重的损伤，才能有效观察和研究肌内脂肪的形成。使用墨水在尸体TA上练习注射是提高损伤严重程度的有效方法。成功的损伤通常超过肌肉总体积的50%。需要注意的是，受损的肌肉区域表现为无肌纤维的区域，或存在至少一个细胞核位于中央的肌纤维区域，后者是再生肌纤维的典型特征。

该方案可轻松适用于三维条件下对FAP和脂肪进行染色。具体操作为，从TA肌肉经固定后小心分离出多根肌纤维，随后进行整体免疫荧光染色。关键在于需将纤维妥善固定于载玻片上，同时避免组织受到过度压迫。通过使用可塑性黏土垫脚，操作者可调节所需厚度，并将盖玻片牢固固定在载玻片上，甚至可适用于倒置显微镜观察（图4A）。该方法已成功用于标记PDGFRα+ FAPs、Phalloidin+肌纤维以及表达PERILIPIN的脂肪细胞（图4B，补充视频1和补充视频2）。在获取跨越多达150 µm厚度的多个z平面图像后，利用显微镜软件中的三维重建模块生成三维重构图像。

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图 4：整体免疫荧光染色。 （A）样本封片及加盖盖玻片进行整体染色的顶视图与侧视图。（B）纤维脂肪生成祖细胞（绿色；左）、脂肪细胞（红色；右）、肌纤维（灰色）和细胞核（蓝色）的代表性三维重建图像。比例尺：50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

肌内脂肪含量的定量分析
获取肌内脂肪图像后，使用 ImageJ/FIJI 中的细胞计数功能手动计数 PERILIPIN 阳性细胞的数量+ 脂肪细胞（图 5A）。接下来，测定肌肉切片的总面积以及由肌纤维内中央细胞核所定义的损伤区域面积。为控制损伤严重程度的影响，将脂肪细胞的总数除以损伤区域面积，得到每1 mm²损伤区域内的脂肪细胞数量。2 受伤肌肉。通常，表现出 <30% 的损伤区域被排除在定量分析之外。需要注意的是，尽管在无损伤情况下脂肪细胞极为罕见，每个横截面区域仅零到八个，但脂肪细胞总数仍按总面积进行了标准化处理。如文中高亮所示 图5B，与未受伤的TA肌肉相比，甘油损伤会导致肌肉内脂肪大量增加。或者，由于Perilipin染色效果非常清晰且信噪比较高，也可使用该方法 分析颗粒 用于确定Perilipin所占据的总面积。然而，该方法无法区分脂肪细胞较小还是数量较少。每只小鼠至少选取四只不同个体动物的三个切片进行成像和定量分析，并计算每只小鼠脂肪细胞的平均数量。

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图5：肌内脂肪的定量分析。（A）使用ImageJ中的Cell Counter功能计数PERILIPIN+脂肪细胞（白色）的代表性图像。比例尺：50 µm。（B）甘油注射后21天，对整个胫骨前肌（TA）脂肪细胞数量进行定量，并归一化至损伤区域每1 mm2。每个数据点代表一只小鼠的平均值。误差线表示标准误（SEM）。**** = p < 0.0001。（C）匀浆后经氯仿相分离所得的RNA层用于RT-qPCR分析。（D）甘油损伤后不同时间点，早期成脂基因Pparg和Cepbα，以及两个成熟脂肪细胞标志物Plin1和Adipoq的表达水平变化倍数。每个数据点代表一只小鼠的平均值。误差线表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

为了独立验证肌内脂肪的含量，可检测多种脂肪生成标志物的基因表达水平。为此，可在损伤后的不同时间点，从用于免疫荧光分析的同一部分胫骨前肌（TA）肌肉组织中提取RNA（见上述步骤）。采用珠磨机结合硫氰酸胍对组织进行匀浆。加入氯仿并离心后，小心提取上层含RNA的液体，并使用小型离心柱进行RNA纯化（图5C）。该方法通常可获得高质量和高产量的RNA，适用于RT-qPCR和RNA测序等所有后续分析。在RT-qPCR中，通过ΔΔCT法38计算脂肪生成相关基因相对于看家基因的相对表达水平，并评估其变化。如图5D所示，与未损伤的TA肌肉相比，甘油损伤后3天即可诱导早期脂肪生成标志物如Pparg和Cebpα的表达。而成熟脂肪细胞标志物，如Adiponectin（Adipoq） 和Perilipin（Plin1），在甘油损伤后5天即可检测到表达。

脂肪细胞的遗传谱系示踪
此处介绍的脂肪细胞染色方案可轻松扩展，以包含对脂肪前体细胞（FAPs）的遗传谱系示踪，从而绘制并追踪其向脂肪细胞的分化命运。例如，我们此前已证明可诱导发生重组 通过 他莫昔芬给药在 PdgfrαCreERT2；Rosa26EYFP 小鼠在损伤前2周，有效移除了floxed终止密码子，从而在FAPs中永久激活EYFP表达（图6A）。我们采用本文所述的他莫昔芬给药方案实现了较高的重组效率，约75%的PDGFRα+ 表达EYFP的FAPs20，这与其他实验室报道的结果相似27,39,40. 证明FAPs确实是肌内脂肪的细胞来源，大部分FAPs已转化为EYFP+ 甘油损伤后7天表达PERILIPIN的脂肪细胞（图6B).

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图6：FAPs的谱系示踪。 （A）实验设置的示意图概述。（B）代表性免疫荧光图像，显示PDGFRα+ FAPs（红色，箭头）和PERILIPIN+脂肪细胞（红色，星号）中EYFP（黄色）的成功重组与激活。比例尺：25 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

多种细胞类型的检测
本方案也可用于可视化肌源性区室。使用针对 PAX7 和 MYOD1 的抗体，可在甘油损伤后第 5 天轻松检测到肌肉干细胞（MuSCs）和成肌细胞，即使在 PFA 固定的肌肉组织切片中亦可实现（图 7）。因此，本研究所提供的方案具有良好的通用性和适应性，不仅可用于标记和成像脂肪细胞和脂肪前体细胞（FAPs），还可拓展至肌源性谱系的其他细胞类型。

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图7：肌肉干细胞与成肌细胞的免疫荧光染色。（A）实验设置的示意图。（B）代表性免疫荧光图像，显示肌肉干细胞（MuSC）（左侧，黄色）经PAX7染色，成肌细胞（右侧，黄色）经MYOD1染色，结果均呈阳性。LAMININ标记肌纤维轮廓（白色），细胞核呈青色。比例尺：50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 1：FAPs 的三维重建。损伤后 21 天，经 PHALLOIDIN（灰色）、PDGFRα（绿色）和 DAPI（蓝色）染色的肌纤维、FAPs 及细胞核的三维重建图像。请点击此处下载该视频。

补充视频 2：肌内脂肪的三维重建。 肌纤维束（灰色，PHALLOIDIN）和肌内脂肪（红色，PERILIPIN）的容积重建图像，显示在甘油损伤后 21 天，肌纤维已被脂肪组织取代。 请点击此处下载该视频。

讨论

本方案详细阐述了一种全面且精细的方法，可实现对肌内脂肪的高效可视化和严格定量分析。通过将同一块肌肉分为两部分，分别用于免疫荧光和RT-qPCR分析，该方案具有很高的灵活性。此外，该方案还可与脂肪前体细胞（FAPs）的遗传谱系示踪技术相结合，用于研究在特定条件下FAPs向脂肪细胞的转化过程，并可高度适应于多种其他细胞类型的标记与成像。

观察肌内脂肪最常用的方法是石蜡切片后进行苏木精和伊红染色，或对冰冻切片使用亲脂性染料（如油红O（ORO））染色。然而，尽管石蜡处理的组织能提供最佳的组织学结构，但该过程会完全提取脂质，从而无法使用亲脂性染料。虽然亲脂性染色方法可用于多聚甲醛（PFA）固定或未固定的组织切片，但在盖玻片上施加压力时脂滴容易发生移位，从而导致肌内脂肪空间分布的失真。为克服这一问题，最近一项研究建立了一种严格的全组织铺片法（whole-mount）来可视化 ORO+ 脂肪细胞。在该方法中，作者对胫骨前肌（TA）进行去细胞化处理，以在整个 TA 中观察肌内脂肪的空间分布41。尽管该技术功能强大，但它也限制了其他共染色方法的使用，无法标记额外的细胞结构。本文所介绍的全组织免疫荧光方法可用于将脂肪细胞与多种标记物进行共染色，从而实现对细胞微环境的精细定位。然而，其中一个主要挑战是抗体在组织中的渗透。肌纤维保留得越多，抗体均匀渗透并结合所有可用抗原的难度就越大。因此，该方法在观察少量肌纤维群时效果最佳。与此同时，这也构成了一项局限性：当仅聚焦于小块剥离的肌纤维束时，肌内脂肪的整体解剖位置信息将会丢失。然而，随着新型组织透明化方法以及成像技术的不断发展，未来将有望实现更深层次的组织渗透与可视化42,43,44。

尽管预先固定肌肉组织可保存脂肪细胞的形态，但也会对肌纤维大小的评估造成困难，而肌纤维大小是衡量肌肉健康状况的重要指标。肌纤维大小通过测量肌纤维的横截面积来确定。我们此前曾报道，肌肉组织预先固定会导致大多数可用于勾勒肌纤维的标记物失效31。为克服这一难题，我们开发了一种新型图像分割流程，可在已固定的肌肉切片中实现肌纤维大小的测量31。因此，我们建立了一套稳健且高效的组织处理流程，结合本方案可克服肌肉组织预先固定带来的大多数不利影响。

该方法的另一个主要优势在于其多功能性。通过将胫骨前肌（TA）分为两部分，可从一块肌肉中获取的信息量达到最大化。这不仅减少了实验动物的使用数量，还通过基因表达验证组织学结果，反之亦然，从而增加了一层额外的对照。此外，除脂肪生成相关基因外，还可检测多种其他不同基因。所提取的RNA还可用于全肌肉RNA测序实验。最后，速冻保存的肌肉组织也可用于蛋白质相关研究。本方案的一个局限性在于损伤可能在TA肌肉全长范围内不一致。这可能导致两部分肌肉所含肌内脂肪量出现差异，因而此类样本可能需要从后续分析中排除。因此，不建议仅依赖RT-qPCR结果对肌内脂肪含量得出主要结论，而应将其作为组织学定量结果的辅助数据。

综上所述，本方案建立了一个稳健、高效且严谨的组织处理流程，可用于可视化和定量分析肌内脂肪，这是开发新型治疗策略以应对脂肪纤维化的第一步。同时，该方法具有良好的通用性，可适用于肌肉中多种不同类型的细胞以及其他组织中的脂肪细胞。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢Kopinke实验室的成员在数据收集和手稿审阅方面提供的帮助。我们还要感谢佛罗里达大学肌病研究所的成员对手稿提出的宝贵意见。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R01AR079449支持。图2使用BioRender软件绘制。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% PFA（12 瓶装，每瓶 10 mL）Electron Miscroscopy Sciences15710
2.0 mL 微量离心管Fisher Scientific05-408-138用于速冻/珠磨的微量离心管
2-甲基丁烷（4 L）Fisher ChemicalO3551-4异戊烷
无水乙醇（200 证明）ThermoFisher ScientificBP2818100
AffiniPure Fab 片段驴抗小鼠抗体Jackson ImmunoResearch715-007-003小鼠抗小鼠封闭
Alexa Fluor 488 驴抗鸡二抗Jackson ImmunoResearch703-545-155
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠二抗InvitrogenA21202
Alexa Fluor 488 驴抗兔二抗InvitrogenA21206
Alexa Fluor 568 驴抗山羊二抗InvitrogenA11057
Alexa Fluor 568 驴抗兔二抗InvitrogenA11037
Alexa Fluor 568 Phalloidin 抗体InvitrogenA12380溶于 1.5 mL 甲醇（工作液浓度约 66 µM）
BioLite 24 孔多孔培养皿ThermoFisher Scientific930186用于 PFA 组织孵育的 24 孔板
Biometra TOneanalytikjena8462070301PCR 仪
鸡抗 GFP 抗体Aves LabsGFP-1020
氯仿/异戊醇 24:1（v/v），分子生物学级，无 DNA 酶、RNA 酶和蛋白酶ThermoFisher ScientificAC327155000
玉米油Sigma AldrichC8267
DAPI 染色液InvitrogenD1306150 µM 工作液，溶于 dH2O
驴血清（100 mL）Millipore Sigma5058837用于封闭液
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-20尖头镊子
直头精细剪刀，9 cmFine Science Tools14060-09
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01封片介质
甘油，99.5%，分子生物学级（500 mL）Acros Organics327255000
山羊抗 PDGFRα 抗体R&DAF1062
杂交炉VWR230301V用于他莫昔芬孵育
ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔Vector LaboratoriesH-4000疏水笔
带 Micro-Fine IV 针头（28 G）的胰岛素注射器BD329461
带滑动接头的胰岛素注射器，1 mLBD329654无针头胰岛素注射器，用于口服灌胃
iScript cDNA 合成试剂盒Bio-Rad1708890
异氟烷Patterson Veterinary78938441
Leica DMi8 倒置显微镜Leica用于宽场免疫荧光和共聚焦成像的显微镜
载玻片VWR48311-703带正电荷的显微镜载玻片
小鼠抗 MYOD 抗体InvitrogenMA1-41017
小鼠抗 PAX7 抗体（上清液）DSHBAB 428528
MX35 Premier+ 切片机刀片ThermoFisher Scientific3052835切片机刀片
NanoDrop 2000 分光光度计ThermoFisher ScientificND2000用于测定 RNA 产量的分光光度计
培乐多（Play-Doh）Hasbro模型材料
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisher ScientificA25742绿色染料 PCR 预混液
Puralube Vet 眼膏Puralube17033-211-38兽用眼膏
QuantStudio 6 Flex 实时 384 孔 PCR 系统Applied Biosystems4485694qPCR 仪
兔抗 perilipin 抗体Cell Signaling Technology9349S
Red-Rotor 摇床Hoefer ScientificPR70-115V用于免疫荧光染色的摇床
Richard-Allan Scientific Slip-Rite 盖玻片ThermoFisher Scientific152460盖玻片
RNeasy Mini 试剂盒QIAGEN74106包含 Mini 离心柱
Safe-Lock 管，1.5 mL，无色Eppendorf22363204
样品管 RB（2 mL）QIAGEN990381
叠氮化钠Alfa Aesar14314
不锈钢珠，2.8 mmPrecellysKT03961-1-101.BK小珠
不锈钢珠，5 mmQIAGEN69989中等大小珠
不锈钢珠，7 mmQIAGEN69990大珠
不锈钢一次性手术刀Miltex327-4102手术刀
不锈钢饲管，20 G × 38 mm，直头Instech LaboratoriesFTSS-20S-3灌胃针
他莫昔芬Toronto Research ChemicalsT006000
Tissue Plus O.C.T. 包埋剂Fisher HealthCare4585包埋介质
TissueLyser LTQIAGEN85600珠磨仪
TissueLyser LT 适配器，12 管QIAGEN69980
Tissue-Tek 冷冻模具Sakura4566样本模具
吐温 X-100Alfa AesarA16046
TRIzol 试剂ThermoFisher Scientific15596026硫氰酸胍
Tween20（500 mL）Fisher BioReagentsBP337-500
VWR 显微载玻片 - Superfrost PlusVWR48311703
Wheaton Coplin 染色缸Millipore SigmaS6016Coplin 染色缸

参考文献

  1. Milad, N., et al. Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).
  2. Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
  3. Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
  4. Goodpaster, B. H., et al. The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).
  5. Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
  6. Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
  7. Burakiewicz, J., et al. Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy. Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).
  8. Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. MRI of normal and pathologic skeletal muscle. American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).
  9. Willcocks, R. J., et al. Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort. Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).
  10. Wokke, B. H., et al. Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).
  11. Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).
  12. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  13. Joe, A. W., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  14. Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
  15. Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration. Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).
  16. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).
  17. Hogarth, M. W., et al. Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B. Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).
  18. Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  19. Stumm, J., et al. Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury. Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).
  20. Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
  21. Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells. PLoS One. 7 (10), 47496(2012).
  22. Sun, Y. -M., et al. PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).
  23. Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).
  24. Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
  25. Santini, M. P., et al. Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner. Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).
  26. Uezumi, A., et al. Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle. Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).
  27. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  28. Soliman, H., et al. Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
  29. Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation. Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).
  30. Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
  31. Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle. Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).
  32. Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
  33. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).
  34. Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), 71084(2013).
  35. Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury. Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).
  36. Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).
  37. Kawai, H., et al. Experimental glycerol myopathy: a histological study. Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).
  38. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  39. Uezumi, A., et al. Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).
  40. Biferali, B., et al. Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair. Science Advances. 7 (23), 9371(2021).
  41. Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).
  42. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).
  43. Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease. iScience. 23 (8), 101432(2020).
  44. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).

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