使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

摘要

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。

摘要

可视化生物化学是一种强大的技术，可用于观察单个酶或酶复合物的随机特性，这些特性在传统体相实验的平均效应中往往被掩盖。为了实现可视化，将双光镊系统（其中一个光阱固定，另一个可移动）聚焦到置于倒置荧光显微镜载物台上的多通道微流控芯片的一个通道中。光镊捕获荧光标记的单个DNA分子，当液体流经芯片并经过被捕获的微珠时，在极小的作用力（即0 pN）下将DNA拉伸至B型构象，核酸在黑色背景上呈现为一条白色细线。通过将载物台沿垂直于液流方向移动，可将DNA分子从一个液流切换至另一个液流，从而以受控方式启动反应。为确保实验成功，需将具有光学透明通道的微流控装置与固定在注射泵中的玻璃注射器连接。最佳实验效果依赖于永久键合在流动池上的接头、机械刚性强且化学性质稳定的管路，以及可消除气泡的切换阀，以避免破坏层流状态。

引言

在单分子水平上实时观察蛋白质与DNA相互作用的能力，为基因组稳定性研究提供了重要见解^1,2。除了逐个操作单个DNA分子外，观察邻近个体分子之间相互作用的过程还能提供进一步的深入认识^3,4,5。操控多个DNA分子需要额外的光镊装置，以及高质量的多通道微流控流动池⁶。

目前有多种方法可用于生成多个光镊。这些方法包括振镜扫描镜、声光调制器以及衍射光学元件，后者可生成全息光镊^4,7,8,9。通常，扫描镜和声光调制器产生的光镊采用时间复用方式工作。在本文所述的装置中，单束Nd:YAG激光的光束按偏振方向被分束，随后由振镜激光扫描镜控制所谓的移动光镊的位置（图1）⁴。为了便于调整反....

方案

1. 使用聚苯乙烯微球进行光镊校准与测试

注意：设置请参考图1A、B。

警告：实验人员在进行激光束准直时应佩戴适当的护目镜或激光防护眼镜。由于本文所述的光镊系统同时使用了氦氖激光（HeNe）和红外激光（IR），因此需要两套不同的激光防护眼镜。

1. HeNe 激光束准直
   1. 将所有光学元件放置在光学平台上。调整光学平台的位置，使其相对于显微镜尽可能接近 90° 角。
   2. 将装有物镜和筒镜的接合套管连接到显微镜上（图 1A-11,12）。
      注：筒镜是一种透镜系统，用于将图像聚焦在目镜的中间像平面。
   3. 打开 HeNe 激光器并开启快门（图 1A-18）。光束应以 54 mm 的高度照射到滤光片（图 1A-3），其中 50% 的光被反射至反射镜 5（图 1A-....

结果

首先使用1 μm的非荧光聚苯乙烯微球对光阱的对准和强度进行初步测试。由于实验室中大多数研究涉及荧光检测，我们进一步采用1 μm的Dragon green荧光聚苯乙烯微球测试光阱强度（图1D、E）。随后实验转为对DNA-微球复合物进行光镊捕获，其中DNA被双嵌入染料YOYO-1染色^14,29。当这些复合物在微流控流动池中被捕获于盖玻片表面以上10–15 μm处时，流体流动会使微球周围的DNA伸展拉直（图3B、C）。测量流体拉伸后DNA的长度至关重要，以确保其伸展至B型构象的预期长度。例如，λ噬菌体DNA的完整长度略长于16 μm，对应48,504个碱基对¹⁴。

为了表征流体流动，将荧光微珠引入流动池中，并将焦平面设定在盖玻片表面上方15.......

讨论

流体系统的精确组装对于实验的成功至关重要^4,6。该实验方案中最困难的环节之一是将连接器固定在玻璃表面。为此，我们采用以下两种方法：压接式管路连接器和纳米端口组件。压接式连接器可轻松粘附于玻璃表面，随后用镊子将聚四氟乙烯（PTFE）管插入预制孔中。当需要更稳定的连接时，优先选择纳米端口组件的键合方式。若使用得当并妥善清洁，带有永久性组件的单个玻璃流动池可使用超过一年。若需要更频繁地更换流动池，可使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）流动池，因其是性能优良且成本更低的替代方案。PDMS 流动池可重复使用，但 PDMS 易发生溶胀，可能随时间改变流体流动行为。

玻璃和PDMS流动池均非不可破坏。在实验室中，使用的最大流速为800 μL/h。若长期或每日超过此流速，可能导致玻璃流动池发生翘曲 （glass flow cells）以及PDMS材料变形。尽管使用甲醇和水进行初始润湿的步骤耗时较长，但非常值得，因为该过程可完全消除气泡，并可检测连接处是否存在泄漏。本文所述的流动.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100倍物镜	Leica	506318 或 506038	油浸镜头；仅用于成像和光镊；专为荧光成像优化的 Plan APO 物镜
10倍物镜	Leica	506263	用于在准直过程中定位激光光斑；用于在流动池中寻找焦平面和 X-Y 位置
1 mm 荧光微珠	Bangs Labs	FSDG004	用于光镊性能测试、焦平面位置确定
1 mm 聚苯乙烯微珠	Bangs Labs	CPO1004	用于光镊性能评估以及与生物素化分子的结合
63倍物镜	Leica	506081	用于在准直过程中定位激光光斑，以及在流动池中寻找焦平面和 X-Y 位置；也可用于光镊，因其后孔径直径与 100倍物镜相同；油浸镜头
准直激光器	Lumentum	1100 系列	10 mW 氦氖激光器，肉眼可见，用于光学元件的定位
光束准直相机	Amscope	MU303	一种简单、低成本且由软件控制的相机，用于成像光束位置
相机控制与图像采集软件	Hamamatsu	HCImage	协调 Lambda DG4 与相机的活动，以实现快速波长切换
相机；Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	用于单分子实验成像的 CCD 相机
光束准直相机的 C 接口	Spot imaging solutions	DE50CMT	为相机提供最佳定位，以便在准直过程中成像激光光束
Orca Flash 4 相机的 C 接口			带有固定环，用于固定红外阻断滤光片。可消除光镊中反射的红外光束，有助于更清晰地成像被捕获物体
Cy5  荧光滤光立方体	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	与 Lambda DG4 配合使用，仅用于成像 Cy5
Fitc-Txred  荧光滤光立方体	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	与 Lambda DG4 配合使用，用于成像 FITC 和 TXRed
流体管路	Grace Bio	46004	作为 PEEK 的替代材料的 PTFE 管路；适用于某些流动池。当使用 Grace Bio 的适配管路连接器时，可用于 PDMS 流动池或玻璃流动池
GFP 荧光滤光立方体	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	与 Lambda DG4 配合使用，仅用于成像 GFP
玻璃流动池	Translume	定制	透明流道，用于成像（图 2E）
玻璃胶	Loctite	233841	可牢固且方便地将 Nanoport 组件粘接到玻璃流动池上
玻璃/PDMS 夹层流动池	CIDRA Precision services	定制设计	根据您的规格制造的流动池；成像通道透明（图 2C）
Hamilton 清洗液	Hamilton	18311	温和但高效的玻璃流动池清洗液；小心使用时不会产生气泡
照明系统	Sutter Instrument	Lamda DG4	已停产，建议使用 Lambda 721
照明系统	Sutter Instrument	Lamda DG4	已停产，建议使用 Lambda 721
图像分析软件	Media cybernetics	Image Pro Premiere	用于图像分析和单分子追踪
图像分析软件	Fiji/NIH Image/Image J	共享软件	用于图像分析和单分子追踪
图像显示卡	Melles Griot	06 DLA 001	Thorlabs 的替代产品：VRC5
浸油	Zeiss	444960	Immersol 518 F，无荧光
激光光束准直工具	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	用于确保光束水平且处于正确高度
激光光束观察仪	Canadian Photonics labs	IR 3150	用于成像镜子和 目标上的红外光斑
激光功率计	Thor labs		用于测量激光输出功率以及光镊强度
激光安全眼镜（HeNe）	Thor labs	LG7 或 8	可阻挡 >3 OD 单位、波长 >600 nm 的光
激光安全眼镜（红外）	Thor labs	LG11	可阻挡 >7 OD 单位、波长 ³1000 nm 的光
mcherry  荧光滤光立方体	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	与 Lambda DG4 配合使用，仅用于成像 mcherry
显微镜	Leica	DMIRE2	移除了微分干涉（DIC）端口，以容纳双色光镊/准直镜
显微镜控制软件	UCSF/共享软件	uManager	控制显微镜，允许物镜的焦准直以及载物台控制
Nanoport 组件	IDEX	N333	粘接到流动池上的连接器
光学平台支撑	Thor Labs	PA52502	主动隔振平台支撑
光学元件和透镜	Solar TII	多种	为系统定制设计的干涉镜、望远镜和透镜
PDMS 流动池	ufluidix	定制	根据您的规格制造的流动池；成像通道透明（图 2B 和 D）
PEEK 管路	IDEX	1532	为流动池和切换阀提供优异的连接
Pinkel 荧光滤光立方体	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	与 Lambda DG4 配合使用，用于快速成像多种荧光染料
压接式管路连接器	GraceBio	46003	透明硅胶连接器，带有可牢固粘接玻璃的粘合剂
扫描镜	GSI Lumonics	VM500	用于控制第二个光镊。GSI Lumonics 已不存在。类似镜片可从 Cambridge Scientific 购买
载物台	Leica
载物台测微尺	Electron Microscopy Sciences	68042-08	提供屏幕标尺，用于光束定位和系统校准
切换阀	IDEX	V-101T	控制流体流向，并防止气泡进入流动池
注射器与阀体歧管	机械加工车间	无	定制制造
注射泵	Harvard Apparatus	PHD 2000	控制流经流动池的流体流动
注射泵软件	Harvard Apparatus	70-6000	流量控制提供无缝、可编程的流体流动控制
注射器	Hamilton	81320	气密性、PTFE 鲁尔锁、玻璃筒体带聚四氟乙烯涂层活塞
桌面平台	Thor Labs	T36H	光学桌面或面包板
光镊激光器	Newport/Spectra Physics	J系列；BL106C	Nd:YAG 激光器；1064 nm；5 W 激光器