单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

摘要

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45 nm的所有生物颗粒进行无标记检测，并通过多种荧光标记技术鉴定亚群的特定特征。

摘要

单颗粒表征在细胞外囊泡研究中正变得日益重要，已从整体分析技术及第一代颗粒分析方法发展为纳米流式细胞术（nFCM）等全面的多参数测量手段。nFCM 是一种流式细胞术，采用专为纳米颗粒分析设计的仪器，可在使用或不使用染色技术的情况下，每分钟对数千个细胞外囊泡（EV）进行表征。高分辨率侧向散射（SS）检测可确定所有大于 45 nm 的生物颗粒的粒径和浓度，而同步的荧光（FL）检测则可识别标记的标志物和目标分子的存在。标记的亚群随后可用每毫升颗粒数（particles/mL）的定量单位表示，或以侧向散射所识别的总颗粒数的百分比形式进行描述。

在此，从条件培养基（CCM）中提取的细胞外囊泡（EVs）使用脂质染料进行标记，以识别具有膜结构的颗粒，同时使用针对CD9、CD63和CD81的特异性抗体进行标记，这些是常见的EV标志物。在1分钟的分析过程中，对对照材料、二氧化硅纳米球浓度标准品和粒径标准品以及标记样品的测量结果进行分析。随后，软件首先对所有颗粒（无论是否标记）的浓度和粒径分布进行测定，再进一步确定各标记阳性的颗粒。

同时检测SS和FL可灵活应用于多种不同EV来源及外部和内部标记靶点，以全面且定量的方式描述EV样本。

引言

什么是细胞外囊泡（EVs）？
细胞外囊泡（EVs）是一类来源于细胞的膜性颗粒的统称，参与多种正常的细胞和组织活动。它们在广泛科学领域中的影响及其潜在的临床相关性，推动了EV研究和产业兴趣的增长¹。小细胞外囊泡（sEV）的研究主要集中在外泌体，即直径为40–100 nm的颗粒，其形成始于早期内体，经多泡体（MVB）成熟后通过与质膜融合而释放；此外还包括微囊泡，它们直接从质膜出芽形成，直径为80–1,000 nm²。第三类EV群体是凋亡小体，为细胞死亡过程中形成的50–1,500 nm颗粒，因此其相对于其他EV的比例可能差异较大³。

由于细胞外囊泡（EV）的特征可能反映其来源细胞/组织发生的变化，因此其在诊断领域具有应用潜力。目前，各种“组学”分析已开始鉴定能够指示细胞来源和疾病状态的标志物，这使得利用血液血浆/血清、尿液、唾液和脑脊液（CSF）等EV来源对患者进行无创评估成为可能^4,5。推动这些EV相关创新发展的关键在于克服了以往局限性的新型表征技术。

单个细胞外囊泡（EV）表征的需求与挑战
单个EV的表征对于EV分离物的验证与描述日益重要，同时也对阐明这些纳米颗粒的关键特性以推动基于EV的治疗和诊断技术的发展具有重要意义⁶。根据EV的来源及其预期用途，对纯度的分析（通常表示为EV与非EV颗粒之比或EV与游离蛋白之比）可能需要来自多种分析方法的大量数据⁷。

在细胞外囊泡（EV）研究文献中，颗粒计数和粒径测量以往主要依赖纳米颗粒追踪技术（NTA）、电阻脉冲传感技术（RPS）和电子显微镜（EM）²。标准NTA和RPS技术无法区分EV颗粒与非EV颗粒，且各自存在局限性，例如NTA检测通量较慢⁸，以及检测下限不理想等问题^9,10,11。

四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81历来是鉴定细胞外囊泡（EV）分离物/制备物中EV存在的关键标志物。通常采用蛋白质印迹（WB）和点印迹技术，以显示这些蛋白在EV分离物中的富集程度高于细胞裂解液¹²。然而，这些方法缺乏定量能力，且这些EV标志物在不同EV亚群之间以及在细胞、组织或患者间的表达具有异质性，因此需要发展更先进的分析技术，以实现对EV物理特性和表型特征的统一表征¹³。

纳米流式细胞术作为一种全面的细胞外囊泡分析技术
确定真实的细胞外囊泡（EV）浓度需要识别完整颗粒并使用通用标记物，特别是在复杂的颗粒分离物中，其分辨率必须能够检测到所有EV，同时将EV颗粒与非EV颗粒区分开来¹⁴。

纳米流式细胞术（nFCM）是一种能够在45–1,000 nm粒径范围内对无标记颗粒进行分析的技术，同时利用荧光标记和检测来识别颗粒亚群。与传统流式细胞术的一个关键区别在于，该技术采用专用于纳米颗粒分析的设备，从而实现最高的分辨能力¹⁵。细胞外囊泡（EV）分析虽已尝试使用经改造用于小颗粒分析的传统流式仪器，其性能正在不断改进，但仍难以达到检测和分析<100 nm EVs所需的分辨率^16,17。基于微球的流式细胞术是常用于EV分析的另一种改进方法，但该方法无法实现单颗粒检测，并可能引入基于捕获效率的偏差¹⁸。

得益于侧向散射（SS）通道在EV分析中约45 nm的较低检测限，nFCM采用SS触发模式。这种模式可被视为“先粒子”分析，即在分析荧光强度之前，事件必须产生超过设定阈值的SS信号。该方法可消除降解的膜成分和荧光团聚集物等假阳性信号，并聚焦于 对完整细胞外囊泡的分析¹⁵SS 测量还可通过与四模态二氧化硅纳米球标准品比较，用于测定单个颗粒的尺寸¹⁹荧光信号由另外两个检测器采集，从而对每个颗粒同时进行三项测量，以描述颗粒浓度、大小以及标志物或其他目标物质的存在情况，进而识别细胞外囊泡（EV）亚群。²⁰.

在以下实验中，采用SS和荧光（FL）测量方法来测定 >45 nm 颗粒可显示膜阳性细胞外囊泡（EVs）的亚群，并鉴定 EV 亚群上 CD9、CD63 和 CD81 的表达情况。文中描述了这些亚群的浓度及其占 SS 测得的总颗粒数的比例，同时也提供了它们的粒径分布特征。

方案

1. nFCM 仪器的设置及 nFCM 标准品的测量

注意：在开始采集样本数据之前，需进行三次测量，以验证纳米流式检测仪（nFCM）的正确校准，并提供仪器间可靠的比较依据。这三项测量分别为浓度标准品/质控品（QC）、尺寸标准品和空白对照。

1. 在适当的 0.6 µL 离心管中，将质控微球用蒸馏水按 1:100 比例稀释，并放入加样区。
2. 从 样本流 下拉菜单中选择 增压，将质控样本引入系统持续 45 秒，以完全替换前一个样本或清洗液。
   1. 在增压过程中，将激光功率设置为质控微球的预设模板 "250 nm FL QC standard"，例如蓝光激光为 10/40 mW，红光激光为 20/50 mW，散射光衰减设为 0.2%。
3. 从同一菜单中选择 采样 压力，以降低系统压力。
4. 将自动采样压力设为 1.0 kPa，以维持恒定压力。
5. 在采集控制中选择 记录时间，开始 1 分钟的分析。数据将在点图上绘制，散射光强度（SS-intensity）采用对数刻度，荧光强度（FL intensity）采用选定通道。
6. 保存文件前输入文件名和样本稀释倍数。
7. 选择“卸载”以将离心管从加样区移除。加入 150 µL 清洗液，通过选择 增压 清洗超过 >30 秒，然后选择 卸载 移除清洗液。
   1. 使用装有 150 µL 水的离心管，清除毛细管尖端残留的多余清洗液。
8. 将粒径标准微球用纯水按 1:100 比例稀释，取 100 µL 加入加样区，然后选择 增压 进样 45 秒。
9. 将激光功率设置为预设模板 "S16 exo 68-155 nm"。该设置适用于粒径标准品以及含有小于 < 200 nm 的细胞外囊泡（EVs）的样本。例如，蓝光激光设为 15/40 mW，红光激光设为 20/50 mW，散射光衰减为 0.2%。
10. 选择 采样，并如前所述开始记录样本 1 分钟。
11. 使用水或 PBS 样本进行第三次测量，以建立洗脱液的空白对照，用于软件识别并去除假阳性信号。标准测量值的输入方法将在下一节中说明。

2. 测定未标记样品的颗粒浓度并生成PDF报告

1. 用 PBS 将未标记的 EV 样品稀释至适用于 nFCM 分析的合适粒子浓度范围，即 1 × 10⁸–5 × 10⁸ 粒子/mL。取 10–100 µL 稀释后的样品加入上样孔中。
2. 当粒子浓度未知时，先对 EV 样品进行 1:100 的稀释。可通过增强过程中 CCD 相机上激光光斑的大小，或采样期间事件爆发轨迹的观察，快速估算样品浓度。
3. 对上样样品进行 45 秒的增强处理，然后选择采样并记录 1 分钟，保存方式如前所述。
4. 要开始分析此数据，请从采集选项卡切换到分析选项卡。打开已保存的 nfa 文件。
5. 为实现准确的样品测量，在样品测量前应使用之前采集的两个标准测量值来设定用于样品比较和空白对照的参数。
6. 通过首先选择尺寸标准文件并使用设定阈值工具（也称为自动阈值化），创建用于将 SS 转换为直径的尺寸标准曲线。该阈值在事件爆发轨迹中可见，表示判定一个事件具有显著性的最低信号强度。
7. 设定阈值后，检查散点图的 x 轴和 y 轴参数是否分别为 x 轴上的 SS-H 或 SS-A 与 y 轴上的 FITC-A。
8. 打开标准曲线生成工具，并选择S16 exo 68-155 nm作为尺寸模板。点击寻找峰，以识别峰对应的 SS 强度，分别对应直径为 68、91、113 或 155 nm 的粒子。
9. 在关闭窗口前，检查 SS 至直径曲线是否已生成，且 r 值接近 1。
10. 通过选择已保存的文件并点击计数标准来设定浓度标准。输入标准品的粒子浓度。
11. 设定完标准信息后，选择 EV 样品文件并设定阈值。
12. 选择空白文件并点击设定空白，以识别需从样品计数中扣除的假阳性数量。此操作应使用与样品相同的阈值。然后返回 EV 样品文件。
13. 打开 PDF 生成工具并选择粒径与浓度。输入样品的稀释倍数。系统将显示样品的浓度及粒子的粒径分布。

3. 样品标记

注意：可同时采用两种染色策略，以对悬浮颗粒进行综合分析。标记方案通常需要针对新抗体或新的样本来源进行优化。

1. 将EV样本的一部分用PBS稀释至浓度为1.25 × 10¹⁰ 粒子/mL。取8 µL稀释后的EV样本，加入1 µL抗体和1 µL染料，使粒子终浓度为1 × 10¹⁰ 粒子/mL（总粒子数为1 × 10⁸，悬浮于10 µL中）。本实例中，抗体的孵育比例为1:50（即1 µL的1:5稀释抗体）。
   1. 在优化过程中应使用三种以上不同浓度的抗体或染料，以获得数据表明该方案可在不导致所选标记物过度饱和的前提下实现表位的最大结合，避免影响低强度荧光事件的识别。膜染料的孵育浓度为40 nM（即1 µL的400 nM染料）。
2. 将10 µL样本涡旋混匀5秒，在室温下避光孵育30分钟。
   注：对照设置的相关建议见讨论部分。
3. 孵育完成后，取1 µL标记后的样本，在0.6 mL离心管中用PBS按1:50稀释。
4. 将样本加载至进样口，并施加助推压力45秒。确保激光设置正确，并已安装合适的镜头。
5. 切换至采样压力，选择记录时间。完成1分钟的数据采集后，命名数据文件并保存。
6. 卸载样本并更换为清洗液。施加助推压力超过>30秒，然后加载下一个标记样本。

4. nFCM 分析——用于亚群分析的 PDF 生成

1. 进行 PDF 生成时，应用与之前相同的标准；仅空白测量的设置会有所不同。
2. 选择样品文件并设置阈值。在点图上，将 y 轴更改为显示来自绿色或红色通道的 FL 测量值。
3. 选择方格门控工具，使用左键在 FL+ 群体周围绘制一个方框。
4. 打开空白测量文件，点击 Set Blank，然后返回样品文件。
5. 像之前一样打开 PDF 生成工具，即可获得 FL+ 亚群的粒径分布、浓度以及占所有 SS+ 事件的百分比。
   1. 对每个感兴趣的亚群（标识为 "Total, P1, P2 等"）重复此步骤。

结果

SW620 来源的细胞外囊泡和 C2C12 来源的细胞外囊泡上的四跨膜蛋白表达
近年来对多种来源的细胞外囊泡（EV）中关键四跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81 表达丰度的分析表明，无论是在整体分析中，还是在分析其于 EV 亚群上的表达情况时，这些蛋白的存在均表现出极大的变异性²¹。这种变异性可能与不同的生物发生途径（如依赖 ESCRT 和非依赖 ESCRT 的途径）的可用性有关²²。

在图1中，CD9在C2C12细胞外囊泡（EVs）中的呈现比例最高，约为50%，而CD63的呈现比例仅为约30%。当使用三种抗四跨膜蛋白抗体同时进行标记时，约70%的颗粒显示出至少一种EV标志物。重复测量结果显示，CD9/63/81联合标记C2C12 EVs的标准偏差最小，约为3.8%，而仅用CD81标记的C2C12 EVs的标准偏差约为8.1%。

SW620 细胞来源的细胞外囊泡表现出不同的四跨膜蛋白谱，其中表达量最高的 CD9 约占 40%，而表达量最低的 CD63 约占 7%，两者之间差异显著。与 C2C12 细胞来源的细胞外囊泡相似，CD9 存在于大多数四跨膜蛋白阳性群体中，因为 CD9/63/81 联合标记发现约 42% 的颗粒至少表达这三种标志物中的一种。

大多数源自C2C12的颗粒，即总SS+群体，大小在45–120 nm之间，中位直径约为65 nm。每种单个四跨膜蛋白标记的EV亚群的粒径分布如图所示 图1，彼此相似，显示出较大的中位尺寸，约为75-85 nm，且数量较少 <65 nm的细胞外囊泡占总颗粒群体的比例。

SW620 来源的颗粒大小在 45–160 nm 之间，中位粒径约为 65 nm，呈偏态分布。四跨膜蛋白标记的细胞外囊泡显示出更接近正态的分布，中位直径较大，介于 90–110 nm 之间，且不同四跨膜蛋白阳性亚群之间的分布相似。

尽管这两种细胞系中表达最多和最少的四跨膜蛋白家族成员相同，但它们的相对表达水平差异显著，并且在四跨膜蛋白共表达的可能性方面存在一个有趣的差异，这体现在CD9阳性率与CD9/63/81共阳性率之间的差别上。

结合EV膜标记与抗体标记
细胞外囊泡（EV）的双层膜提供了一个更为通用的标记靶点，可能有助于将EV与大小相似的非EV颗粒（如蛋白质聚集体以及具有单层脂质的某些低密度脂蛋白LDL形式）区分开来²³。此类标记的特异性必须经过验证，因为已有研究表明，EV研究中一些常用的膜染料也会结合非EV颗粒²⁴。

膜标记反复显示，C2C12 来源的细胞外囊泡（EVs）和 SW620 来源的细胞外囊泡（EVs）的阳性率约为 80%。在 图 2 所示的 C2C12 和 SW620 结果的点图中，侧向散射光强度（SS-H）与 FITC 荧光强度表现出良好的相关性。这是预期之中的，因为侧向散射光强度与颗粒大小相关，从而与膜表面积相关。

大多数抗体标记的细胞外囊泡（EVs）也对膜标记呈阳性，双阳性比例（FITC+ & APC+）与四跨膜蛋白阳性比例非常相似。FITC与APC的点图显示膜标记与四跨膜蛋白标记之间存在轻微相关性，其中CD63标记与膜标记的相关性似乎最弱。检测到极少的事件为抗体标记阳性但膜标记阴性。

可重复性、双重标记效率及替代数据输出
在设计纳米流式细胞术（nFCM）实验时，一个重要考虑因素是荧光染料或标记物之间的相互作用。图3a显示，无论是否额外进行膜染色，重复抗体标记所得到的阳性百分比测量结果非常相似。特别是SW620细胞的标记结果在两组测量之间差异极小。这表明染料与抗体结合之间的干扰有限，同时也凸显了在重复细胞外囊泡（EV）标记时具有良好的可重复性。

可以将测得的每个颗粒的侧向散射和荧光强度数据导出至 Excel 表格中。基于这些数据，我们可计算平均荧光强度（MFI），以对所标记靶标的相对丰度进行比较性估算。C2C12 来源的细胞外囊泡（EVs）中荧光群体的 MFI 结果显示，CD63 和 CD81 的表达水平略低，其 MFI 值分别约为 550 和 600，而 CD9 阳性 EVs 的 MFI 值约为 850。此处 MFI 的测量单位为 FL-A，未相对于荧光校准标准进行标准化。同时使用三种抗体并未比单独使用 CD9 标记产生显著更强的荧光信号。这与 SW620 的 MFI 测量结果明显不同，后者表明，与任一单一抗体标记相比，联合使用三种抗体的混合物可使标记的 EVs 产生更强的荧光信号。

NanoFCM 软件生成的粒径分布直方图也可导出至 Excel，以便叠加三组重复数据。图 3 中的粒径分布曲线与图 1 相似，但包含误差线。源自 C2C12 的细胞外囊泡中四跨膜蛋白阳性亚群的中位粒径约为 70 nm，略大于总颗粒群体的 60 nm 平均值。SW620 来源的四跨膜蛋白标志物阳性细胞外囊泡更大，峰值出现在约 100 nm。

图1：通过抗体标记鉴定出CD9、CD63、CD81阳性的细胞外囊泡亚群。（A）柱状图显示，与SS检测到的C2C12来源EVs总颗粒数相比，被标记EVs所占的百分比。（B）柱状图显示，与SS检测到的SW620来源EVs总颗粒数相比，被标记EVs所占的百分比。（C）C2C12来源EVs的代表性粒径分布图。每个直方图均来自三组重复数据集中第一次测量所生成的概率密度函数（PDF）图。（D）SW620来源EVs的代表性粒径分布图。每个直方图均来自三组重复数据集中第一次测量所生成的概率密度函数（PDF）图。误差线表示同一样品三次重复测量的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：CD9、CD63、CD81膜标记及抗体标记展示的EV亚群。（A）C2C12 EVs的膜阳性%、四跨膜蛋白阳性%和双阳性%的柱状图。（B）SW620 EVs的膜阳性%、四跨膜蛋白阳性%和双阳性%的柱状图。（C）代表性SS与FITC点图，显示膜阳性群体的设门。（D）代表性FITC与APC点图，显示来自C2C12的EV双阳性群体的设门。（E）代表性FITC与APC点图，显示来自SW620的EV双阳性群体的设门。误差线表示同一样本三次重复测量的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：评估重复测量中的变异。 （A）柱状图显示有或无额外膜标记时的抗体标记阳性百分比。（B）门控细胞外囊泡亚群的平均荧光强度测量结果。（C）C2C12 细胞外囊泡三组重复数据的平均大小分布直方图。（D）SW620 细胞外囊泡三组重复数据的平均大小分布直方图。误差条表示同一样本标记后三次重复测量的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

样品与试剂详情
为演示荧光标记及后续的纳米流式细胞术（nFCM）分析，选择了来自两种不同细胞系的细胞外囊泡（EV）分离物。两种EV样本均悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在-80 °C下保存<3个月，但两者的其他制备条件存在差异。C2C12小鼠成肌细胞系是骨骼肌细胞的胚胎前体细胞，在二维培养体系中培养，并在超速离心法分离EV前，对培养基进行72小时的条件化处理。SW620是一种人结肠腺癌细胞系，在简易生物反应器中培养，培养基富集持续7周，通过尺寸排阻色谱法（SEC）分离EV，并将Sepharose CL-2B柱洗脱的第7至第9组分合并为单一样本。

尽管从条件培养基（CCM）中分离并浓缩的细胞外囊泡（EVs）是最容易处理的样本类型，但纳米流式细胞术（nFCM）同样适用于大多数EV分离物，包括血清、血浆、尿液和脑脊液（CSF）等生物液体。这类样本的分析得益于nFCM对所有颗粒的侧向散射（SS）检测能力，可与纳米颗粒追踪分析（NTA）、 tunable resistive pulse sensing（TRPS）及其他颗粒分析方法相互验证，同时以定量方式描述荧光标记的EV亚群，并给出其占总颗粒数的比例，从而实现无偏倚的多参数颗粒分析。低处理程度的样本也可进行分析，例如未澄清的尿液和EV富集的CCM，但需注意应尽量减少蛋白污染。

此处使用的膜染料旨在整合到脂质双层中，其含有用于膜负载的亲脂性基团和保持在质膜中的亲水性染料²⁵。目前尚无理想的外泌体（EV）标记染料，在选择时必须考虑多个标准，包括对外泌体的特异性、与固定或通透处理的兼容性，以及外泌体标记的效率²⁶。

荧光标记的偶联抗体对表面暴露表位进行标记已被证明是鉴定细胞外囊泡（EV）亚群的有效方法²⁷。实验方案优化的一个关键方面是达到但不超过标记饱和点，以结合所有可及的表位，同时避免未结合的荧光抗体充满周围缓冲液，从而干扰低荧光颗粒的检测²⁸。此外，抗体标记所依赖的表面结合位点的可及性可能受多种因素影响。已有研究表明，EV的储存条件会影响其浓度和粒径分布²⁹，并有观察提示其也会影响抗体标记效果³⁰。表面冠状蛋白的存在、蛋白质修饰以及分离技术的影响在某些情况下也可能对抗体标记产生影响。最终，随着荧光标记在EV研究中的应用日益广泛，针对多种分析技术的实验设计与优化将变得更加精细。

为提高结果的准确性，可设置多种对照，包括：（1）PBS + 染料对照，用于评估某些染料中胶束或聚集体的形成，这些结构在纳米流式细胞术（nFCM）分析中可能表现为侧向散射阳性（SS+）颗粒；（2）PBS + 抗体对照，抗体可能发生聚集，尽管通常不足以产生足够强的光散射信号被SS检测到；（3）EV样本 + IgG抗体对照，这在流式细胞术中较为常见，用于识别非特异性结合；（4）非EV颗粒样本 + 抗体/染料对照——在需要从复杂颗粒样本中识别EV时尤为重要，例如使用纯化的低密度脂蛋白（LDL）颗粒或去除了/消除了EV的样本作为阴性对照，以验证标记的选择性；（5）阳性对照较难设计，但将抗体在细胞上的验证结果作为参考具有实用价值。

细胞外囊泡上四跨膜蛋白的展示
本实验通过抗体和膜染色表明，纳米流式细胞术（nFCM）分析可在较短时间内获得高水平的定量数据。同时测量颗粒直径/浓度等关键物理特性以及膜和/或蛋白质存在的表型特征，可对颗粒分离物中的亚群进行深入表征。

重要的是，在这两种细胞外囊泡（EV）样本中检测到三种与EV相关的“关键”四跨膜蛋白（tetraspanin）CD9、CD63和CD81的表达水平存在差异。在C2C12来源的EV和SW620来源的EV中，CD9均在最大比例的EV上表达，CD81次之，CD63的表达比例最低。

尽管在此处观察到两种截然不同细胞来源的细胞外囊泡（EV）在四跨膜蛋白谱上存在一些相似性，但CD9、CD63和CD81的水平在细胞系来源与患者来源的EV之间可能存在显著差异³¹。

两种细胞外囊泡（EV）样本之间CD63表达的差异与当前关于“EV特性”关键标志物的讨论密切相关。尽管SW620细胞来源EV中仅有约8%表达CD63，这一结果可能令部分研究者感到意外，但已有研究指出，CD63作为基于大小或密度分离的不同类型EV的标志物并不可靠³²，甚至在被描述为外泌体样（exosome-like）的EV中也已发现存在四跨膜蛋白（tetraspanin）阴性的EV³³。

在复杂颗粒分离物中鉴定细胞外囊泡（EVs）
无论是细胞系来源还是患者来源的EVs，其四跨膜蛋白（tetraspanin）表达谱均具有异质性，这提示应谨慎依赖基于四跨膜蛋白的EV捕获方法，并凸显了未来开发新型EV鉴定技术的必要性³¹。如果能够证明其对EV具有高度特异性，那么不依赖特定蛋白质的EV标记方法可能在区分EV与大小相似的非EV颗粒方面发挥重要作用。这一点在体液EV分离物中尤为关键，已有研究指出，人血浆中EV的浓度约为10¹⁰ 粒子/mL，而脂蛋白的浓度则高达每毫升10¹⁶ 个^14,34。即使经过EV富集，比较颗粒对四跨膜蛋白标志物和/或低密度脂蛋白（LDL）标志物ApoB阳性率的研究也表明，在去血小板血浆（PFP）样本中，LDL的丰度仍约为EV的50至100倍³⁵。

所采用的分离技术极大地影响了共分离的非囊泡颗粒（如极低密度脂蛋白（VLDL）、中等密度脂蛋白（IDL）和LDL³⁶）的种类。此外，已有文献报道脂蛋白可与细胞外囊泡（EV）结合并被共分离，这种结合可能具有重要的生物学作用，但也使得获得高纯度EV样本成为一项具有挑战性的目标³⁵。

因此，可以认为应更加关注对样本中颗粒的描述，而不是专注于分离出纯度较高但种类有限的细胞外囊泡（EV）。通过批量测量四跨膜蛋白的丰度和颗粒计数来全面描述颗粒，可能不足以准确测定EV的浓度，尤其是来自生物液体样本时^36,37。采用分层方法识别亚群——展示总颗粒数、EV数量以及表达特定蛋白的EV数量——如本实验所示，可能为纳米颗粒表征提供一种可靠的解决方案。这种方法已在涉及EV载药设计以用于未来治疗应用的研究项目中得到应用²⁰，并用于识别携带线粒体等腔内 cargo 的CD63+ EV³⁸。

nFCM 在细胞外囊泡分析技术中的地位
nFCM 对细胞外囊泡（EV）分析的一个优势在于其数据能够与最常用的 EV 分析方法相互验证，并在物理特性与表型数据集之间建立联系。然而，这一优势依赖于准确的标记方案，而这些方案通常需要针对特定的标记试剂（如染料和抗体）进行优化。实现准确分析的关键标准之一是确保标记后的颗粒悬浮在无荧光背景的缓冲液中，这可以通过去除未结合的过量荧光染料，或优化实验方案以避免表位饱和来实现。

比较研究表明，纳米流式细胞术（nFCM）对细胞外囊泡（EVs）的粒径分析结果与TRPS和冷冻电镜（cryo-TEM）一致，这两种技术被认为在EV粒径分析方面比纳米颗粒追踪分析（NTA）更为准确^10,39。然而，与所有基于光学的方法一样，在解读数据时必须考虑EVs自身光学性质的异质性，以及标准物质与EVs之间光学性质的差异¹⁰。

通过鉴定细胞外囊泡（EV）标志物来指示EV富集，蛋白质印迹（Western blotting）一直是关键方法⁴⁰。然而，为了证明这些标志物存在于颗粒表面，推动了基于EV的流式细胞术分析技术的发展¹⁷。但是，目前要获得可靠的数据，仍需依赖专用仪器，以实现对散射光和荧光信号的必要分辨率¹⁹。

nFCM 利用侧向散射测量，提供了一种无偏倚的方法，可初步描述所有颗粒（不依赖于特定标记物），从而能够与 NTA、RPS 和 TEM¹ 等最常用技术进行相互验证，同时以定量方式添加类似于 WB 或 ELISA 的表型检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 抗 CD81 抗体 (M38)	abcam	ab233259	抗人 CD81 APC 偶联抗体
APC 抗 CD9 抗体 (EM-04)	Abcam	ab82392	抗小鼠 CD9 APC 偶联抗体
APC 抗 CD9 抗体 (MEM-61)，预稀释	abcam	ab82389	抗人 CD9 APC 偶联抗体
APC 抗小鼠 CD63 抗体	biolegend	143905	抗小鼠 CD63 APC 偶联抗体
APC 抗小鼠/大鼠 CD81 抗体	biolegend	104909	抗小鼠 CD81 APC 偶联抗体
CD63 单克隆抗体 (MEM-259)，APC 标记	invitrogen Via Fisherscientific	A15712	抗人 CD63 APC 偶联抗体
Celline AD1000 生物反应器	Merck	Z688037-5EA
清洗液	NanoFCM	17159	纳米分析仪专用内部清洗溶液
来自 C2C12 的细胞外囊泡 (EVs)	赠予		小鼠细胞系
来自 SW620 的细胞外囊泡 (EVs)	赠予		人源细胞系
Memglow - 荧光生成型膜探针	Cytoskeleton	MG01	无毒细胞膜染料
纳米分析仪	NanoFCM		用于单颗粒检测的纳米流式细胞仪
PBS，pH 7.2	Gibco Via Fisherscientific	12549079	用于样本和抗体稀释的盐溶液
Snaplock 微量离心管，0.60 mL	Axygen Via Fisherscientific	11371944	用于向纳米分析仪加载样本的管材