用于评估癌细胞转移能力的CAM-Delam实验方法相对快速、简便且成本低廉。该方法可用于揭示调控转移形成的分子机制，并可用于药物筛选。若能优化用于分析人类肿瘤样本的实验方案，则有望成为一种个性化癌症治疗的临床方法。
本文内容
摘要
摘要
癌症相关死亡的主要原因是转移灶的形成（即癌细胞从原发肿瘤扩散至远端器官并形成继发性肿瘤）。脱层作用定义为基底膜和基底膜的降解，是促进癌细胞向其他组织和器官迁移与扩散的初始过程。对癌细胞脱层能力进行评分，可反映这些细胞的转移潜能。
我们开发了一种标准化的方法，即ex ovo CAM-Delam检测法，用于观察和量化癌细胞脱离并侵袭的能力，从而评估其转移侵袭性。简而言之，CAM-Delam方法包括在孵化第10天的鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）上，将癌细胞接种于硅胶环内，随后孵育数小时至数天。该方法在鸡胚孵育过程中采用了内部加湿培养室。这一新策略将胚胎存活率从10%–50%提高至80%–90%，解决了以往不同CAM检测中胚胎存活率低的技术难题。
接下来，分离带有相关癌细胞簇的CAM样本，进行固定并冷冻。最后，对冷冻切片样本进行免疫组织化学分析，以观察和评估基底膜损伤及癌细胞侵袭情况。通过评估多种已知具有转移性和非转移性的、设计为表达绿色荧光蛋白（GFP）的癌细胞系，CAM-Delam定量结果显示，去层化能力的模式可反映转移侵袭性，并可划分为四个等级。该检测方法未来的应用，除了将去层化能力作为评估转移侵袭性的量化指标外，还包括揭示调控去层化、侵袭、微转移形成以及肿瘤微环境变化的分子机制。
引言
大约90%的癌症患者死亡是由癌症转移所导致的后果引起的，癌症转移是指肿瘤细胞从其原始发生部位扩散到身体其他部位并形成继发性肿瘤的过程1。因此，识别与转移相关的机制以寻找能够抑制肿瘤转移形成的潜在靶点显得尤为重要。随后，迫切需要建立可用于评估转移过程的模型系统。
在转移过程中，癌细胞经历上皮-间质转化（EMT），这是一种正常的细胞过程，上皮细胞在此过程中失去其黏附性和极性特征，转而获得侵袭性的间质特性2。去层化是EMT过程的一部分，涉及基底膜中层粘连蛋白的降解，这是癌细胞离开原发肿瘤并侵入其他组织的前提条件。在转移形成过程中上调的主要因子包括基质金属蛋白酶（MMPs）、ADAM（一种去整合素和金属蛋白酶）、ADAMTS（含有血小板反应素模体的ADAM）以及膜型MMPs（MT-MMPs）3,4。这些因子通过降解层粘连蛋白等分子——层粘连蛋白在所有基底膜中均有表达——从而促进细胞迁移和侵袭。
受精鸡胚的绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）是一种基底膜。受精鸡胚已被用作转移性模型，将癌细胞接种于胚外绒毛尿囊膜上，随后在鸡胚中观察转移灶的形成5。此外，体内小鼠转移模型也常被使用，将癌细胞植入小鼠体内，并分析其在不同器官中的转移情况6。该方法耗时较长、成本较高，且可能给动物带来不适。为解决这些问题，我们开发了CAM-Delam检测法，这是一种更快捷、更经济的评估癌细胞转移侵袭能力的模型。在此模型中，癌细胞降解鸡胚绒毛尿囊膜的能力（例如去层化能力）与癌细胞潜在侵入间充质的能力相结合，作为评估其转移侵袭性的指标。
本文基于先前发表的研究7，详细描述了CAM-Delam实验的全过程，包括受精鸡胚的处理、癌细胞培养与接种、解剖操作以及CAM样本的分析，直至将癌细胞的去层化能力分为四类进行评分：完整、改变、损伤和侵袭。我们还举例说明了如何利用该实验来确定调控去层化过程的分子机制。
方案
简而言之，图1 概括了CAM-Delam实验的总体步骤。以下方案基于30枚培养的受精鸡胚，使用两种不同的癌细胞系，分别在每枚鸡胚的三个环中接种，并在四个时间点进行分析。
1. 卵的孵化
- 从当地孵化场获取受精的鸡胚蛋，确保受精率超过90%
注意：鸡蛋在室温下储存时间不应超过4天。在瑞典，对鸡胚的实验使用仅在胚胎发育第14天（E14）及之后才需要伦理许可。 - 如有需要，可使用干燥的纸巾或蘸水轻轻擦拭鸡蛋表面的污物或羽毛。
- 每次使用前，用70%乙醇清洁并消毒孵卵器。
- 将所需数量的鸡蛋放入蛋托中，水平置于孵卵器内，在37.5–38 °C、70%湿度条件下孵化。以此作为孵化第0天（图1A）。
2. 称量皿、塑料盒和解剖器械的准备
- 使用 70% 乙醇对 30 个称量皿和 30 个带透明盖的小型塑料盒（约 0.4 L）进行灭菌。
- 将称量皿和塑料盒在超净工作台中过夜（ON）干燥，并存放于密闭塑料盒中，待孵育第 3 天使用。
- 每 30 枚孵育用鸡蛋准备 2 L 蒸馏水或去离子 H2O，并进行灭菌。
- 用 70% 乙醇喷洒两把剪刀和三把镊子进行灭菌。将器械自然晾干后，存放于灭菌盒中，直至孵育第 3 天使用。
注意：上述操作（步骤 2.1–2.4）可在孵育第 3 天之前的任意时间完成。操作时应佩戴手套以避免污染。
3. 打开卵并转移至内部加湿室
注意：请佩戴手套和口罩以避免污染。
- 加入约 50 mL 灭菌 H2将水加入已灭菌的塑料盒中。将装有水并盖紧盒盖的塑料盒置于室温下保存，避免污染，待用。
- 在孵育第3天，使用剪刀的尖端敲裂蛋壳，并在蛋壳上切出一个直线开口。
- 将鸡蛋在称量皿上方手动敲开，收集蛋清、蛋黄及附着的健康胚胎于称量皿中（图1B）。寻找完整的 具有搏动心脏、完整卵黄和发育良好血管的胚胎用于实验（>95%的孵育卵）。丢弃胚胎畸形、无心跳、卵黄破裂或卵黄血管受损的卵。
- 将称量舟轻轻转移至内部加湿培养室中。
注意：步骤 3.2–3.4 中，应尽快操作以避免污染，条件允许时使用层流罩。 - 将内部加湿室置于孵卵器中孵育（图1C).
- 将无壳鸡蛋在孵化箱中培养至第3天至第10天后使用（参见步骤3.6）；必要时向孵化箱中加水，以维持70%的湿度。
- 每天通过透明塑料盖检查内部加湿培养盒中的死胚或污染的无壳卵，并将其从培养箱中移除。
4. 硅胶环的制备
- 制备硅胶环时，使用内径和外径分别为 4 mm 和 5 mm 的硅胶管，切成约 1 mm 厚的环状，建议使用纸张切割器（图 1D）。
- 将硅胶环转移至小型玻璃瓶中（图 1D），用金属箔覆盖，并使用高压灭菌器或类似设备进行灭菌。
注意：避免对未使用且可能已被污染的硅胶环重复进行高压灭菌，因为此类处理会降低硅胶环与膜的贴附能力，导致癌细胞/胶原蛋白/RPMI 溶液从环外泄漏。 - 将灭菌后的硅胶环在室温下储存。
注意：此步骤可在孵育第 10 天之前的任意一天完成。
5. 癌细胞的制备
注意：细胞培养基、胰蛋白酶和1×PBS等溶液应储存在4 °C，使用前需在水浴中加热至37 °C。加热后，用70%乙醇冲洗瓶身并晾干后再使用。
- 在含有5%（v/v）CO₂的细胞培养箱中，于37 °C下，使用相应的培养基培养目标癌细胞系2.
注意：此处，U251-GFP 胶质母细胞瘤细胞和 PC-3U-GFP 前列腺癌细胞在完全 RPMI 培养基中培养——RPMI 培养基添加 10% (v/v) 胎牛血清 (FBS) 和 1% (v/v) 青霉素-链霉素 (PS)。 - 规划癌细胞培养，使细胞数量约为 50 × 106 在CAM-Delam检测中，癌细胞在孵育第10天即可进行收获。
- 每2-3天更换一次细胞培养基，或当培养基颜色由粉红色变为橙色/黄色时进行更换。
- 可选：通过用 CoCl₂ 处理癌细胞以诱导缺氧2 在细胞收获前1天，研究去黏附的分子机制效应。
警告：CoCl2 具有中等毒性。需在通风橱中谨慎操作，并遵循制造商说明。- 配制新鲜的 20 mM CoCl₂ 溶液2 将0.0258 g溶于10 mL灭菌蒸馏水中配制成储备液20，置于15 mL锥形管中，用铝箔包裹以避光。
- 在50 mL锥形管中，加入250 µL的20 mM CoCl2 在每15 cm直径的细胞培养皿中，将储备液加入25 mL RPMI培养基（含1% (v/v) 青霉素-链霉素溶液，不含FBS）中，轻轻涡旋混匀。
- 从细胞培养皿中移除完全RPMI培养基。
- 用无菌的1×PBS洗涤细胞2次。
- 加入25 mL含200 µM CoCl的RPMI培养基2 细胞消化（参见步骤 5.6）。
- 在孵化第10天，准备1 mL胶原蛋白/RPMI混合液（比例1:3），其中含250 µL I型胶原蛋白（5 mg/mL）和750 µL细胞培养RPMI培养基（添加10% FBS和1% (v/v) PS）。将胶原蛋白/RPMI混合液置于冰上保存。
- 用胰蛋白酶消化癌细胞以分离细胞，首先移除细胞培养基，并用1×PBS洗涤2次。
- 向每个15 cm直径的细胞培养皿中加入3 mL胰蛋白酶溶液（0.05%），在细胞培养箱中孵育2–3分钟，直至细胞脱落。使用台式倒置显微镜观察细胞脱落情况。如有必要，可轻轻敲击培养皿侧面，使残留的成团或贴壁细胞脱落。
- 通过向每块细胞培养皿中加入5 mL完全RPMI培养基以灭活胰蛋白酶，并将所有细胞培养皿中的细胞悬液收集至50 mL离心管中。
- 使用台盼蓝排斥法对癌细胞进行计数，以区分活细胞与死细胞，并使用细胞计数仪完成操作。取10 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝染液混合，通过移液器吹打数次使样本混匀，然后将10 µL细胞混合液分别加入细胞计数仪样品载玻片的两个计数腔室中。重复细胞计数3次，以确认每毫升细胞数量。
- 计算并离心含有 50 x 10 的正确体积的细胞培养悬液6 50 mL 离心管中，500 × g 条件下悬浮活癌细胞 g 5 分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀与1 mL胶原蛋白/RPMI混合液混匀。由于胶原蛋白为凝胶状物质，需使用1 mL移液器缓慢而轻柔地混悬细胞，避免因产生气泡导致细胞损失。
- 将制备好的细胞悬液置于冰上，并转移至卵细胞操作区域。
注意：避免将制备好的癌细胞在冰上放置过久。制备好的癌细胞必须在15–25分钟内接种至鸡胚尿囊膜（CAM）上。
6. 在CAM上接种癌细胞
注意：请佩戴手套和口罩以避免污染。
- 在孵化第10天，从孵育箱中取出装有无壳孵化鸡蛋的内部加湿培养室。
注意：约有初始孵育蛋数90%的鸡蛋可用于实验；参见图2。 - 打开内部加湿培养室，使用灭菌镊子将最多六个硅胶环放置于绒毛尿囊膜（CAM）上。
注意：避免将硅胶环彼此靠近放置，或靠近较大的血管。 - 通过移液混匀癌细胞悬液，以确保癌细胞均匀分布，并将20 µL（1 × 106 个细胞）的癌细胞悬液加入一个硅胶环内（图1E）。添加细胞时，保持移液器吸头位于绒毛尿囊膜上方，以确保不损伤膜结构。
注意：根据先前研究结果7，可在同一绒毛尿囊膜的不同硅胶环中接种不同类型的癌细胞。 - 关闭内部加湿培养室，并将其放回蛋类孵育箱中。
7. 分离带有相关癌细胞的尿囊膜（CAM）
- 孵育 14 小时、1.5 天、2.5 天和 3.5 天后，取出约七个内部加湿培养盒，并依次打开盖子。
- 使用剪刀，在硅胶环外侧剪下附着在绒毛尿囊膜（CAM）上的培养癌细胞（即 CAM-Delam 样本）（图 1F）。
- 立即用镊子将分离的 CAM-Delam 样本转移至含有 4% 多聚甲醛（PFA）的 0.1 M 磷酸缓冲液（PB）的培养皿中，以固定组织。在冰上或 4 °C 下保存 1 小时。
注意：4% PFA 溶液应在 4 °C 下保存，最长不超过 5 天。警告：PFA 具有毒性。操作 PFA 粉末及 PFA 溶液时，应在通风橱中进行，并佩戴口罩和手套，避免吸入粉末或溶液蒸气。请遵循制造商的说明。 - 将鸡胚断头，作为生物废弃物丢弃至专用垃圾桶中。
- 去除 4% PFA 溶液，向 CAM-Delam 样本中加入含 30% 蔗糖的 0.1 M PB 溶液，在 4 °C 下平衡 1 小时。
- 在解剖显微镜下，用镊子小心移除硅胶环。使用剪刀将 CAM-Delam 样本剪成矩形，使癌细胞位于中央（图 1G）。
- 用镊子将 CAM-Delam 样本转移至含有冷冻切片包埋介质的培养皿中，以去除多余蔗糖，随后转移至装有冷冻切片包埋介质的包埋模具中。
- 在解剖显微镜下，使用任何针状工具将 CAM-Delam 样本以垂直方向呈 U 形放置于包埋模具中（图 1G）。
- 将 CAM-Delam 样本在 −80 °C 下冷冻并储存。
8. 切片 CAM-Delam 样品
- 使用冷冻切片法将冷冻的 CAM-Delam 样本以 10 µm 厚度连续切片，置于 5-6 张载玻片上。
- 将带有切片的载玻片储存于 −80 °C，或直接用于免疫组织化学染色。
9. 免疫组织化学染色
- 开始免疫染色实验前，将载玻片从 −80 °C 取出，在室温下放置 5 分钟。
- 使用疏水性标记笔在组织切片边缘处画线，然后让载玻片干燥数分钟。
- 将载玻片放入湿化（含 H2O）染色盒中，并用约 200–500 µL 封闭液（含 10% 胎牛血清和 0.1% 叠氮化钠的含 0.1% Triton X-100 的 Tris 缓冲盐水 [TBST]）覆盖组织切片，于 15–30 分钟内孵育。
注意：从本步骤开始，切勿让载玻片在任何时刻干燥。 - 倒去封闭液，加入 100–150 µL 用封闭液稀释的一抗溶液，在 4 °C 过夜孵育。建议使用兔抗层粘连蛋白-111（laminin-111）抗体与肿瘤细胞标志物共同标记基底膜，若未使用 GFP 或其他荧光标记的肿瘤细胞系，则更应如此。
注意：此处还使用了兔抗血管性血友病因子（von Willebrand Factor）抗体，用于检测 CAM 中的血管结构。 - 准备三个玻璃染色缸，分别装满 TBST 缓冲液。
- 倒去一抗溶液，将载玻片转移至玻璃染色缸中，在 TBST 中每次至少洗涤 5 分钟，重复至少 3 次。
- 用柔软的纸巾轻轻吸去载玻片表面及疏水屏障区域的多余 TBST 液体。
- 在载玻片上加入 100–150 µL 用封闭液稀释的合适荧光二抗溶液，并加入 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI），避光于室温孵育 1 小时。
- 倒去二抗溶液，将载玻片转移至玻璃染色缸中，在 TBST 中每次至少洗涤 5 分钟，重复至少 3 次。
- 用柔软的纸巾轻轻吸去载玻片表面及疏水屏障区域的多余 TBST 液体。
- 在载玻片上滴加 1–2 滴荧光封片介质，轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡。
- 分析前于 4 °C 至少干燥 1 小时，并将载玻片储存于 4 °C。
10. 显微成像与脱层评分
- 使用配备数字相机的落射荧光显微镜对切片进行拍照，建议采用 10x 放大倍数（图 1H）。
- 根据以下 CAM-Delam 评分标准分析切片（图 3）：
- 观察是否存在无明显改变的完整基底膜。
- 观察是否存在形态改变但未受损的基底膜。
- 观察是否存在受损但无细胞侵入的基底膜。
- 观察是否存在受损且有细胞侵入的基底膜。
结果
图1 展示CAM-Delam实验的关键步骤7使用内部加湿腔室（图1C显著提高了鸡胚的存活率 <50% 至孵育第10天达到90%，从约15%至孵育第13天达到80%（图2).
图 1：CAM-Delam 实验的关键步骤。（A）将受精的鸡卵水平放置，不旋转，进行孵育。（B,C）孵育第 3 天，敲裂蛋壳并将鸡蛋置于无菌称量舟中（B），然后将称量舟放入内部加湿培养室中继续孵育（C）。（D）制备硅胶环。（E）孵育第 10 天，将硅胶环放置于绒毛尿囊膜（CAM）上，并使用移液器将 1 × 106 个癌细胞接种至环内。（F,G）在不同时间点（数小时至数天），解剖带有附着癌细胞的 CAM，（F）用 PFA 固定，蔗糖处理，置于冷冻切片包埋介质中，（G）随后在 −80 °C 冻存。（H）一张切片的 CAM 示例，显示相关的 GFP+ 癌细胞（绿色）和层粘连蛋白免疫组织化学染色（红色）。比例尺 = 2 mm（E,F）、1 mm（G）和 100 µm（H）。此图来自 Palaniappan 等人7。缩写：CAM = 绒毛尿囊膜；PFA = 多聚甲醛；GFP = 绿色荧光蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：鸡胚存活率与孵化方法的关系。（A,B）在孵化第10天，使用加湿培养室（HC）的鸡胚存活率是使用培养皿（PD）（A；平均值40；N = 64）和非加湿培养室（N-HC）（B；平均值48.67；N = 46）的两倍（平均值89.33；N = 105）。（C,D）在孵化第13天，使用HC仍保持较高的胚胎存活率（平均值81.67；N = 105），而使用PD（C；平均值11.33；N = 64）和N-HC（D；平均值18.33；N = 46）的胚胎存活率显著下降。采用非配对双尾t-检验进行统计学显著性分析。误差线表示标准差。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。本图改编自 Palaniappan 等人7。缩写：HC = 加湿培养室；PD = 培养皿；N-HC = 非加湿培养室；E X = 孵化第X天。请点击此处查看此图的放大版本。
此前，Palaniappan 等人已利用该方案对表达 GFP 的不同癌细胞系（U251 胶质母细胞瘤、PC-3U 前列腺癌、SW620 结肠癌和 A549 肺癌）进行了分析。7. CAM-Delam 实验的结果包括基底膜形态学的差异（通过层粘连蛋白检测）以及癌细胞侵袭情况，后者定义为已穿过鸡胚基底膜层进入鸡胚中胚层的细胞（图3）。这些结果表明，癌细胞降解基底膜并侵入间充质的能力可分为以下四类：1）基底膜完整，无可见改变（图3B），2）结构改变但未受损的基底膜（图3C），3）基底膜受损但无细胞浸润（图3D），以及4）基底膜受损并伴有细胞侵入（图3E另一个观察结果是，当癌细胞导致基底膜发生改变或受损时，绒毛尿囊膜也会增厚，并伴随血管生成增加，后者通过针对血管性血友病因子（von Willebrand's Factor）的抗体染色来确定，该因子在血管中合成。8 (图4C-H）。当CAM保持完整时，未观察到CAM增厚和血管形成增加这两种表型。图4A，B).
图3：CAM-Delam 评分。 (A-E) 基于CAM基底膜完整性（通过抗层粘连蛋白抗体染色显示，红色）以及表达GFP的癌细胞（绿色）潜在侵袭情况的CAM-Delam评分示例。A对照 CAM，不接种癌细胞。B-E在对癌细胞的反应中，可依据基底膜形态分为四类进行评分：B完整层粘连蛋白，（C）发生改变但未受损的层粘连蛋白（以星号表示），（D）基底膜 laminin 损伤但无癌细胞侵袭（箭头），基底膜 laminin 损伤伴细胞侵袭（箭头所示）。比例尺 = 100 µm (A-E）。该图来自 Palaniappan 等人。7缩写：CAM = 绒毛尿囊膜；GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4：CAM 增厚和血管形成的评估。（A-H）通过抗血管性血友病因子（红色）检测到的不同类型癌细胞作用下 CAM 增厚和血管形成的可视化示例。（A,B）无癌细胞的对照组 CAM。（C,D）在非转移性癌细胞系作用下（评分为 完整），未检测到间充质明显增厚或血管形成增加。（E-H）在导致层粘连蛋白 改变 或 损伤 的转移性癌细胞作用下，间充质出现增厚（双箭头指示），并观察到血管形成增加（箭头指示）。比例尺 = 100 µm。本图改编自 Palaniappan 等人7。缩写：CAM = 绒毛尿囊膜；GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。
U251 胶质母细胞瘤细胞和 PC-3U 前列腺癌细胞是两种具有完全不同去层能力的癌细胞系的示例（图5）。PC-3U 细胞在培养1.5天后即诱导出层粘连蛋白的损伤，并在2.5天后出现明显的侵袭现象（图5A）。相比之下，U251 细胞在1.5至3.5天内仅引起层粘连蛋白的轻微改变，但从未造成任何可见的层粘连蛋白损伤（图5B）。
图5：前列腺癌（PC-3U）和胶质母细胞瘤（U251）细胞去附着能力的可视化观察。（A）PC-3U细胞在培养14小时后引起层粘连蛋白轻微改变，1.5天后出现层粘连蛋白损伤（箭头所示），2.5天后开始出现侵袭现象，3.5天后侵袭程度增加（箭头头所示）。（B）U251细胞在培养1.5至3.5天后仅引起层粘连蛋白轻微改变。右侧图示为CAM-Delam评分结果的统计图。纵轴表示样本数量，横轴表示培养时间点。比例尺 = 100 µm（A,B）。本图改编自Palaniappan等人的研究7。缩写：CAM = 尿囊绒毛膜；GFP = 绿色荧光蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。
CAM-Delam 检测可用于定义调控去层化过程的分子机制。一个例子是使用 CoCl2 处理诱导缺氧，单独使用或联合使用广谱基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂 GM6001 来抑制 MMP 活性（图6）。经 CoCl2 处理后，U251 非转移性癌细胞获得了诱导去层化和侵袭性细胞的能力，而当 CoCl2 处理与 MMP 抑制剂 GM6001 联用时，该能力被抑制（图6）。因此，CAM-Delam 检测在界定影响去层化过程的分子及分子通路时具有重要应用价值。
图6：U251细胞经CoCl处理后的剥离模式2 单独或与MMP抑制剂联合使用。 (A-C) 在不同条件下于CAM上培养3.5天的U251细胞。（A）单独培养的U251细胞未对层粘连蛋白造成任何损伤。B经CoCl预处理的培养U251细胞2 （24小时）前洗涤并在CAM上接种细胞可诱导层粘连蛋白损伤及细胞侵袭。C) 使用广谱MMP抑制剂GM6001预处理（1小时），随后进行CoCl₂处理2 暴露（24 h）后，在CAM上洗涤并接种U251细胞，可抑制CoCl的效应2 处理后未检测到明显的层粘连蛋白损伤或癌细胞侵袭。比例尺 = 100 µm (A-C). 面板（B）和（C) 来自 Palaniappan 等人。7缩写：CAM = 绒毛尿囊膜；GFP = 绿色荧光蛋白；CoCl2 = 氯化钴；MMP = 基质金属蛋白酶。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
本文描述了CAM-Delam检测法，用于评估癌细胞的转移侵袭性，其依据是在数小时至数天内对基底膜的改变以及细胞向间充质侵袭的潜力进行评分。以往各种CAM检测技术存在一个技术难题，即鸡胚存活率较低。通过在鸡胚孵育过程中引入内部加湿培养室，该问题得以解决，使鸡胚存活率从10%-50%提高到80%-90%7。因此，使用内部加湿培养室可能不仅对CAM检测普遍具有价值，也适用于其他体外（ex ovo）鸡胚实验。
在CAM上接种1 x 106个癌细胞后，于14小时、1.5天、2.5天和3.5天进行评分的时间点，是基于使用六种不同癌细胞系进行的严格方法学开发而确定的，足以区分癌细胞系从无去层化能力到具有侵袭性去层化能力的范围。建议每个时间点、每种细胞系至少使用四个鸡蛋，每个鸡蛋设置三个环，且实验应至少重复一次，或根据实验设计和统计学要求进行重复。CAM-Delam检测的一个优势在于，可在数天内获得有关癌细胞去层化能力的信息，从而评估癌细胞的侵袭性及形成转移的潜在风险。通过监测侵袭性癌细胞导致的基底膜降解以及随后形成的微肿瘤/肿瘤芽和器官转移，可快速获得结果。传统上，CAM模型用于分析器官转移的形成，但该过程通常需要约2周时间才能确定9。我们先前已通过七种不同癌细胞系验证7，去层化评分与癌细胞在啮齿类动物模型中形成转移的能力相关10,11,12,13,14，这支持了CAM-Delam检测的预测价值。此外，小鼠模型需要更长时间，通常为数周至数月，才能检测到转移灶15,16。简而言之，本研究所建立的CAM-Delam检测方法聚焦于评分去层化能力，而非检测鸡胚中后期的肿瘤形成，因此是对现有鸡胚CAM侵袭模型和小鼠肿瘤模型的良好补充。
CAM-脱层实验的一个局限性在于，如果癌细胞本身表达层粘连蛋白，则基底膜的可视化可能不清晰。若如此，可使用其他指示基底膜的标志物，例如E-钙黏蛋白7。其他CAM侵袭研究曾使用IV型胶原来显示CAM，以及广谱细胞角蛋白和波形蛋白来识别侵袭性癌细胞及微肿瘤/肿瘤芽的形成17,18。
去层化是一种正常的细胞过程，在发育过程中以及生命后期均会发生，它使得细胞能够离开上皮组织并迁移到其他组织中。发育过程中发生去层化的细胞实例包括神经嵴细胞和嗅觉先驱神经元19,20；在生命后期，伤口愈合依赖于去层化过程21。在癌症发生过程中，这一过程在错误的细胞中和/或错误的时间被上调。因此，CAM-Delam 方法可用于揭示调控去层化的分子机制，这对于基础生物学研究和疾病认知均具有重要意义。此类去层化研究可包括将感兴趣的因子添加至接种于 CAM 上的癌细胞，或研究经过基因改造的癌细胞。本文展示的一个例子是使用 CoCl2 预处理非转移性细胞系 U251，以诱导缺氧状态，从而引发转移性侵袭能力，而这种能力可被广谱 MMP 抑制剂所抑制。因此，发现调控去层化的关键分子有助于设计抑制该过程的抑制剂。与此相关，CAM-Delam 实验方案的另一个潜在用途是用于筛选抑制去层化和细胞侵袭的药物。此外，在临床实践中，癌症严重程度的评估是诊断、制定治疗方案和护理计划的关键组成部分。目前，临床上采用 TNM 分期系统（T：肿瘤大小；N：淋巴结是否受累；M：远处转移）来评估癌症的严重程度22。CAM-Delam 检测提供了一种创新方法，用于评估癌细胞的侵袭性强弱及形成转移灶的潜在风险，可能成为 TNM 分期系统的有益补充。值得注意的是，TNM 分期基于固定组织样本的分析，而潜在的临床 CAM-Delam 方法则可结合细胞复苏技术，对新鲜或新鲜冷冻的组织进行检测23。
披露
作者无任何竞争利益需要披露。
致谢
我们感谢乌meå大学的以下研究人员在相关癌细胞系和抗体方面提供的帮助：L. Carlsson（血管性血友病因子抗体）、J. Gilthorpe（U251细胞系）和M. Landström（PC-3U细胞系）。我们还感谢Gilthorpe实验室的Hauke Holthusen构建了HEK293-TLR-AAVS1稳定细胞系。Gunhaga实验室的工作得到了瑞典癌症基金会（18 0463）、乌meå生物技术孵化器、Norrlands癌症研究基金、瑞典研究理事会（2017-01430）以及乌meå大学医学院的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| 离心机 | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL 自动细胞计数器 | Invitrogen | ||
| 冷冻切片机 | HM 505 E, Microm | ||
| 数码相机 | Nikon DS-Ri1 | ||
| 解剖显微镜 | Leica M10 | 用于 CAM 样本的解剖和在模具中的定位 | |
| 孵蛋器 | Fiem | 其他多种来源可选。每次使用前必须用 70% 乙醇清洁并灭菌 | |
| 落射荧光显微镜 | Nikon Eclipse, E800 | 配备数码相机，用于评估细胞去层化和侵袭 | |
| 精细镊子 | 多种来源可选 | 使用前必须灭菌 | |
| –80 °C 超低温冰箱 | Thermo Fisher Scientific | 8600 系列 | 型号 817CV |
| 倒置显微镜 | Nikon Eclipse TS100 | 用于细胞培养操作 | |
| 小剪刀 | 多种来源可选 | 使用前必须灭菌 | |
| 材料 | |||
| 抗层粘连蛋白-111 抗体（anti-Laminin-111） | Sigma-Aldrich | L9393 | 一抗（兔源，1:400） |
| 抗兔 Cy3 二抗（anti-rabbit Cy3） | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | 二抗（1:400） |
| 抗血管性血友病因子抗体（anti-von Willebrand Factor） | DAKO | P0226 | 一抗（1:100） |
氯化钴(II)（Cobalt(II) chloride） | Sigma-Aldrich | 232696-5G | 注意：中等毒性化学品。仅可在通风橱中小心操作。遵循制造商说明 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（1:400） |
| 受精鸡卵 | Strömbäcks Ägg, Vännäs, 瑞典 | 任何本地鸡蛋供应商 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10500-064 | |
| 荧光封片剂 | Allent Technologie | S302380-2 | 封片时避免产生气泡。在 +4 °C 下避光干燥 |
| 用于硅环的玻璃培养皿 | 多种来源可选 | 我们使用 15 mL 的玻璃培养皿。每个培养皿可容纳约 20 个硅环。避免过度密集，以免硅环粘连而影响操作 | |
| 玻璃盖玻片 | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP 抑制剂 | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| 免疫组织化学用载玻片 | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 冷冻包埋介质 | Cellab | 6506 | |
| 多聚甲醛（Paraformaldehyde） | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | 注意：高毒性。仅可在通风橱中小心操作，遵循制造商说明。使用全套防护装备。 |
Peel-A-Way 包埋模具 | Polysciences | 18985 | |
| 青霉素-链霉素（Penicillin–streptomycin） | Gibco | 15070063 | |
| 培养皿 | Sarstedt | 83.3903 | 直径 15 cm，用于细胞培养 |
| 塑料盒 | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel 胶原蛋白 | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL。呈凝胶状。移液时需缓慢轻柔，避免因气泡形成导致细胞损失。 |
| RPMI 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| 硅环 | VWR International | 228-1580 | 内径/外径：4/5 mm。使用前应灭菌。避免对未使用的硅环重复高压灭菌。 |
| 台盼蓝 | Fisher Scientific | T10282 | |
| 胰蛋白酶（Trypsin） | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| 称量舟 | VWR International | 611-0094 | |
| 溶液 | |||
| 胶原-RPMI 培养基混合液（1 mL） | 完全 RPMI 培养基 750 µL | ||
| PureCol EZ Gel 胶原蛋白 250 µL | |||
| 混合后立即使用 | |||
| 完全 RPMI 培养基（500 mL） | RPMI 培养基 445 mL | ||
| 胎牛血清（FBS） 50 mL | |||
| 青霉素-链霉素–streptomycin 5 mL | |||
| 4 °C 保存 | |||
| PB 缓冲液（0.2 M；1 000 mL） | Na2HPO4（分子量 141.76） 21.9 g | ||
| NaH2PO4（分子量 137.99） 6.4 g | |||
| 加去离子水至终体积 1000 mL | |||
| 室温保存 | |||
| PFA（4%）溶于 0.1 M PB（100 mL） | 去离子水 50 mL | ||
| 0.2 M PB 50 mL | |||
| 多聚甲醛（PFA） 4 g | |||
| 在 60 °C 水浴中加热 | |||
| 加入 5 M NaOH 25 µL | |||
| 搅拌至 PFA 粉末完全溶解 | |||
| 4 °C 保存 | |||
| TBST 缓冲液（1 000 mL） | 50 mM Tris，pH 7.4 50 mL | ||
| 150 mM NaCl 30 mL | |||
| 0.1% Triton X-100 10 mL | |||
| H2O（超纯水） 900 mL | |||
| 胰蛋白酶（0.05%；10 mL） | 1× PBS 9 mL | ||
| 10× 胰蛋白酶（0.5%） 1 mL | |||
| 总体积 10 mL，4 °C 保存 |
参考文献
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