体外 顶端朝外的肠类器官坏死性小肠结肠炎模型

摘要

本方案描述了一种利用极性反转的小肠类器官构建的“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎（NEC）”模型，该模型为顶膜外翻型，可直接接触顶膜表面。我们提供了一种免疫荧光染色方案，用于检测与坏死性小肠结肠炎相关的上皮结构破坏，并介绍了一种评估在“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎”模型处理后顶膜外翻类器官存活率的方法。

摘要

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种影响早产儿的严重疾病，其特征为肠道炎症和坏死。近年来，肠类器官（enteroids）已成为模拟胃肠道病理过程的有前景体系。然而，目前常用的肠类器官操作方法，或无法接触上皮顶端表面（三维[3D]培养），或耗时且资源消耗大（二维[2D]单层培养）。这些方法通常还需额外步骤（如显微注射），才能使模型具备生理可转化性。本文介绍一种生理相关性强且成本低廉的研究NEC的方案 体外 通过逆转类肠体的极性，使其顶膜朝外（顶膜外翻）。本文还提供了一种免疫荧光染色方案，用于检测在常氧或低氧条件下暴露于肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或脂多糖（LPS）后类肠体屏障完整性和连接蛋白的表达情况。同时评估了三维顶膜外翻类肠体在常氧或低氧条件下经LPS或TNF-α处理24小时后的细胞活力。结果显示，无论暴露于LPS或TNF-α，并联合低氧处理的类肠体均表现出上皮结构破坏、黏附连接蛋白表达减少以及细胞活力下降。本方案描述了一种新型的“体外坏死性小肠结肠炎（NEC）模型”——顶膜外翻类肠体模型，该模型提供了一个生理相关性强且成本较低的平台，可用于识别NEC治疗中潜在的上皮靶点，并研究早产肠道对治疗药物的反应。

引言

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种发生于高达10%早产儿的小肠严重炎症性疾病，常伴随较高的发病率和死亡率^1,2。在极低出生体重（<1500 g）且需外科干预的婴儿中，死亡率接近50%的情况并不少见³。尽管目前尚不完全清楚NEC的确切病因，但已知诸如配方奶喂养等危险因素可能与生理异常（如菌群失调、肠上皮发育不成熟以及肠屏障功能障碍）共同作用，促进疾病的发生^2,4。尽管已付出大量努力，过去十年间在NEC的预防和治疗方面进展甚微⁵。为了深入理解该疾病的发病机制，亟需建立一种研究NEC及相关肠上皮屏障功能障碍的新型体外（in vitro）方法，因为来自动物模型的研究结果迄今未能有效转化为临床应用⁶。

若干 体外 已利用模型研究坏死性小肠结肠炎（NEC）发生过程中的机制。人肠上皮细胞系 Caco-2 是最常使用的模型之一 体外 坏死性小肠结肠炎模型⁷

方案

本研究中的所有动物实验均经俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准。早产非人灵长类动物（NHP，妊娠90%，橄榄狒狒，Papio anubis）的小肠便利样本是在另一项研究实施安乐死后获得的（方案编号 #101523-16-039-I）。

1. 建立顶膜朝外的肠类器官“肠坏死体外模型”

1. 培养基制备与类器官处理
   注意：按照标准无菌技术制备后，培养基可在 4 °C 下保存最多 1 周。
   1. 通过将 50 mL 人源类器官生长培养基与 50 mL 类器官补充剂混合，制备无抗生素培养基（AFM）（参见材料表）。通过将 100 µL 的 0.5 M EDTA 加入 9,900 µL 的 PBS 中，制备 5 mM 乙二胺四乙酸/1×磷酸盐缓冲液（EDTA/PBS）。
   2. 将杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F12 营养混合物 + 15 mM HEPES 缓冲液（DMEM/F12）冷却至 2–8 °C。
   3. 通过将 100 µg TNF-α 粉末悬浮于 1 mL 1×PBS 中，制备 TNF-α 储存液。使用 AFM 作为溶剂，进一步将 TNF-α 储存液稀释至 20 ng/mL 和 50 ng/mL 浓度。通过将 2 mg LPS 悬浮于 1 mL 1×PBS 中，制备 LPS 储存液。使用 AF....

结果

利用类肠体建模肠道炎症，即使在坏死性小肠结肠炎背景下，现已成为常见做法。然而，目前大多数常用方法要么无法接触类肠体的顶膜表面，从而削弱了旨在最终作为口服治疗药物使用的化合物的生理相关性；要么在技术上较为困难且耗时，例如类肠体衍生的单层细胞模型。为提高现有方法的实用性 体外 NEC类肠类器官模型中，我们逆转了肠类器官的极性，并结合24小时低氧及LPS或TNF-α处理，构建了一种顶膜朝外的“类器官内NEC”模型。免疫荧光染色证实细胞核（蓝色）朝向腔侧顶膜定位，并检测到villin的表达³² （红色，顶端标记物）位于上皮组织的外边缘（图1A）。暴露于 200 µg/mL LPS、50 ng/mL TNF-α 或单独缺氧均未引起细胞整体形态或E-cadherin的明显变化³⁸ （绿色），或与对照组相比的villin定位或荧光强度图1A-D;

讨论

最近由肠上皮隐窝衍生的肠类器官模型的发展，使得研究更加符合生理相关性 体外 用于研究坏死性小肠结肠炎发病机制的组织。尽管三维肠类器官包含了肠上皮中所有主要的分化细胞类型，但仍存在若干重要局限性。传统的基底侧朝外的三维肠类器官悬浮于三维细胞外基质水凝胶滴中，其成分和密度可能限制组织培养环境中的正常扩散³⁹重要的是，这些肠类器官对细胞的顶面提供的接触机会有限，而顶面正是 体内与管腔内细菌及抗原相互作用，例如肠上皮细胞TLR4与LPS的结合。

尽管坏死性小肠结肠炎（NEC）的病理生理机制尚不明确，但早产儿肠上皮顶端 Toll 样受体 4（TLR4）的表达增加及其活化被认为在其中发挥重要作用⁴⁰TLR4激活的下游效应包括肠道通透性增加、上皮修复能力下降以及细菌移位，导致肠道屏障功能障碍，进而引起肠道坏死²这一炎症循环被认为起源于早产儿远端肠道的肠腔内，始于肠上皮细胞的顶膜表面。因此，在涉及肠道上皮细菌易位机制研究.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL 圆锥形管	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测	Promega	G9681
Corning Costar 超低吸附24孔细胞培养板	Fisher Scientific	07-200-602
盖玻片 24 mm x 60 mm	赛默飞世尔科技	102460
驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	赛默飞世尔科技	A-21202
驴抗兔IgG抗体，Cy3偶联物	Sigma-Aldrich	AP182C
含15 mM HEPES缓冲液的杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆F-12营养混合物（DMEM-F12）	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin 抗体 (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
4% 甲醛溶液，缓冲，pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
甘油	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult 类器官生长培养基（人源）	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 共聚焦显微镜	Leica Biosystems
大肠杆菌O111:B4脂多糖，经凝胶过滤色谱法纯化	默克生命科学	L3012-10MG
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-7
正常驴血清	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96孔，Nunclon Delta表面处理，平底微孔板	赛默飞世尔科技	136101
PBS（磷酸盐缓冲盐水），1×，无钙、无镁，pH 7.4	康宁	21-040-CM
含NucBlue的长效玻璃抗荧光淬灭封片剂	Fisher Scientific	P36983
重组抗Villin抗体[SP145]	Abcam	ab130751
重组人TNF-α 蛋白 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices
Thermo Forma II 系列水套式三气培养箱，184 L	Fisher Scientific	3140
碘化TO-PRO-3（642/661）	赛默飞世尔科技	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
0.5 mL平盖管	赛默飞世尔科技	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5