降低肌肉损伤风险的小鼠剂量调整阻力训练

运动对骨骼肌具有许多健康益处（在Vina等人1中进行了^评论）。具体来说，渐进式阻力训练（PRT）涉及对逐渐增加的外部负荷（例如杠铃，哑铃，电缆滑轮重量电路）进行肌肉收缩，已知有助于增加健康个体和患者群体的肌肉质量和力量（在以前的出版物^2，3中进行了综述。).PRT基于过载原理，该原理指出，当肌肉对逐渐增大的外部负荷收缩时，它通过增加其生理横截面积以及产生力的能力来适应⁴。啮齿动物PRT的现有模型包括爬梯，对尾部施加阻力，激动剂肌肉共同收缩对抗拮抗剂的阻力，使用加重安全带跑步，由电击引起的蹲下运动，以及抵抗^轮子奔跑5，⁶，⁷，⁸，^9，10（在以前的出版物中回顾^11，12).然而，目前还没有研究工具可以在小鼠中进行精确的肌肉靶向，剂量调整的PRT，这与人类临床研究和实践中使用的PRT方法和设备非常相似^12，13。这限制了研究人员在小鼠的基础和临床前研究中研究精确剂量PRT的安全性和有效性的能力。

为了克服这一障碍，本研究基于现代体育馆阻力训练设备中使用的电缆滑轮重量电路设计，开发了一种PRT方法和设备^14，15，16。这种PRT方法称为剂量调整阻力训练（DART），该设备称为DART设备。除了作为精密康复训练工具的功能外，DART设备还可以用作独立仪器，客观地评估小鼠胫骨前（TA）肌肉可以产生的最大同心收缩扭矩，类似于在人类中评估一次重复最大值（1RM，在保持良好状态的同时可以成功抬起/移动/按压/蹲一次的最大负荷）^17，18.DART装置还可以与定制或商用等速测功机结合使用，以测量小鼠TA肌肉产生的峰值等距手足搐年力（与人类的最大自主收缩[MVC]相当），然后执行剂量调整PRT，阻力基于峰值强伤风力（例如，峰值力的50%）。

本文介绍了DART设备的构造，并解释了如何将其与先前出版物¹⁹，^20，21，²²中描述的定制测功机相结合^，以评估收缩扭矩并执行DART。该研究还描述了如何使用DART装置来比较由单次DART（4组10次同心偏向收缩，50%1RM）引起的运动引起的肌肉损伤与在2B型肢带肌营养不良症小鼠模型中由相当的等长收缩（4组10次等长收缩）引起的损伤。 或LGMDR2）^23，24。所研究的小鼠模型缺乏一种称为dysferlin的蛋白质，该蛋白质在保护骨骼肌免受损伤性离心收缩后延迟性肌肉损伤方面起着重要作用²²，25，²⁶，^27，28，^29，30.在地狱吼缺陷的雄性小鼠中也证明，同心偏向的强制运动不像偏心的强迫运动那样具有破坏性，并且先前暴露于同心偏向训练可以防止随后一阵偏心收缩的伤害²²。由于进行本研究是为了测试目前的DART方法和设备在执行剂量调整，同心偏置阻力训练中的可行性，因此选择雄性地狱缺陷小鼠进行调查，以将DART设备的新数据与以前的数据进行比较。在未来的研究中，将包括雌性BLAJ小鼠，以研究性别作为与DART反应相关的生物变量的影响。对~1.5岁的小鼠进行了研究，因为它们已经在许多肌肉群中发生了营养不良变化，因此，模拟了已经有肌肉无力和消瘦并正在寻求康复护理以维持肌肉质量和力量的患者的病理生理状态²⁶。

本文中描述的实验由美国密歇根州底特律韦恩州立大学的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 根据实验动物护理和使用指南（1996 年，由美国国家学院出版社出版，2101 Constitution Ave. NW，华盛顿特区 20055，美国）批准。B6.本研究使用模型LGMD2B / R2的A-Dysf^{prmd /} GeneJ小鼠（又名BLAJ小鼠，雄性，~1.5岁）。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 研究设计

1. 选择与研究问题相关的小鼠品系 - 例如，研究B6。A-Dysf^{prmd /} GeneJ小鼠（BLAJ小鼠）如果试图回答同心偏向DART是否在模拟LGMD2B / R2的小鼠中引起广泛肌肉损伤的问题。
2. 根据研究设计将小鼠分配到研究组 - 例如，将小鼠随机分配到剂量调整阻力训练（DART）组或等长训练组（ISOM），并尝试根据按窝和/或年龄匹配尽可能平衡组（例如， 表1）。

2. 飞镖装置的制造

1. 按照以下步骤使用合适的计算机辅助 （CAD） 软件（图 1）设计 DART 设备组件。
   1. 设计用于低摩擦轮轴承的轴承座（参见 材料表，基于基座轴承设计），带有内置量角器（用作测角仪来测量踝关节角度）。
   2. 设计一个用于轮毂轴承座和量角器的塔。
   3. 设计一个用于定位鼠标脚的踏板。设计一个车轴，将踏板连接到车轮轴承。
2. 使用合适的 3D 打印机制造 DART 设备组件（图 1）。
   1. 将使用CAD软件创建的设计保存为立体光刻（.STL 扩展名）文件。
      注:.STL文件（补充编码文件1-4）可以通过注明本文的通讯作者并引用本文来使用和修改。
   2. 打开 .带有合适切片软件的 STL 文件（参见 材料表）。
      注意:切片软件将虚拟3D模型转换为一堆切片，3D打印机可以按顺序打印以生成3D对象。
   3. 使用切片软件，生成G代码计算机辅助制造（CAM，.GCODE 扩展名）文件，特定于将使用的 3D 打印机和灯丝。
   4. 按照 3D 打印机手册（请参阅 材料表）打印带有 的 DART 设备组件。GCODE 文件。
   5. 选择合适的3D打印机线材，例如聚乳酸（PLA）1.75毫米1公斤/线轴，灰色（见 材料表）。
3. 按照以下步骤组装 DART 设备。
   1. 将 608 低摩擦轮毂轴承（孔径 8 mm，外径 22 mm，例如带有氮化硅陶瓷球的轮毂轴承，采用 420 不锈钢，参见 材料表）插入轮毂轴承座（图 1）。
   2. 将车轴插入轮毂轴承的孔中（图1）。
   3. 用适合粘合PLA的胶水（参见 材料表）将踏板粘贴到车轴上（图1）。
   4. 将轮毂轴承座放在轮毂轴承座塔上方，并使用螺钉紧固件将整个组件连接到丙烯酸底座上（图 1）。
      注意:亚克力底座没有特定的尺寸要求——它只需要足够大以容纳动物和 DART 设备，并且足够小以适合工作台面。本研究使用的丙烯酸底座宽约30厘米，长45厘米，厚0.5厘米。

3. 用于DART或ISOM的小鼠的制备

1. 将每只小鼠置于全身麻醉下，吸入异氟醚通过合适的麻醉系统输送（参见 材料表，2%-5%用于诱导;1%-4%用于维持;以达到效果）以减轻压力和疼痛。
   1. 在麻醉系统的诱导室（2%-5%异氟醚）诱导麻醉。
   2. 将小鼠转移到鼻锥上以维持麻醉，同时对动物（1%-4%异氟醚）进行操作。根据后肢无退缩到一把镊子的脚趾捏合来确认麻醉效果。
   3. 提供热支持——例如，使用等温凝胶加热垫和放置在鼠标上方 ~1 m 的加热灯。用温度计检查以确保丙烯酸底座上和周围的温度保持在~38°C，这样鼠标就不会过热。
2. 准备小鼠左胫骨前（TA）肌肉和左后肢整个前侧和外侧的皮肤以进行DART或ISOM。
   1. 用脱毛霜（脱毛膏，见 材料表）去除小鼠的皮毛。涂抹脱毛膏，让它工作~2分钟。
   2. 用浸泡在蒸馏水中的湿巾清洁腿部，以去除皮肤上的皮毛和所有残留的乳霜。脱毛膏如果长时间留在小鼠的皮肤上，会刺激和/或损害皮肤，因此可以完全去除。
   3. 去除皮毛后，使用批准的擦洗方法对皮肤进行消毒，例如使用聚维酮碘擦洗溶液和 70% 乙醇。
3. 用干净的棉签将保护剂（例如凡士林）涂抹在眼睛和脱毛的皮肤上，以保护眼睛和脱毛的皮肤不干燥。
4. 将稳定针穿过胫骨干骺端。
   1. 在胫骨上涂抹 5% 利多卡因乳膏以麻痹该区域。
   2. 将 26 G 半英寸无菌皮下注射针穿过胫骨近端最宽的部分（即胫骨干骺端，也称为胫骨头）。固定稳定针后，用无菌止血器握住针头并弯曲塑料部分直至其断裂，从而去除皮下注射针头的塑料部分。
5. 定位鼠标以进行 DART 或 ISOM 训练。
   1. 将鼠标置于仰卧位。确保鼠标仍牢固地连接到鼻锥以保持麻醉。
   2. 用一对无菌尖端的镊子，将胫骨销送入金属鳄鱼夹中（见 材料表），使胫骨别针的末端由鳄鱼夹固定。移动鳄鱼夹的可调节臂，以确保鼠标的脚放在 DART 设备的踏板上。
   3. 用实验室胶带将鼠标的脚绑在DART设备踏板上。
   4. 将鼠标的脚相对于鼠标胫骨的长轴呈 90° 角放置。如果放置正确，踏板将垂直于丙烯酸底座（即地板或被认为是水平面的东西）。
   5. 将踏板放在通过DART设备量角器上的预钻孔放置18 G，1.5英寸长的皮下注射针创建的足底屈止动块上（图1）。

4. 飞镖或ISOM培训

1. 通过将双极，经皮，神经肌肉电刺激（NMES，参见 材料表）电极放置在小鼠膝关节的下外侧（图1B）来优化电极放置。
   1. 用来自实验室电刺激器的单脉冲（1 Hz）（见 材料表），刺激坐骨神经的腓骨分支，为踝背屈肌提供运动神经支配（图1B）。
   2. 由于胫骨前肌 （TA） 肌肉占踝关节背屈肌产生的总收缩力的 90% 以上³¹，因此观察 TA 肌肉腹部和肌腱是否有电诱发抽搐收缩的证据。
      注意:如果测试人员可以通过电极感觉到与腓骨相对应的轻微骨突出可能有助于电极放置。这需要测试仪进行一些练习和学习，以感受最佳的电极放置。
   3. 将足底屈止动块移动到量角器上的孔上，该孔对应于足跖屈曲的 20°，从足部与胫骨正交的位置 （90°） ——根据以前的报告，这是通常观察到 TA 肌肉最大收缩扭矩的位置²¹。这可能必须由用户根据正在研究的小鼠的特定因素进行定制。
   4. 通过将DART设备踏板连接到测功机踏板，使用鼠标测功机可视化抽搐扭矩 - 例如，将DART设备踏板连接到带有非弹性丝线的定制机器人踝关节测功机踏板（类似于 图1A），并将缝合线绑在测功机踏板上（见 材料表）。
      注意:踏板在 3D 打印设计中内置了孔。将缝合线通过脚踏板脚趾末端第二排的一对孔放置，将缝合线置于距离背屈/跖屈轴~20毫米处（图1A，B）。测功机已在以前的报告¹⁹，^20，21，22中描述过。
2. 优化 NMES 刺激器的电压输出。
   1. 优化电极放置后，优化电刺激器输出的电压幅度——这对于将 NMES 限制在腓总神经和 TA 肌肉并降低引起足底屈肌共收缩的风险是必要的。
      注意:如果引起共同收缩，可以通过测功机输出的扭矩看到它们，也可以在脚趾的跖部弯曲中看到。
3. 为 DART 或 ISOM 训练设置 NMES 刺激器。
   注意:以下设置可能必须由用户根据正在研究的小鼠的特定因素和研究目的进行自定义。
   1. 设置刺激器以产生频率为 125 Hz 的重复脉冲序列——该频率产生最大的融合性破伤风收缩，而不会将 NMES 溢出到 BLAJ 小鼠²¹ 的其他肌肉群中。为此，请调整脉冲频率 （125 Hz）、列车持续时间 （500 ms） 和每秒列车数 （1 列/秒） 的拨动开关，并打开重复脉冲序列的拨动开关。
   2. 设置刺激器以产生持续时间为 500 毫秒的脉冲序列，并在脉冲序列之间穿插 500 ms 的休息。
   3. 将足底屈止动块移动到量角器上与胫骨长轴成 160° 的孔（从足部正交到胫骨的 70° 足底屈曲）。这是 BLAJ 鼠标的脚可以在没有软组织阻力的情况下被动移动到的位置²¹.
   4. 对于DART，施加适当的阻力，TA肌肉必须同心工作 - 例如，5 g，如图 1A，B所示;请参阅 补充文件 1 中的重量与扭矩校准曲线。
   5. 通过用绑在DART设备脚踏板上的非弹性丝线悬挂重物来施加阻力（图1A，B）。
   6. 调整阻力 - 即施加一次重复最大值 （1RM） 的 ~50%（例如，如果鼠标可以通过单次收缩举起 10 g 的最大重量，则为 5 g），这会将脚拉过至少一半的可用活动背屈范围。
   7. 在分配到DART组的小鼠中进行适当的DART训练 - 例如，进行单轮DART训练，其中包括四组10次重复的同心收缩，两组之间休息2分钟，类似于人类使用的渐进式阻力训练程序³² （见 补充视频1）。
   8. 在分配到ISOM组的小鼠中进行适当的ISOM训练 - 例如，进行单轮ISOM训练，包括四组10次重复等长收缩，两组之间休息2分钟，类似于DART（见 补充视频2）。
   9. 对于ISOM训练，将鼠标的脚与胫骨的长轴成160°（从脚正交到胫骨的70°跖屈），并通过将丝缝线粘在机器人测功机的踏板上来保持这种静态位置。
      注意:由于缝合线无法滑动，DART装置脚踏板无法进入背屈，从而限制了背屈肌等长收缩。

5. 小鼠的术后护理

1. 采取预防措施，保持运动后肢的适当卫生，减少针头部位疼痛。
   1. DART或ISOM训练后，用三重抗生素软膏（400U U / g杆菌肽，3.5mg / g新霉素和5000 U / g聚mixin-B）涂覆胫骨针的可见部分，然后小心地从胫骨内侧取出针。用聚维酮碘和无菌水冲洗大腿外侧和大腿的皮肤。在胫骨上涂抹 5% 利多卡因乳膏以控制针头部位疼痛。
2. 让小鼠从麻醉中恢复。
   1. 将鼠标从鼻锥中取出，让它在没有垫料的恢复笼中从麻醉中恢复过来。在小鼠从麻醉中恢复时为其提供热支持，例如，使用等温凝胶加热垫。
3. 从麻醉中完全恢复后，将鼠标放回原来的笼子。然后，将笼子放回动物设施，在那里饲养研究小鼠，直到进行后续实验。每天监测小鼠。

6. 组织采集

1. 收获整个小鼠TA肌肉，并按照以下步骤快速冷冻以进行冷冻保存。
   1. 根据研究问题，在训练后的适当时间（例如，DART或ISOM后3天），根据批准的方案对小鼠实施安乐死。
      注意:对于本研究，小鼠在全身麻醉下通过颈椎脱位（吸入异氟醚，2%-5%有效）实施安乐死。双侧开胸术确保死亡。
   2. 解剖小鼠后肢以去除锻炼的 TA 肌肉（左）和未锻炼的 TA 肌肉（右）。称量收获的肌肉。然后，将每块肌肉浸入矿物油中进行冷冻保护，并将肌肉放在干净的实验室湿巾上以吸干多余的油²¹。
2. 将肌肉放在一块铝箔上。用长止血器握住箔片的边缘，并迅速将箔片和肌肉浸入合适的塑料容器中包含的液氮中，以快速冻结肌肉。
   1. 在液氮中浸泡约2分钟后，将冷冻的肌肉转移到标记的低温小瓶中。将小瓶储存在-80°C冰箱中，直到需要进一步研究。

7. 肌肉组织的组织学研究

1. 准备厚度为5μm的TA肌肉的低温恒温器切片。将低温恒温器切片收集到带电显微镜载玻片上。用丙酮固定切片，丙酮在-30°C下保持低温，并让切片风干。
2. 用苏木精染色肌肉组织切片，然后用伊红染色（H&E染色，见 材料表）。
   1. 将切片浸入玻璃染色罐中的苏木精（深蓝色核染色剂）中5分钟。用自来水冲洗切片，直到看不到进一步的水变蓝，以去除多余的苏木精。
   2. 将切片浸入玻璃罐中的发蓝试剂中5分钟。用玻璃吸液管从切片中吸出多余的发蓝试剂。
   3. 将切片浸入玻璃染色罐中的伊红（粉红色细胞质染色剂）中5分钟。通过将切片快速反复（~10次）浸入玻璃染色罐中的95%乙醇中来去除多余的伊红。
   4. 让切片风干，然后继续在光学显微镜下观察。
3. 通过显微镜成像准备整个 TA 肌肉横截面的高分辨率平铺图像。
   注意:用户可能必须根据其显微镜和图像采集和分析软件自定义成像和图像分析步骤。
   1. 使用光学显微镜的10倍物镜和安装在显微镜上的数码相机捕获数字图像。
   2. 捕获大约15-20张图像，以网格状的方式沿着每块肌肉的横截面移动，使得每个新图像与前一张图像重叠~25%。
      注意:此过程有助于捕获一组可以数字平铺（也称为图像拼接）的图像，以创建整个 TA 肌肉横截面的高分辨率合成图像（图 2）。
   3. 将数字图像保存在 中。TIFF格式。
   4. 使用合适的图像处理和分析软件打开数字图像（见 材料表）。
   5. 通过以下步骤将单个图像平铺或拼接成整个 TA 肌肉的合成图像: 在软件中打开每个 TA 肌肉的所有单独重叠图像后，单击文件>选择自动化>选择 照片合并>选择拼贴>选择添加打开的文件>然后单击确定。
   6. 准备并显示 TA 肌肉的新平铺/拼接图像时，请将图像保存在 中。TIFF格式，用于进一步分析。
4. 使用合适的图像分析软件，通过对整个 TA 肌肉的平铺图像进行视觉分析来量化肌肉损伤。
   1. 在图像分析软件中，选择"分析"菜单中的"测量"功能，以勾勒和测量整个TA肌肉横截面的面积（图2）。
   2. 在图像分析软件中，选择"分析"菜单中的"测量"功能，以概述和测量每个TA肌肉受损的区域，即显示肌纤维细胞质破坏，肌纤维缺失和炎症细胞浸润的区域²²（图2）。
   3. 将损伤总面积的总和表示为整个TA肌肉横截面积的百分比（图2，表2）。

8. 统计分析

1. 如表 1-3 所示组织数据，并使用合适的软件执行非配对T检验（如果通过正态性和齐次方差检验）³³ 或曼-惠特尼秩和检验（如果未通过正态性和同质方差检验）²¹ （参见 材料表）。

研究了年龄~1.5岁的BLAJ雄性小鼠。BLAJ小鼠模拟人类肌肉疾病LGMD2B / R2。这些小鼠特别容易受到单次离心肌肉收缩引起的延迟性肌肉损伤的影响22，29。因此，选择BLAJ小鼠进行这些研究，以了解DART是否可以通过精确调整TA肌肉必须以同心偏置方式工作的阻力来以非伤害方式进行。如果发现DART对BLAJ小鼠无害，那么它可能是一种无害的抵抗训练形式，可以单独应用或作为再生医学，遗传学，药理学和其他干预措施的辅助手段。

DART组和ISOM组之间BLAJ小鼠的年龄和体重非常匹配（表1）。在第 3 天（~72 小时），经过单轮训练后，运动的 TA 肌肉在 DART 和 ISOM 组中的损伤水平较低（<10% 损伤区域）——这与过去研究21，22 BLAJ 小鼠对离心肌肉收缩的反应形成鲜明对比，其中第 3 天报告了 ~40% 的受损纤维（图 2， 表 2）。当比较DART组和ISOM组的运动TA肌肉损伤面积时，发现DART组的肌肉损伤水平低于ISOM组（图2，表2）。DART组和ISOM组在第0天（基线）和第3天记录的最大破伤风扭矩没有统计学差异（表3）。

图 1:制造 DART 设备并将其应用于培训研究。 （A，B） DART 设备基于电缆滑轮重量电路设计，这是为人类设计的阻力训练设备常见的。（A） DART训练期间带有动物的DART装置。（B）在TA肌肉同心收缩期间脚踏板进入背屈（弯曲的绿色箭头，右）。同心收缩导致 5 g 阻力在重力作用下垂直移动（垂直绿色箭头，左）。通过经皮双极电极施加电刺激引起肌肉收缩。（C）DART设备的各个组件设计用立体光刻软件生成。STL文件，可以用切片软件打开。使用切片软件，生成特定于所用3D打印机和灯丝的G-CODE文件。DART设备的3D打印组件包括（C）用于608低摩擦车轮轴承的外壳，（D）用于车轮轴承外壳的塔，（E）踏板和（F）将踏板连接到车轮轴承的轴。3D打印组件被组合并安装在带有胶水和螺丝紧固件的丙烯酸底座上，如文本中所述，如（A）所示。请点击此处查看此图的大图。

图2:组织学研究。 DART 后第 3 天 （A） 或 （B） 异工治疗后 TA 肌肉的组织学变化。厚度为5μm的冷冻切片用苏木精和伊红染色。捕获多个重叠的数字图像并与成像软件合并在一起，以生成整个TA肌肉横截面的高分辨率平铺图像。定性组织学数据表明，DART组和ISOM组的肌肉损伤程度较低，但ISOM组的肌肉损伤程度略明显。黄色箭头指向 TA 肌肉横截面中的一些受损区域。 请点击此处查看此图的大图。

表1:小鼠的年龄和体重。 所研究的BLAJ小鼠在年龄和体重上非常匹配，DART组和ISOM组之间没有显着差异。 请按此下载此表格。

表2:TA肌肉损伤的定量分析。 肌肉损伤的程度表示为TA肌肉横截面总面积的百分比，并通过T检验进行分析。DART和ISOM训练在第3天导致低水平的肌肉损伤，与过去涉及BLAJ小鼠类似回合的离心收缩的研究相比。虽然DART组和ISOM组的肌肉损伤程度都很小，但DART组的损伤程度在统计学上较低。 请按此下载此表格。

表 3:收缩扭矩数据。 背屈肌产生的收缩扭矩是用连接到DART装置的机器人测功机研究的。DART组和ISOM组在运动当天（A，第0天）或运动后3天（B，第3天）测量的最大基线破伤风扭矩方面没有显着差异。尽管缺乏广泛肌肉损伤的组织学证据，但单次 DART 和 ISOM 在第 3 天与收缩性扭矩缺陷 （~40%） 相关。 请按此下载此表格。

补充视频1:小鼠的DART训练。请点击此处下载此视频。

补充视频2:小鼠的ISOM训练。请点击此处下载此视频。

补充文件 1:重量到扭矩校准数据、曲线和设置。请点击此处下载此文件。

补充编码文件 1-4:DART 设备组件的设计。请点击此处下载此文件。

作者没有相互竞争的经济利益。