方法文章

跨尺度染色体构象捕获

DOI：

10.3791/64001

⸱

2023年1月20日

 ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, University of Massachusetts Medical School, 2Howard Hughes Medical Institute

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hi-C 3.0 是一种改进的 Hi-C 实验方案，结合使用甲醛和二琥珀酰亚胺基戊二酸酯交联剂，并采用 DpnII 和 DdeI 限制性内切酶混合酶切，以提高染色质相互作用检测的信噪比和分辨率。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

染色体构象捕获技术（3C）用于检测三维染色质相互作用。通常使用甲醛（FA）进行化学交联以固定染色质相互作用，随后通过限制性内切酶消化染色质，并对片段末端进行重新连接，从而将三维（3D）空间上的邻近关系转化为独特的连接产物。最后，在逆转交联、去除蛋白质并分离DNA后，将DNA打断并制备用于高通量测序。在细胞群体中，基因组位点对之间的邻近连接频率反映了它们在三维空间中共定位的频率。

一个测序后的Hi-C文库可提供全基因组范围内所有位点对之间相互作用频率的信息。Hi-C的分辨率和精确度依赖于高效的交联，以维持染色质接触，以及对染色质进行频繁且均一的片段化。本文描述了一种改进的 原位 Hi-C 3.0 协议通过联合使用两种交联剂（甲醛 [FA] 和二琥珀酰基戊二酸酯 [DSG]）提高交联效率，随后采用两种限制性内切酶（DpnII 和 DdeI）进行更精细的消化。Hi-C 3.0 是一种单一实验流程，可精确量化基因组在较小尺度上的折叠特征（如染色质环和拓扑关联结构域 [TADs]），以及在全细胞核较大尺度上的特征（如区室结构）。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

染色体构象捕获技术自2002年以来已被广泛应用1。从根本上讲，所有构象捕获变体均依赖于固定DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用，以维持染色质的三维结构。随后进行DNA片段化，通常通过限制性酶切实现，最后将空间上邻近的DNA末端重新连接，从而将空间上接近的基因座转化为唯一的共价DNA序列。最初的3C实验方案采用PCR来检测特定的“一对一”相互作用。后续发展的4C实验可检测“一对所有”相互作用2，而5C技术则可检测“多对多”相互作用3。当染色体构象捕获技术结合下一代高通量测序（NGS）后，得以全面实现对全基因组范围内“所有对所有”基因组相互作用的检测，例如全基因组Hi-C4，以及类似的3C-seq5、TCC6和Micro-C7,8技术（另见Denker和De Laat的综述9）。

在Hi-C技术中，生物素标记的核苷酸用于在酶切后、连接前标记5′突出端（图1）。这使得可通过链霉亲和素包被的磁珠富集正确酶切并重新连接的片段，从而与GCC10方法相区别。Rao等人11对Hi-C实验流程进行了重要改进，即在完整细胞核内（即in situ）进行酶切和重新连接，以减少非特异性连接产物。此外，用MboI（或DpnII）替代HindIII进行酶切，可减小片段大小，提高Hi-C的分辨率。分辨率的提升使得能够检测到较小尺度的染色质结构，并更精确地定位基因组上的相互作用位点，例如由环挤出机制形成的CTCF结合位点之间的DNA环等顺式调控元件间的环状结构11,12。然而，这种高分辨率也带来了一些代价。首先，分辨率提高两倍需要测序读长数量增加四倍（22）13。其次，片段尺寸减小会增加将未酶切的相邻片段误判为已酶切并重新连接片段的可能性14。如前所述，在Hi-C中，已酶切并重新连接的片段与未酶切片段的区别在于连接位点处存在生物素标记。然而，必须有效去除未连接末端的生物素，以确保仅富集真正的连接位点14,15。

随着下一代测序（NGS）成本的降低，研究染色体折叠的细节变得更为可行。为了减小DNA片段的大小，从而提高分辨率，Hi-C方案可以改进为使用切割频率更高的限制性内切酶16，或联合使用多种限制性内切酶17,18,19。此外，在Micro-C中使用MNase7,8，或在DNase Hi-C中使用DNase20，可通过滴定实现最佳消化效果。

最近一项关于3C方法基本原理的系统性评估表明，采用1%甲醛（FA）进行初次交联，随后用3 mM DSG进行二次交联，可显著提高在所有长度尺度上对染色体折叠特征的检测效果17。此外，使用HindIII酶切的Hi-C技术是检测大规模折叠特征（如区室结构）的最佳选择，而Micro-C在检测小规模折叠特征（如DNA环）方面表现更优。这些结果促使发展出一种单一的高分辨率“Hi-C 3.0”策略，该策略结合使用FA和DSG交联剂，并随后采用DpnII和DdeI两种限制性内切酶进行双酶切21。Hi-C 3.0提供了一种适用于常规使用的有效策略，因其能够准确检测所有长度尺度上的染色体折叠特征17。本文详细描述了Hi-C 3.0实验操作部分，并展示了测序后可预期的典型结果。

染色质相互作用分析工作流程示意图：固定、消化、连接、DNA 纯化。
图 1：Hi-C 实验的六个步骤。 首先使用 FA，然后使用 DSG 固定细胞（1）；接着进行细胞裂解，并用 DdeI 和 DpnII 进行双重消化（2）；通过突出端补平加入生物素，随后连接邻近的平末端（3），然后进行 DNA 纯化（4）；在超声破碎和片段大小筛选之前，去除未连接末端的生物素（5）；最后，通过生物素 pull-down 富集，进行接头连接，并通过 PCR 扩增文库（6）。缩写：FA = formaldehyde；DSG = disuccinimidyl glutarate；B = Biotin。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 交联固定

  1. 甲醛固定：从单层培养细胞开始
    1. 将细胞接种于适宜培养基中，每150 mm培养皿收获5 × 106个细胞。
      注意：用户可选择任何适合的容器，以确保任意哺乳动物细胞系的最佳生长。此外，细胞也可从组织中分离获得。
    2. 使用连接真空泵的巴斯德吸管从150 mm培养皿中吸除培养基，用约10 mL HBSS洗涤2次。
    3. 在交联前立即于50 mL离心管中配制1%甲醛交联液：将22.5 mL HBSS与625 µL 37%甲醛混合，终浓度为1%，轻轻摇动混匀。
      注意：需在通风橱中操作；甲醛具有毒性。
    4. 向每个15 cm培养皿中加入23.125 mL 1%甲醛溶液，以进行细胞交联。
    5. 室温孵育10分钟，每隔2分钟手动轻轻摇动培养皿。
    6. 加入1.25 mL 2.5 M甘氨酸（终浓度128 mM），轻轻旋转培养皿以终止交联反应。
    7. 室温继续孵育5分钟，随后置于冰上孵育至少15分钟，彻底终止交联。
    8. 使用细胞刮或橡胶刮棒将细胞从培养皿上刮下。
    9. 用移液器将细胞悬液转移至50 mL锥形离心管中，在室温下以1,000 ×g离心10分钟，吸除上清液。
    10. 用10 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞沉淀一次，用移液器重悬细胞，然后在室温下以1,000 ×g离心10分钟。立即进入下一步DSG交联。
      注意：洗涤细胞沉淀时需小心，因细胞沉淀可能较松散，易造成细胞损失。
  2. 甲醛固定：从悬浮培养细胞开始
    1. 将细胞接种于适宜培养基中，每容器收获5 × 106个细胞。
      注意：用户可选择任何适合的容器，以确保任意哺乳动物细胞系的最佳生长。
    2. 收获前立即计数细胞，并将5 × 106个细胞转移至50 mL锥形离心管中。
    3. 在室温下以300 ×g离心10分钟，轻柔地形成细胞沉淀。
    4. 向45 mL HBSS中加入1.25 mL 37%甲醛，配制1%甲醛交联液，通过反复倒置混匀。
      注意：应一次性加入全部1.25 mL甲醛，不可分次加入。
      注意：甲醛具有高度毒性。
    5. 用移液器反复吹打，将细胞沉淀重悬于上一步配制的46.25 mL 1%甲醛交联液中。
    6. 在旋转仪、摇床上或每隔1–2分钟手动轻柔倒置离心管，室温孵育恰好10分钟。
    7. 加入2.5 mL 2.5 M甘氨酸（终浓度128 mM）以终止交联反应，通过倒置充分混匀。
    8. 室温孵育5分钟，随后置于冰上孵育至少15分钟，彻底终止交联。
    9. 在室温下以1,000 ×g离心10分钟，沉淀交联后的细胞，吸除上清液。
    10. 用10 mL DPBS洗涤细胞一次，然后在室温下以1,000 ×g离心10分钟。用移液器完全吸除上清液，并立即进入下一步DSG交联。
      注意：洗涤细胞沉淀时需小心，因细胞沉淀可能较松散，易造成细胞损失。
  3. 谷氨酸二琥珀酰亚胺酯（DSG）交联
    1. 在加入100 µL 300 mM DSG（终浓度3 mM）前，将细胞沉淀重悬于9.9 mL DPBS中，通过倒置混匀。
      注意：DSG对湿气敏感。必须在交联当天用DMSO新鲜配制300 mM DSG储备液。
      注意：DMSO中的DSG具有高度毒性。
    2. 在旋转仪上室温交联40分钟。
    3. 加入1.925 mL 2.5 M甘氨酸（终浓度400 mM），倒置混匀，室温孵育5分钟。
    4. 在室温下以2,000 ×g离心15分钟。
      注意：去除松散细胞沉淀的上清液时需小心。
    5. 将沉淀重悬于1 mL含0.05%牛血清白蛋白（BSA）的DPBS中，并转移至1.7 mL离心管。
      注意：添加BSA有助于减少细胞聚集。
    6. 在4 °C下以2,000 ×g离心15分钟，用移液器吸除上清液。
      注意：为避免损失沉淀，应迅速且彻底地移除上清液。
    7. 用液氮速冻沉淀，于-80 °C保存或立即进入下一步操作。

2. 染色体构象捕获

  1. 细胞裂解与染色质消化
    1. 重悬（用移液器吹打）交联的细胞等分试样（约 5 × 106 细胞）加入1 mL预冷的裂解缓冲液中（配方见 补充表 S1) 加入10 µL蛋白酶抑制剂混合物，冰上孵育15分钟，然后转移至Dounce匀浆器中。
      注意：使用前立即向裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。
    2. 在冰上将研杵A缓慢上下移动30次以裂解细胞，冰上孵育1分钟使细胞充分冷却，再进行30次研磨。
    3. 将裂解液转移至1.7 mL 微量离心管中.
      注意：保持悬液处于运动状态，因为细胞有时会黏附在移液枪头内。
    4. 将裂解后的悬液在 2,500 × g 室温下孵育5分钟。
    5. 弃去上清液，轻轻弹动或涡旋湿润的沉淀物以重新悬浮。尽可能彻底移除上清液，获得质地均匀、无明显结块的酸奶状物质。
    6. 将沉淀重悬于500 µL预冷的1×限制性缓冲液（由10×稀释而成；参见文末配方）中 补充表 S1) 并在 2,500 × g 条件下离心 5 分钟 g重复此步骤进行第二次洗涤。
      注意：1倍限制性缓冲液中的沉淀物比之前裂解缓冲液中的沉淀物更呈颗粒状。
    7. 将约 340 µL 的 1x 限制性缓冲液加入沉淀的残留体积中（残留体积取决于细胞大小），用移液器吹打重悬细胞，最终体积为 360 µL。
    8. 留出每种裂解液各18 µL用于染色质完整性（CI）检测。将CI样品置于4 °C保存。
    9. 向每个 Hi-C 管中加入 38 µL 的 1% 十二烷基硫酸钠（SDS），终体积为 380 µL，用移液器轻轻吹打混匀，避免产生气泡。
      注意：SDS 有毒。
    10. 在65 °C下静置孵育样品，精确孵育10分钟，以打开染色质。
    11. 立即将试管置于冰上，并按照所述方法加入Triton X-100配制消化混合液，以淬灭SDS。 表1.
    12. 向Hi-C管中加入107 µL消化混合液（总体积487 µL），在37 °C条件下于恒温混匀仪中孵育过夜（约16 h），进行染色质消化，孵育过程中采用间歇振荡（例如：900 rpm，运转30 s，暂停4 min）。
      注意：加入Triton至终浓度1%可淬灭SDS。
  2. DNA末端生物素标记
    1. 过夜消化后，将样品转移至65 °C孵育20分钟，以灭活残留的内切酶活性。
    2. 孵育期间，按所示配制补平主混合液 表2.
    3. 孵育结束后立即将样品置于冰上。
    4. 为每个样本留出10 µL消化对照（DC），并于4 °C保存。
    5. 用移液枪或离心方法去除盖子上的冷凝液。向每个样本中加入58 µL生物素填补混合液（总样本体积为535 µL），轻轻吹打混匀，避免产生气泡。
    6. 在23 °C下，将样品于恒温混匀仪中孵育4小时（例如，900 rpm，运行30秒，暂停4分钟）。
  3. 近端DNA片段的连接
    1. 按所示制备连接反应混合物 表3 在生物素填补反应孵育的同时。
    2. 向每个样本中加入 665 µL 连接反应混合液（总体积为 1,200 µL）。用移液器轻轻吹打混匀。
    3. 将样品置于恒温混匀仪中，于16 °C孵育4小时，期间进行间歇性振荡（例如：900 rpm，开启30秒，关闭4分钟）。含有共价交联染色质的样品可于4 °C保存数天。
  4. 交联逆转
    1. 用1×Tris低EDTA缓冲液（TLE；参见文内配方）将CI和DC样品的体积补至50 µL 补充表 S1).
    2. 向CI和DC样品中加入10 µL的10 mg/mL蛋白酶K。
    3. 在65 °C下孵育过夜，期间间隔振荡（例如，900 rpm，开启30秒，关闭4分钟）。或者，在Hi-C样品的DNA纯化过程中，对这些对照样本进行30分钟的交联逆转。
    4. 向每个 Hi-C 样本中加入 50 µL 10 mg/mL 蛋白酶 K，于 65 °C 孵育至少 2 小时，期间间隔震荡（例如，900 rpm，开启 30 秒，关闭 4 分钟）。
    5. 向每个Hi-C管中再加入50 µL 10 mg/mL蛋白酶K（总样本体积为1,300 µL），继续在65 °C下过夜孵育。孵育完成后，于4 °C保存，直至进行DNA纯化。
      注意：分次进行蛋白酶K孵育可确保蛋白质完全消化。
  5. DNA纯化
    1. 让离心管从 65 °C 冷却至室温。
    2. 将每个样品转移至15 mL离心管中，向每管加入2.6 mL（2倍体积）苯酚:氯仿:异戊醇。
      警告：苯酚:氯仿:异戊醇具有强毒性，为刺激性物质，且可能具有致癌性。
    3. 涡旋每根试管1分钟，然后将其内容物转移至15 mL相锁管中。
    4. 将样品在最大速度（1,500–3,500 × g）下离心5分钟 g在台式离心机中离心。
    5. 小心将水相倒入一支35 mL超速离心管中，并加入超纯水至终体积为1,250 µL。
      注意：使用适合现有超速离心机的离心管，或将样品分装至多个微量离心管中。
    6. 加入1/10th 加入约 125 µL 的 3 M 醋酸钠，颠倒混匀。
    7. 向每个样品中加入2.5倍体积（约3.4 mL）的预冷100%乙醇，通过添加预冷100%乙醇平衡离心管，然后充分颠倒混匀。
    8. 将试管置于干冰中孵育约15分钟（避免凝固）。
    9. 将离心管在18,000 × g 4 °C 下孵育 30 分钟。
      注意：对于角转子，请标记离心管中沉淀物所在的位置。
    10. 使用移液器从非沉淀一侧完全移除并弃去上清液。
      注意：此时沉淀物应已可见，可在离心管上标记其位置，因为在下一步干燥后可能不再清晰可见。
    11. 将样品风干约10分钟，或直至样品明显干燥。
    12. 将每个沉淀物用450 µL 1x TLE缓冲液通过移液或涡旋溶解，转移至带有3 kDa分子量截留值的0.5 mL离心过滤单元（CFU）中。
    13. 以最大速度离心菌落形成单位（CFU）10分钟，弃去上清液。用额外的450 µL 1× TLE缓冲液冲洗每个超速离心管，并将冲洗液转移至对应的CFU中进行另一次洗涤。
      注意：以该方式洗涤菌落形成单位（CFU）可在降低盐浓度的同时限制DNA的损失。
    14. 以最大速度离心CFU 10分钟，弃去流穿液。
    15. 向柱中加入 80 µL 1x TLE，然后将柱子转移至新的收集管中，于最大转速离心 2 分钟，以获得约 100 µL 的最终体积.
    16. 向每个样品中加入1 µL RnaseA（1 mg/mL；将10 mg/mL储存液稀释10倍），并在加热块、水浴或恒温混匀仪中于37 °C孵育至少30分钟。
    17. RNase 处理后，将样品从 37 °C 取出，置于 4 °C 保存，直至进行质量控制步骤。
  6. 检测染色质质量、酶切消化及样品连接
    1. 在2.4.5步骤中逆转交联后，将CI和DC样品冷却至室温，随后转移至预离心的2 mL相锁管中。
      注意：确保将相锁结内容以最大转速离心2分钟，形成沉淀。
    2. 加入200 µL苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋混匀1分钟。
    3. 将离心管以最大速度离心5分钟。
    4. 将每个样品的水相（约 50 µL）转移至新的 1.7 mL 微离心管中。
    5. 加入1 µL Rnase A（浓度为1 mg/mL），37 °C孵育至少30分钟。
    6. 按照建议将样品加入0.8%琼脂糖凝胶中 表 4.
      注意：质量控制所预期的结果如下所示 图2.
    7. 通过凝胶密度测定法或使用 Qubit 或 Nanodrop 对 DNA 进行定量。
      注意：准确的定量可确保后续实验步骤中加入正确的样品体积。使用多个已知数量的标准品绘制标准曲线。

表1：消化试剂。 请点击此处下载该表格。

表2：生物素填补试剂。*请注意，更换酶可能需要不同的缓冲液和生物素标记的dNTP。 请点击此处下载该表格。

表3：连接反应体系试剂。 缩写：BSA = 牛血清白蛋白。请点击此处下载该表格。

表4：用于质量和大小筛选评估的凝胶上样参数。 请点击此处下载该表格。

显示DNA按分子大小分离的琼脂糖凝胶电泳结果，标注了kb。
图2：琼脂糖凝胶显示典型的DNA纯化后质量控制结果。（A）CI对照应显示一条高分子量DNA条带。（B）DC和Hi-C样品显示出不同大小的DNA片段范围。Hi-C样品由于已连接成更大的片段，其分子量应高于DC。标记物的浓度范围可用于生成标准曲线。注意，在本示例中CI样品加载在单独的凝胶上，但建议将所有样品和对照一起加载并电泳运行。缩写：CI = 染色质完整性；DC = 消化对照；Hi-C = 邻近连接。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. Hi-C 测序文库的制备

  1. 去除未连接末端的生物素
    1. 按照所示准备生物素去除反应 表5.
      注意：通常 10 µg DNA 已足够，但最多可使用 30 µg。
    2. 将每个130 µL反应体系中的2份65 µL等分试样分别加入两个PCR管中。
    3. 转移至热循环仪或PCR仪中，按照所述条件孵育 表5.
      注意：样品可在此处于 4 °C 保存（数天至数周），或于 -20 °C 长期保存，或立即进行超声处理。
  2. 超声处理
    1. 将生物素去除步骤的样本重复样（总体积130 µL）合并至一个130 µL的超声破碎管中进行超声处理。
    2. 使用指定参数对样品进行超声处理 表6 以获得低于500 bp的紧密窄分布。
      注意：可使用不同类型的超声破碎仪，但为了获得较窄的片段分布（100–500 bp），可能需要优化超声破碎仪的设置参数。
  3. 使用磁珠进行大小筛选
    1. 将超声处理后的 DNA 从超声仪管中移取至 1.7 mL 低吸附管中。
    2. 用1×TLE将每个样本补至总体积为500 µL。应尽可能使体积接近500 µL，因为样本与磁珠混合物的比例对片段大小选择至关重要。
    3. 向每支试管中加入 400 µL 磁珠混合液，使磁珠混合液体积与样品体积的比例达到 0.8。
      注意：在此条件下，磁珠可捕获DNA片段 >300 bp，此为上清部分。上清液将含有片段 <300 bp，这将是较低的组分。
    4. 将离心管涡旋混匀，并在旋转仪上室温孵育10分钟。对于本步骤及其他片段大小选择比例，需确保样品总体积充分混匀。建议使用某些旋转仪所具备的“不规则模式”，该模式适用于较小体积的样品混合。
    5. 在磁性颗粒分离器（MPS）上室温孵育5分钟。
    6. 孵育期间，为每个样本向新的1.7 µL低吸附离心管中加入500 µL磁珠混合液。
      注意：这些试管将用于较低组分的下一轮大小选择，通过制备磁珠与样品比例为1.1:1的混合物来实现。
    7. 将离心管置于MPS上静置5分钟。
    8. 去除珠子上的上清液，并用150 µL磁珠混合液重悬。
      注意：此步骤通过增加磁珠数量而不增加体积，避免磁珠因DNA过载而饱和。
    9. 将步骤 3.3.5 中的上清液转移至已标记的试管中，用于收集下层组分（步骤 3.3.8）。
      注意：150 µL 磁珠混合液 + 400 µL 0.8x 磁珠混合液（总计 550 µL）除以 500 µL 初始样品 = 1.1x 磁珠混合液与样品的比例。
    10. 将下层组分管涡旋混匀，并在旋转仪上室温孵育10分钟。
      注意：磁珠将结合DNA片段 >100 bp，最终获得的磁珠结合片段大小为100–300 bp。
    11. 将下层组分管置于MPS上处理5分钟（室温）。
    12. 移除上清液，短暂离心试管，以尽可能彻底去除残留的上清液。
    13. 用 200 µL 70% 乙醇分别对两个组分中的磁珠各洗涤两次，每次在磁力架上回收磁珠 5 分钟。
    14. 离心机短暂离心后，彻底去除乙醇，并在磁力架上进一步干燥磁珠。
      注意：干燥至酒精完全蒸发。沉淀物应呈深巧克力色且无裂纹（约需10分钟）。
    15. 将两种组分均重悬于50 µL的1x TLE缓冲液中。室温孵育10分钟，每隔2分钟轻弹或轻敲离心管以促进混合与洗脱。
    16. 在 MPS 上将两种组分的珠子与上清液分离，离心 5 分钟。
    17. 保留每个样本的上清液。用移液器将上清液转移至1.7 mL低吸附离心管中。
      注意：样品可在 4 °C 下保存数天，或在 -20 °C 下长期保存。
    18. 运行2%琼脂糖凝胶，方法同前 表4 以确定样品的质量和数量。参见 图3 以获取此类凝胶的示例。
      注意：如果根据经验，超声处理具有高度可重复性，则可跳过此凝胶步骤，直接进行末端修复。建议用户在滴定PCR完成前保留上层组分。对于DNA量不理想、需要大量PCR扩增的样本，可从上层组分的材料中进行补救。
    19. 根据已知DNA标准品生成标准曲线后，直接从凝胶中定量DNA含量，或使用Qubit或Nanodrop进行定量。
  4. 末端修复
    1. 按照以下方法配制末端修复混合液 表7 （每反应用量如上所示）
    2. 将下层组分中剩余的 46 µL 洗脱 DNA 转移至 PCR 管中，并加入 24 µL 已配制的末端修复混合液。按照建议在 PCR 仪中孵育 表7.
    3. 程序完成后，将样品置于 4 °C 保存，直至进行下拉实验。
  5. 使用链霉亲和素包被磁珠下拉生物素化连接产物
    1. 根据定量后的片段筛选结果（步骤 3.3.19），确定每个文库所需的链霉亲和素包被磁珠量。
      注意：这些链霉亲和素包被的磁珠（10 mg/mL 溶液）每毫克磁珠可结合 20 µg 双链 DNA（= 20 µg / 100 µL 磁珠）。每 1 µg Hi-C DNA 使用 2 µL 磁珠，但用量不得少于 10 µL。
    2. 将链霉亲和素包被的磁珠混匀，并用移液器将每个文库所需的磁珠体积（按上一步计算）加入各自的1.7 mL低吸附离心管中。
    3. 将珠子重悬于 400 µL 吐温洗涤缓冲液（TWB；参见配方）中 补充表 S1）在旋转仪上室温孵育约 3 分钟（见步骤 3.3.4 中的说明）.
    4. 在MPS上将珠子与上清液分离1分钟，然后移除上清液。
    5. 用移液器加入400 µL TWB洗涤磁珠。
    6. 在MPS上将珠子与上清液分离1分钟，然后移除上清液。
    7. 加入 400 µL 的 2 倍结合缓冲液（BB）（配方见 补充表 S1将溶液加入磁珠中并重悬。此外，加入330 µL的1x TLE缓冲液以及末端修复反应液（来自步骤3.4.3）。
    8. 将样品在室温下孵育15分钟，同时在旋转仪上混匀。
    9. 在MPS上将珠子与上清液分离1分钟，然后移除上清液。
    10. 向珠子中加入 400 µL 1x BB 缓冲液并重悬。
    11. 在MPS上将磁珠与上清液分离1分钟，然后移除上清液。
    12. 加入 100 µL 1x TLE 洗涤磁珠。
    13. 在 MPS 上将珠子与上清液分离 1 分钟，然后移除上清液。
    14. 最后，加入 41 µL 1x TLE 以重悬磁珠。
  6. 加A尾
    1. 按照以下步骤配制A尾添加反应混合物 表8.
    2. 将反应液移液至PCR管中，并按照如下条件孵育 表8.
    3. 从PCR仪中取出PCR管后立即置于冰上，并将内容物转移至1.7 mL低吸附离心管中。
    4. 在 MPS 上将珠子与上清液分离 1 分钟，弃去上清液。
    5. 加入400 µL 1x连接缓冲液，该缓冲液由5x T4 DNA连接酶缓冲液用超纯水稀释而成。
    6. 在MPS上将磁珠与上清液分离1分钟，然后弃去上清液。
    7. 加入1×连接缓冲液，终体积为40 µL。
  7. 退火接头寡核苷酸
    1. 制备100 µM的接头寡核苷酸储备液（表9).
      注意：订购250 nmol经HPLC纯化的寡核苷酸。
    2. 按照所述在PCR管中退火接头 表9.
    3. 使用PCR扩增仪以0.5 °C/s的速率将温度逐渐升至97.5 °C，在97.5 °C下保持2.5分钟。
    4. 使用PCR仪以0.1 °C/s的速率逐步升温，进行775个循环（升至20 °C）。随后将温度保持在4 °C，待后续使用。
    5. 加入83 µL的1x退火缓冲液（配方见 补充表 S1) 将接头稀释至 15 µM。将接头于 -20 °C 保存。
  8. 测序接头连接
    1. 在1.7 mL低吸附离心管中配制接头连接反应体系（表10).
    2. 室温下连接2小时。
    3. 在MPS上将磁珠与上清液分离1分钟，弃去上清液。
    4. 加入400 µL TWB，轻轻吹打混匀磁珠，然后在室温下于旋转仪上孵育5分钟。在MPS上将磁珠与上清液分离，重复此步骤一次。
    5. 将磁珠与上清液在MPS上分离（约1分钟），弃去上清液，加入200 µL 1x BB。
    6. 在MPS上将磁珠与上清液分离（约1分钟），弃去上清液。
    7. 加入200 µL 1x预PCR缓冲液（由10x缓冲液稀释而成；配方见 补充表 S1）并转移至新的1.7 mL低吸附离心管中。
    8. 在磁力架上将磁珠与上清液分离（约1分钟），弃去上清液。
    9. 加入20 µL 1x预扩增缓冲液，用移液器吹打混匀。
    10. 使用时将离心管置于冰上，或于4 °C保存。
  9. 通过滴定优化PCR循环次数
    1. 每个样本设置 30 µL 的预混液反应体系，方法同前 表11 （每反应用量如上所示）
    2. 运行最少的循环次数后取5 µL等分试样。在剩余反应体系中再进行2-3个循环，随后取下一个5 µL等分试样。重复此过程，共收集四个等分试样。
    3. 使用来自以下的 PCR 参数 表11 每份等分试样。
    4. 向每个5 µL样品中加入5 µL水和2 µL 6x上样缓冲液，在2% TBE琼脂糖凝胶（配方见 补充表 S1) 加入 25–150 ng 低分子量 Marker。参见 图4 预期结果。
      注意：最终文库PCR扩增[步骤3.10]的最佳循环数，是在凝胶上能够观察到可见产物的最低循环数减去一个循环。
  10. 最终文库PCR扩增
    1. 设置12个30 µL的扩增反应，以扩增每个用于测序的最终文库，步骤如下 表11.
    2. 按照以下程序进行PCR反应循环 表11 在确定PCR滴定后的循环次数后（步骤3.9.3）。
    3. PCR 完成后，将重复样本汇集至一个 1.7 mL 低吸附微量离心管中。
    4. 将试管置于MPS上，将上清液转移至新的1.7 mL低吸附微量离心管中。
    5. 将剩余的链霉亲和素包被磁珠重悬于20 µL的1x预PCR缓冲液中。
      注意：该模板在4 °C下可保存数天至数周，或在-20 °C下长期保存。
  11. 使用磁珠混合物去除引物
    1. 使用1× TLE缓冲液（配方见 补充表 S1) 将步骤 3.10.4 中的体积精确调整至 360 µL。
    2. 向每个样品中加入 360 µL 磁珠混合液，用移液器吹打混匀。
    3. 在旋转仪上，室温下混匀样品10分钟。
    4. 在室温下（3–5 分钟）于磁力架上将磁珠与上清液分离。
    5. 用 200 µL 70% 乙醇洗涤磁珠两次，每次在磁力架上静置 5 分钟以回收磁珠。
    6. 在离心机中快速离心，用移液器彻底吸除乙醇。将磁珠置于MPS上空气中干燥，以进一步蒸发残留乙醇。
      注意：沉淀物应呈深巧克力色且无裂纹（可能需要约10分钟）。
    7. 加入30 µL超纯水，重悬以洗脱DNA，在室温下孵育10分钟。每2分钟轻弹管壁以促进混匀。
    8. 在 MPS 上将珠子与上清液分离 5 分钟。
    9. 将每个样品的上清液收集到新的1.7 mL离心管中。
    10. 在2%琼脂糖TBE凝胶（配方见下文）中上样1 µL文库 补充表 S1）凝胶以获得片段大小分布并定量最终文库（图5).
      注意：ClaI 消化仅针对 DpnII-DpnII 连接位点发生，可作为连接反应的阳性对照，预期最终文库的片段大小分布更小。最终文库可短期保存于 4 °C 数天，长期保存于 -20 °C，或立即稀释后送测序。

表5：去除生物素的试剂及温度 请点击此处下载该表格。

表6：超声处理参数。 请点击此处下载该表格。

表7：末端修复试剂及反应温度。 请点击此处下载该表格。

表8：A尾添加试剂及反应温度。 请点击此处下载该表格。

表9：用于退火的PCR引物及配对末端接头寡核苷酸及其退火试剂。 缩写：5PHOS = 5'磷酸基。星号表示硫代磷酸化DNA碱基。#将带索引的寡核苷酸与通用寡核苷酸配对，退火形成带索引的接头。请点击此处下载该表格。

表10：接头连接试剂。 请点击此处下载该表格。

表11：PCR试剂及扩增程序参数。 请点击此处下载该表格。

琼脂糖凝胶电泳结果；DNA片段分离；显示分子量标记物。
图3：琼脂糖凝胶显示典型的片段大小筛选后结果。 展示了四个DpnII-DdeI Hi-C样品（编号1-4）的上清组分和沉淀组分。每个样品的第一泳道为上清组分，来源于0.8倍磁珠混合液；第二和第三泳道为沉淀组分的稀释产物，来源于1.1倍磁珠混合液。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA电泳结果，凝胶条带显示大小分离，左侧可见分子量标记物。
图4：PCR梯度扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图。 从PCR扩增5个循环开始，对四个文库的每一个分别在每增加2个循环后（5、7、9和11个循环）取样。根据此图，确定每个样本的最佳扩增循环数为6个循环。 请点击此处查看该图的放大版本。

凝胶电泳图、DNA片段分离、条带分析、分子量标记物。
图 5：最终的PCR产物。 经纯化和片段大小筛选后，将PCR产物（Hi-C）与同一文库经ClaI酶切后的组分（ClaI）并列上样。ClaI酶切的片段表明存在目标DpnII-DpnII连接产物。需要注意的是，ClaI不能切割DpnII-DdeI连接位点，因此并非所有连接产物都会因该限制性酶切而出现片段尺寸减小。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文中的图示数据来自Lafontaine等人先前发表研究的独立重复实验21。在获得高通量测序数据后，使用开放染色质研究集体（Open2C：https://github.com/open2c）对Hi-C数据进行处理。类似的分析流程可在4D细胞核组计划的数据门户中找到（https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline）。简而言之，采用Nextflow流程distiller（https://github.com/open2c/distiller-nf）执行以下步骤：（1）将Hi-C分子的序列比对至参考基因组；（2）解析.sam比对文件并生成包含Hi-C配对信息的文件；（3）过滤PCR重复序列；（4）将配对信息聚合成分箱的Hi-C相互作用矩阵。这些以HDF5格式存储的矩阵（称为coolers）可进一步用于：（1）在HiGlass服务器（https://higlass.io/）上可视化；（2）利用Open Chromatin Collective维护的“cooltools”开源计算工具集（https://github.com/open2c/cooltools）分析染色质折叠特征，如区室（compartments）、拓扑关联结构域（TADs）和染色质环（loops），并对其进行量化。

在将测序得到的双端序列比对到参考基因组后，可通过几个简单的指标立即评估Hi-C3.0文库的质量。首先，对于人类细胞，通常约有50%的测序双端序列能够被唯一比对。由于染色体具有聚合物特性，大多数比对上的序列（约60%–90%）代表染色体内部的相互作用（顺式相互作用），且相互作用频率随着基因组距离的增加而迅速衰减（距离依赖性衰减）。距离依赖性衰减可通过“尺度图”（scaling plot）最直观地展示，该图显示了每条染色体臂上的接触概率随基因组距离变化的趋势。我们发现，使用不同的交联剂和酶会影响长距离和短距离范围内的距离依赖性衰减17。当DSG交联与Mnase酶或产生较小片段的DpnII-DdeI组合联用时，可增强短距离相互作用的检测能力（图6A）。

从二维相互作用矩阵中也可以直接观察到随距离衰减的现象：当相互作用位点距离中心对角线越远时，其发生频率越低（图6B）。此外，基因组折叠特征（如区室结构、拓扑关联结构域（TADs）和染色质环）可以从Hi-C矩阵和尺度图中识别出来，表现为偏离全基因组平均的随距离衰减趋势。重要的是，在甲醛（FA）交联的基础上增加DSG交联，可减少随机连接事件；由于染色体具有聚合物特性，随机连接不受空间限制，因此更易发生在不同染色体之间（反式相互作用）（图6C）。降低随机连接能够提高信噪比，特别是对于染色体间以及极长距离的染色体内相互作用（>10–50 Mb）。

染色体接触概率分析；图表，热图；基因组分离距离，校正后的频率。
图6：测序并过滤后的Hi-C文库代表性结果。（A）不同酶切条件下的接触概率及其导数的标度图，按片段长度排序（上图），以及使用FA或FA + DSG进行交联的结果（下图）。使用MNAse（microC）或DpnII-DdeI（Hi-C 3.0）进行消化显著增加了短程接触信号（上图），在FA基础上添加DSG也有类似效果（下图）。（B）各列显示了仅使用FA交联后DpnII消化，以及FA+DSG交联后DpnII或DdeI消化的Hi-C热图。白色箭头显示在DSG交联和DdeI消化后“点状”信号增强，提示对DNA成环结构的检测能力提高。各行显示3号染色体不同区域在逐步提高分辨率下的图像，并与面板C对应：最上行：整条3号染色体（0–198,295,559 Mb）；中间行：186–196 Mb；最下行：191.0–191.5 Mb。（C）对应于A中所示区域的覆盖度图。黑色箭头指示仅使用FA交联时较低的覆盖度（%cis reads）。缩写：FA = 甲醛；DSG = 戊二酰亚胺二琥珀酰亚胺酯；chr = 染色体。请点击此处查看该图的放大版本。

并非所有比对上的读段都有用。第二个质量指标是PCR重复序列的数量。在连接和超声处理后，完全相同的重复读段几乎不可能随机产生。因此，这类读段很可能来源于PCR扩增，需要被过滤掉。当需要过多的PCR循环次数来扩增复杂度较低的文库时，通常会产生重复序列。一般而言，对于Hi-C文库，通过滴定PCR确定最终PCR扩增通常只需要5-8个循环（见步骤3.9；图4）。然而，即使经过14轮PCR扩增，仍可获得具有足够复杂度的文库。

另一类重复序列读段被称为光学重复，可能源于使用规则排列的流动池（如HiSeq4000）的Illumina测序平台上的扩增过程。光学重复的产生原因包括流动池负载过载，导致（较大）簇被识别为两个独立的簇；或在第一轮PCR后，原始的成对末端分子发生局部重新簇集。由于这两类光学重复均为局部性的，因此可通过其在流动池上的位置加以识别，并与PCR重复区分开来。对于PCR重复率超过>15%的文库，通常需要重新制备；而对于存在光学重复的文库，则可在优化上样流程后重新上机运行。

补充表 S1：缓冲液与溶液。 请点击此处下载该表格。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞操作的关键步骤
尽管可以使用较少的起始细胞数量，但本实验方案已针对每个测序通道（约 4 亿条 reads）使用约 5 × 106 个细胞进行优化，以确保深度测序后获得足够的文库复杂度。建议在固定前对细胞进行计数。为构建超深度测序文库，我们通常按所需测序深度相应增加测序通道数（及细胞数量）。为实现最佳固定效果，在甲醛（FA）固定前应将含血清的培养基替换为 PBS，并立即加入固定液，避免产生浓度梯度15,22。在收集细胞时，建议优先采用刮取法而非胰酶消化法，因为胰酶处理后细胞由扁平形态转变为球形，可能影响细胞核构象。加入 DSG 后，松散或易聚集的细胞沉淀容易丢失。在此阶段操作细胞时需格外小心，可加入最高至 0.05% 的 BSA 以减少细胞聚团。

对方法的修改
本方案最初使用人源细胞开发17。然而，基于染色体构象捕获技术的经验，该方案应适用于大多数真核细胞。当起始样本量显著较低（约 1 × 106 个细胞）时，我们建议在裂解和构象捕获步骤 [2.1–2.4] 中使用一半的试剂体积。这样还可使DNA提取步骤 [2.5] 能在台式离心机中使用1.7 mL离心管完成，有助于在低浓度DNA条件下提高沉淀效果。DNA定量结果（步骤 2.6.6）将指导后续操作。若提取的DNA量较少（1–5 µg），建议跳过片段大小选择步骤（步骤 3.3），并通过离心浓缩超滤管（CFU）将体积从130 µL浓缩至约45 µL后，直接进行生物素去除。

本方案专门设计用于在使用甲醛（FA）和二琥珀酰亚胺基戊二酸酯（DSG）交联，并用DpnII和DdeI进行消化后，确保获得高质量的数据。然而，其他交联策略也可能同样有效，例如先使用甲醛（FA）再使用EGS（乙二醇双（琥珀酰亚胺基琥珀酸酯）），该策略也用于ChIP-seq23和ChIA-PET2417。类似地，也可采用不同的酶组合进行消化，例如DpnII与HinfI18，或MboI、MseI与NlaIII19。在调整酶组合时，务必使用能够填补特定5'突出末端的生物素化核苷酸，并为每种酶混合物选择最优化的缓冲液。DpnII附带其专用缓冲液，且酶生产商为DdeI消化推荐了特定缓冲液。但在本方案中，对DpnII与DdeI的双酶消化推荐使用限制性酶切缓冲液（Restriction Buffer），因为该缓冲液可使两种酶的活性均达到100%。

染色体构象捕获技术的故障排除
在染色体构象捕获实验中，交联、消化和重新连接这三个关键步骤均需在凝胶上观察结果之前完成。为了评估这三个步骤的质量并确定问题可能出在哪个环节，需在消化前（CI）和消化后（DC）分别取样，并与连接完成的Hi-C样品一同上样至凝胶（图2）。该凝胶用于评估Hi-C样品的质量，判断是否值得继续后续实验流程。若缺少CI和DC样品，则难以准确定位导致结果不佳的具体步骤。值得注意的是，连接效果不佳可能源于连接反应本身、末端补平步骤的问题，或交联步骤存在问题。为排查交联问题，应确保每个文库使用的细胞数不超过1 × 107个，并使用新鲜的交联试剂以及洁净的细胞（即用PBS洗涤过的细胞）。对于连接步骤，务必保持细胞和连接混合物处于冰上；在16 °C孵育4小时之前立即加入T4 DNA连接酶，并充分混匀。

文库制备问题排查
如果在 PCR 滴定后需要超过 10 个 PCR 循环，或在凝胶上无法观察到 PCR 产物（图 4），有几种方法可以挽救 Hi-C 样本。从 PCR 滴定步骤往回排查，第一个选择是重新尝试 PCR。如果产物仍然不足，可在用 1× TLE 缓冲液洗涤磁珠两次后，再次进行末端 A 加尾和接头连接（步骤 3.6）。完成额外的 A 加尾和接头连接后，可按之前方法继续进行 PCR 滴定。如果仍然没有产物，最后的选择是从步骤 3.3 中重新回收 0.8× 的组分，并从此处继续后续操作。

Hi-C3.0 的局限性与优势
需要认识到，Hi-C 是一种基于细胞群体的方法，用于捕获细胞群体中基因组位点对之间相互作用频率的平均值。虽然某些计算分析方法旨在从群体中解析出多种构象组合25，但原则上，Hi-C 无法识别细胞间的差异。尽管可以进行单细胞 Hi-C26,27，并可通过计算手段进行推断28，但单细胞 Hi-C 并不适合获取超高清分辨率的 3C 信息。Hi-C 的另一个局限性在于其仅能检测成对相互作用。为了检测多点接触相互作用，可采用高频切割酶结合短读长测序（Illumina）16，或利用 PacBio 或 Oxford Nanopore 平台进行长读长测序，开展多点接触 3C29 或 4C30。此外，已有针对姐妹染色单体之间及沿其长度方向接触检测而开发的 Hi-C 衍生技术31,32。

尽管Hi-C19和Micro-C33可用于生成亚千碱基分辨率的互作图谱，但二者均需要大量的测序读长，可能导致成本显著增加。为了在不增加成本的情况下达到相似甚至更高的分辨率，可采用针对特定基因组区域的富集方法（如capture-C34），或针对特定蛋白质相互作用的富集方法（如ChiA-PET35、PLAC-seq36、Hi-ChIP37）。这些富集技术的优点和缺点在于仅对有限数量的相互作用进行采样。通过此类富集手段，Hi-C的全局特性（以及全局标准化的可能性）将丧失。

Hi-C3.0 的重要性与潜在应用
本实验方案旨在实现高分辨率、超深度的染色体构象捕获（3C），同时检测拓扑关联结构域（TADs）和区室等大尺度染色质折叠特征17（图6）。每个 Hi-C 文库起始样本量为每管 5 × 106 个细胞，此材料通常足以在流动池上对一至两个通道进行测序，获得多达 10 亿条成对末端读长。对于超深度测序，应根据比对上的读段数量和 PCR 重复率准备多管 5 × 106 个细胞。在最高分辨率（<1 kb）下，染色质成环相互作用主要出现在 CTCF 结合位点之间，但也可检测到启动子-增强子之间的相互作用。有关数据分析的详细说明，请参见 Akgol Oksuz 等人17 的研究。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Denis Lafontaine 在实验方案开发方面的帮助，以及 Sergey Venev 在生物信息学方面的协助。本工作由美国国立卫生研究院共同基金4D基因组计划向 J.D. 提供的资助支持（U54-DK107980，UM1-HG011536）。J.D. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

本文遵循霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的出版物开放获取政策。HHMI实验室负责人此前已在他们的研究论文中向公众授予了非独占性的CC BY 4.0许可，并向HHMI授予了可再许可的许可。根据这些许可，本文的作者接受稿可在发表后立即以CC BY 4.0许可协议自由获取。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 kb DNA标准分子量标记New England BiolabsN3232L
琼脂糖Invitrogen16500100
Agencourt AMPure XP 磁珠，60 mLBeckman CoulterA63881
Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元（CFU）EMD MilliporeUFC500396
退火缓冲液（5×）参见补充材料中的配方
ATP 10 mMThermoFisherR0441
Avanti J-25i 高速制冷超速离心机Beckman Coulter
Beckman 超速离心管 35 mLBeckman Coulter357002
结合缓冲液（2×）参见补充材料中的配方
生物素-14-dATP 0.4 mMInvitrogen19524-016
BSA 10 mg/mLNew England BiolabsB9000S由20 mg/mL稀释而来
细胞刮刀Falcon353089
细胞刮刀Corning3008
50 mL 圆锥形聚丙烯管DenvilleC1062-P
15 mL 圆锥形管DenvilleC1017-P
Covaris 微量管 AFA 纤维带 snap-cap 130 µLCovaris520045/520077
Covaris 超声破碎仪CovarisE220/E220evolution/M220
培养瓶 175 cm2Falcon353112
培养皿 150 mm × 25 mmCorning430599
dATP 1 mMInvitrogen56172
dATP 10 mMInvitrogen56172
dCTP 10 mMInvitrogen56173
DdeINew England BiolabsR0175L
dGTP 10 mMInvitrogen56174
DMSOSigmaD2650-5x10ML
dNTP 混合液 25 mMInvitrogen10297117
Dounce 匀浆器DWK Life Sciences8853010002/8853030002
DPBSGibco14190-144
DpnIINew England BiolabsR0543M
DSGThermoScientific20593
dTTP 10 mMInvitrogen56175
70% 乙醇FisherA409-4由100%稀释而来
溴化乙锭FisherBP1302-10
甲醛（37%）FisherBP531-500
上样缓冲液（6×）New England BiolabsB7024S
甘氨酸溶于超纯水 2.5 MSigmaG8898-1KG
HBSSGibco14025-092
Igepal CA-630 去垢剂MP Biomedicals198596
Klenow DNA 聚合酶 5 U/µLNew England BiolabsM0210L
Klenow 片段 3-->5’ 外切酶缺陷型，5 U/µLNew England BiolabsM0212L
连接缓冲液（10×）New England BiolabsB7203S
液氮
LoBind 微量离心管 1.7 mLEppendorf22431021
低分子量 DNA 标准分子量标记New England BiolabsN3233L
裂解缓冲液参见补充材料中的配方
磁性颗粒分离器ThermoFisher12321D
微量离心管 1.7 mLAxygenMCT-175-C
MyOne 链霉亲和素 C1 磁珠Invitrogen65001
NEBuffer 2.1（10×）New England BiolabsB7002S
NEBuffer 3.1（10×）New England BiolabsB7203S
PBSGibco70013-032
PCR（条状）管BioradTBS0201/ TCS0803
PCR 扩增仪BioradT100
Pfu Ultra II 缓冲液（10×）Agilent随 Pfu Ultra 提供
PfuUltra II Fusion HS DNA 聚合酶 Agilent600674
15 mL 相锁管Qiagen129065
2 mL 相锁管Qiagen129056
苯酚:氯仿:异戊醇Invitrogen15593-049
蛋白酶抑制剂混合液ThermoFisher78440
蛋白酶K溶于超纯水 10 mg/mLInvitrogen25530-031
制冷离心机Eppendorf5810R
无RNase A、DNase和蛋白酶的RNase A 10 mg/mLThermo ScientificEN0531
旋转混合仪Argos technologiesEW-04397-40 或摇床平台
SDS 1%FisherBP13111
乙酸钠 pH = 5.2，3 MSigma
Sub-Cell GT 水平电泳系统Biorad1704401
T4 DNA 连接酶 1 U/µLInvitrogen100004817
T4 DNA 聚合酶New England BiolabsM0203L
T4 DNA 聚合酶New England BiolabsM0203L
T4 DNA 聚合酶 3 U/µLNew England BiolabsM0203L
T4 连接缓冲液（5×）InvitrogenY90001
T4 多核苷酸激酶 10 U/µLNew England BiolabsM0201L
台式离心机Eppendorf5425
TBE 缓冲液参见补充材料中的配方
Tris 低 EDTA 缓冲液（TLE）参见补充材料中的配方
吐温 X-100（10%）Sigma93443
Truseq 接头寡核苷酸Integrated DNA Technologies (IDT)https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry250 nmol，HPLC 纯化
吐温 20 去垢剂Fisher9005-64-5
吐温洗涤缓冲液参见补充材料中的配方
涡旋振荡器Scientific Industries(G560)SI-0236

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  2. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  3. Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
  4. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
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