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方法文章

一种简单的骨吸收陷窝实验方案用于可视化和定量破骨细胞的骨吸收 体外

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DOI：

10.3791/64016

⸱

2022年6月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

本文内容

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摘要

本文介绍了一种利用磷酸钙包被的细胞培养板进行骨吸收陷窝实验的简单且有效的检测方法。

摘要

成熟的破骨细胞是多核细胞，可通过分泌酸和酶来降解骨组织。它们在多种疾病（如骨质疏松症和骨癌）中发挥关键作用，因此是重要的研究对象。体外可通过吸收陷窝的形成来分析其活性。在本实验方案中，我们描述了一种使用磷酸钙（CaP）包被的细胞培养板的简单陷窝检测方法，该方法易于观察和定量。来源于人外周血单个核细胞（PBMCs）的破骨细胞前体在包被板上培养，并在破骨细胞诱导刺激条件下进行培养。经过9天孵育后，固定破骨细胞并进行荧光染色成像，同时用钙黄绿素对CaP包被层进行反染。为定量被吸收区域，使用5%硝酸银（AgNO3）对板上的CaP包被层染色，并通过明场成像观察。利用ImageJ软件对吸收陷窝面积进行定量分析。

引言

破骨细胞（OCs）是来源于造血干细胞（HSCs）的组织特异性巨噬细胞，与成骨细胞共同在骨重塑过程中发挥关键作用1性激素诱导的、免疫性的以及恶性骨病可导致全身性或局部性骨破坏，其原因是破骨细胞活性过度增强，包括与绝经相关的骨质疏松症2，类风湿关节炎3牙周病4多发性骨髓瘤骨病5，以及溶骨性骨转移6相比之下，破骨细胞形成和功能的缺陷也可能导致骨硬化症7造血干细胞（HSCs）在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，基因符号 ACP5）的刺激下分化为破骨细胞（OC）前体细胞。在M-CSF和核因子κB受体活化因子配体（RANKL，基因符号 TNFSF11）同时存在的情况下，OC前体细胞进一步分化为单核OC，随后融合形成多核OC。8,9,10两种细胞因子M-CSF和RANKL对于诱导破骨细胞标志物的表达均不可或缺且足以发挥作用，这些标志物包括降钙素受体（CT）、核因子κB受体活化因子（RANK）、质子泵V-ATPase、氯离子通道7α亚基（CIC-7）、整合素β3、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP，基因符号ACP5）、溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶K（CTSK）以及基质金属蛋白酶9（MMP9）。活化的破骨细胞通过形成带有皱褶缘的肌动蛋白环，在骨表面构建封闭区。11,12在封闭区内部，破骨细胞通过分泌质子介导骨吸收过程 通过 质子泵 V-ATPase12,13MMP914和 CTSK15，导致裂隙形成。

对于 体外 实验中，可通过扩增小鼠股骨和胫骨骨髓中的巨噬细胞获得OC前体细胞16,17以及通过从血液样本和血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）18,19,20，或通过永生化小鼠单核细胞RAW 264.7的分化21,22.

在本实验方案中，我们描述了一种使用来源于外周血单个核细胞（PBMCs）的破骨细胞，在磷酸钙（CaP）包被的细胞培养板上进行破骨细胞骨吸收活性检测的方法。所采用的CaP包被细胞培养板方法是在Patntirapong等17和Maria等21先前描述的方法基础上改进和优化的。为获得破骨细胞前体细胞，通过密度梯度离心法分离PBMCs，并按照先前所述方法进行扩增20。

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方案

该方案已通过当地伦理委员会的审查和批准（批准编号：287/2020B02）。

1. 磷酸钙包被细胞培养板的制备

  1. 钙储备液的配制（25 mM CaCl2·2H2O、1.37 M NaCl、15 mM MgCl2·6H2O 的 Tris 缓冲液）
    1. 配制 50 mM Tris 缓冲液，并用 1 M HCl 调节 pH 至 7.4。
    2. 将玻璃烧杯置于磁力搅拌器上，加入 100 mL 50 mM Tris 缓冲液。
    3. 称取 0.368 g CaCl2·2H2O、8.0 g NaCl 和 0.305 g MgCl2·6H2O，依次溶解于 Tris 缓冲液中。
    4. 用 1 M HCl 调节 pH 至 7.4。室温保存。
  2. 磷酸盐储备液的配制（11.1 mM Na2HPO4、42 mM NaHCO3 的 Tris 缓冲液）
    1. 将玻璃烧杯置于磁力搅拌器上，加入 100 mL 50 mM Tris 缓冲液。
    2. 称取 0.158 g Na2HPO4 和 0.353 g NaHCO3，依次溶解于 Tris 缓冲液中。
    3. 用 1 M HCl 调节 pH 至 7.4。室温保存。
  3. 96 孔细胞培养板的预钙化
    1. 通过混合 15 mL 50 mM Tris 缓冲液、7.5 mL 钙储备液（步骤 1.1.4）和 7.5 mL 磷酸盐储备液（步骤 1.2.3），配制 30 mL 工作液。用 0.2 µm 滤膜过滤溶液。
    2. 准备一个平底 96 孔细胞培养板。每孔加入 300 µL 磷酸钙溶液（步骤 1.3.1）。盖上盖子，在 37 °C 下孵育 3 天。
  4. 磷酸钙溶液的配制（2.25 mM Na2HPO4、4 mM CaCl2·2H2O、0.14 M NaCl、50 mM Tris 碱的 ddH2O 溶液）
    1. 在装有磁力搅拌子的烧杯中，向 40 mL 去离子水中加入 2 mL 1 M HCl，依次溶解 0.016 g Na2HPO4、0.0295 g CaCl2·2H2O、0.409 g NaCl 和 0.303 g Tris 碱。
    2. 用 1 M HCl 调节 pH 至 7.4。加去离子水定容至 50 mL。用 0.2 µm 滤膜过滤溶液。
  5. 96 孔细胞培养板的钙化
    1. 吸除预钙化 96 孔细胞培养板中的预钙化溶液，每孔加入 300 µL 磷酸钙溶液（步骤 1.4.2）。盖上盖子，在 37 °C 下孵育 1 天。
    2. 将培养板倒置以倒出溶液，并用去离子水彻底冲洗 3 次。立即使用吹风机或压缩 CO2 或 N2 气体干燥，以保持表面均匀。
    3. 在超净台中通过紫外辐射对包被板进行灭菌 1 小时。立即使用包被板，或用封口膜密封后室温保存。

2. 从人外周血中分离PBMCs

  1. 在获得献血者书面知情同意后（伦理批号：287/2020B02），从静脉抽取15 mL血液。
  2. 用等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释15 mL新鲜血液，并通过反复倒置试管或用移液器反复吹打混合。
  3. 每根50 mL锥形管中加入15 mL密度梯度溶液（例如Ficoll，材料表），倾斜试管，小心将30 mL稀释后的血液样本叠加至15 mL密度梯度溶液上层（稀释血液样本：密度梯度溶液，1:0.5–1比例）。
    注意：叠加样本时，注意避免密度梯度溶液与稀释血液样本混合。
  4. 在20 °C下，使用水平转子以810 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车。
  5. 吸除上层液体，保留位于界面处的单个核细胞层（淋巴细胞、单核细胞和血小板）不受扰动。
  6. 小心将单个核细胞层转移至新的50 mL锥形管中。
  7. 用PBS加满试管，混匀后在20 °C下以300 × g离心10分钟（从此步骤开始可启用刹车）。
  8. 小心彻底去除上清液。将细胞沉淀重悬于50 mL PBS中，在20 °C下以300 × g离心10分钟，随后小心彻底去除上清液。
  9. 为去除血小板，将细胞沉淀重悬于50 mL PBS中，在20 °C下以200 × g离心10分钟，随后小心彻底去除上清液。
  10. 将重悬的细胞转移至细胞培养瓶中，用于扩增OC前体细胞。

3. 破骨细胞前体细胞的扩增

  1. 用含20 ng/mL M-CSF的完全α-MEM培养基（10% FBS，1%青霉素/链霉素，1%两性霉素B）重悬PBMCs。以2.5 × 105 个细胞/cm2的密度接种PBMCs。通常，从15–20 mL新鲜血液中分离的细胞可接种于一个75 cm2培养瓶中（1.5–2 × 107 个细胞）。
  2. 每隔三天用含20 ng/mL M-CSF的新鲜完全α-MEM培养基换液，直至贴壁细胞达到所需融合度。当细胞融合度达95%时，典型产量为每瓶1.5–2 × 106 个细胞。通常扩增周期持续6天。
    ​注意：前体细胞的成骨破骨分化潜能可能随培养时间延长而降低。

4. 在磷酸钙涂层板中诱导成骨细胞生成

  1. 为促进细胞黏附，将CaP包被的培养板与50 µL胎牛血清（FBS）在37 °C培养箱中孵育1小时。
  2. 为分离破骨细胞前体细胞，用PBS洗涤培养瓶两次，以去除死亡或非黏附细胞。每75 cm2培养瓶加入4 mL胰蛋白酶（材料表），作用30分钟。
    1. 加入4 mL完全α-MEM培养基以终止消化，用细胞刮轻轻刮下细胞，并将细胞转移至50 mL离心管中。
    2. 使用血细胞计数板（如Neubauer计数板）或类似工具测定总细胞数。
  3. 以350 × g离心7分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于足量的完全α-MEM培养基中，其中含20 ng/mL M-CSF和20 ng/mL RANKL，调整细胞浓度至1 × 106 个细胞/mL。
  4. 吸除CaP包被的96孔板中的FBS溶液，每孔加入200 µL细胞悬液（每孔2 × 105 个细胞）。
  5. 根据实验设计需求，将破骨细胞前体细胞孵育相应时间或加入相应试剂。通常在孵育6天后可观察到大量体积较大且多核的破骨细胞，此时亦可见吸收陷窝形成。每隔三天更换一次新鲜的完全α-MEM培养基，其中含20 ng/mL M-CSF和20 ng/mL RANKL。
  6. 孵育结束后，用PBS洗涤细胞两次，加入4%多聚甲醛固定10分钟，再用PBS洗涤一次。
  7. 固定后的破骨细胞可直接用于荧光染色，或于4 °C保存备用。

5. 破骨细胞的荧光染色及磷酸钙涂层的染色

  1. 将固定后的细胞用透化缓冲液（含0.1% Triton的PBS）孵育5分钟。
  2. 加入100 µL用PBS配制的AlexaFluor 546标记的鬼笔环肽溶液，染色肌动蛋白纤维30分钟，随后吸除染色液。再加入100 µL Hoechst 33342染色液（10 µg/mL溶于PBS）染色细胞核10分钟。也可使用DAPI替代Hoechst染色。
  3. 加入100 µL用PBS配制的10 µM钙黄绿素溶液，染色CaP涂层10分钟。用PBS洗涤三次后进行成像。
  4. 荧光成像完成后，可继续使用同一块培养板，通过Von Kossa染色法对骨吸收陷窝面积进行定量分析。操作时，先用去离子水洗涤培养板两次。

6. 总吸收陷窝面积的定量分析

  1. 为对CaP涂层进行Von Kossa染色，每孔加入50 µL的5% AgNO3去离子水溶液，在紫外光照射下孵育1小时，直至孔底涂层变为棕色。
  2. 用去离子水洗涤平板三次，并拍摄明场图像。可使用低倍物镜（如1.25倍物镜）将整个孔拍摄在一张图像中，以便后续图像分析。也可采用其他方法获取孔的完整区域图像。
  3. 使用ImageJ打开图像文件：文件 | 打开 | 图像 | 类型 | 8位。使用直线工具 | 分析 | 设置比例尺功能，验证图像右下角的比例单位。在"已知距离"框中输入长度值，在长度单位中输入新的比例单位，并勾选全局选项。
  4. 设置待分析的测量参数：分析 | 设置测量。在“设置测量”窗口中，勾选“面积”和“限定于阈值”选项。
  5. 测量蚀坑面积：图像 | 调整 | 阈值。在“阈值”窗口中，勾选暗背景选项，然后点击自动。此时蚀坑区域将变为红色。关闭阈值窗口后，选择分析 | 测量。保存结果文件：文件 | 另存为。

7. OC 数量和大小的定量分析，以及归一化的骨吸收陷窝面积

  1. 使用 ImageJ 打开破骨细胞的荧光图像，并验证标尺单位（见步骤 6.3）。
  2. 列出待分析的测量参数：分析 | 设置测量值。在“设置测量值”窗口中，勾选面积选项。
  3. 使用 ROI 管理器和多边形选区勾画破骨细胞：分析 | 工具 | ROI 管理器。在工具集中点击多边形选区，勾画一个破骨细胞（具有肌动蛋白环且核数 ≥ 三个的细胞），然后在 ROI 管理器窗口中点击添加 [t]。重复此操作，直至所有破骨细胞均被包含。
  4. 测量破骨细胞的数量和大小：在 ROI 管理器中选择所有项目，然后点击测量。保存结果文件：文件 | 另存为（图 3E）。
  5. 测量荧光图像中的陷窝面积。打开与步骤 7.3 中图像对应的涂层荧光图像，并验证标尺单位（见步骤 6.3）。
    1. 列出待分析的测量参数（见步骤 6.4）。选择图像 | 调整 | 阈值。在“阈值”窗口中，取消勾选所有选项框，然后点击自动。陷窝区域将变为红色。关闭阈值窗口，然后选择分析 | 测量。保存结果文件。
  6. 根据破骨细胞数量计算归一化的陷窝面积。

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结果

细胞培养板底部的磷酸钙涂层通过两个包被步骤完成，包括3天的预钙化和1天的钙化步骤。如图1所示，在96孔板的底部获得了均匀分布的磷酸钙涂层。经过洗涤步骤后，涂层与板底结合非常牢固。

显微结构分析、晶界可视化、金相显微镜图像，200 µm 比例尺。
图1：96孔细胞培养板上磷酸钙涂层的代表性明场图像。 涂层过程分为两个步骤，包括3天的预钙化步骤和1天的钙化步骤。比例尺为200 µm。

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讨论

在此，我们介绍一种利用衍生并扩增的破骨细胞进行骨吸收检测的简单且可靠的方法 体外 从PBMCs中分离。所使用的CaP涂层细胞培养板可利用实验室现有材料轻松制备并观察。除本方案中采用的未分选PBMCs外，还可利用小鼠单核细胞诱导生成OCs21 骨髓巨噬细胞17 也已在类似的合成基质上培养用于陷阵试验，因此这些细胞来源可参照相应文献采用该方法。

在本实验方案中，我们使用了一种简单且在实验室自制的磷酸钙（CaP）涂层，替代了昂贵的商业化检测试剂板。尽管骨片和牙本质片是骨吸收陷窝实验中两种常见且经济的可降解材料，但其来源有限且制备过程复杂，是主要的局限性。作为一种易于制备的合成基质，CaP涂层比这两种原始材料更加方便且易于获取。该陷窝实验方法的另一优势在于，细胞在培养过程中可在明场显微镜下直接观察；而在不透光的骨片和牙本质片上生长的细胞则无法进行观察。

该CaP涂层方法可根据不同细胞培养板尺寸的实验需求灵活调整。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由国家留学基金管理委员会资助［CSC 编号：201808440394］。W.C. 由国家留学基金管理委员会提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110硝酸银
a-MEMGibco32561-029MEM α 液体培养基，含 GlutaMAX，不含核苷
amphotericin BBiochrom03-028-1B两性霉素 B 溶液
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50G氯化钙二水合物
CalceinSigma-AldrichC0875钙黄绿素
FBSSigma-AldrichF7524胎牛血清
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
Fixation bufferBiolegend420801多聚甲醛
HClMerk1.09057.1000盐酸
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25重组人 M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6氯化镁
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250无水磷酸氢二钠
NaClMerkS7653-250G氯化钠
NaHCO3MerkK15322429碳酸氢钠
PBSLonza17-512FDulbecco 磷酸盐缓冲液（1×），不含钙和镁
Pen-StrepLonzaDE17-602E青霉素-链霉素混合液
Phalloidin-Alexa Fluor 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 标记鬼笔环肽
RANKLPeproTech310-01重组人可溶性 RANK 配体（大肠杆菌来源）
TrisSigma-Aldrich93362三（羟甲基）氨基甲烷
Triton X-100Sigma-AldrichT8787烷基酚聚氧乙烯醚
TrypLE ExpressGibco12605010重组细胞解离酶

参考文献

  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
  3. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  4. Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
  5. Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
  6. Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
  7. Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
  8. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8(2018).
  9. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
  10. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  11. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  12. Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
  13. Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
  14. Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143(2020).
  15. Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  16. Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
  17. Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
  18. Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
  19. Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578(2021).
  20. Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
  21. Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
  22. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  23. Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
  24. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  25. Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
  26. Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).

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勘误


Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

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