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方法文章

电离辐射下肠道上皮的再生

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DOI：

10.3791/64028

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2022年7月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

本文内容

摘要

胃肠道是放射治疗癌症过程中最易受损的器官之一，同时在受到此类损伤后也是再生能力最强的器官系统之一。本方案介绍了一种研究肠上皮再生能力的高效方法。

摘要

肠上皮由单层细胞组成，却包含多种终末分化的细胞类型，这些细胞由位于肠隐窝底部的活跃增殖的肠干细胞生成。然而，在急性肠道损伤发生时，这些活跃的肠干细胞会发生细胞死亡。伽马射线辐照是一种广泛使用的结直肠癌治疗方法，尽管具有良好的治疗效果，但其副作用之一是耗竭活跃的干细胞池。事实上，患者在接受放疗期间常出现胃肠道辐射综合征，部分原因即在于活跃干细胞的耗竭。肠隐窝中活跃肠干细胞的丢失会激活一群通常处于静息状态的储备肠干细胞，并诱导分泌型细胞和肠上皮细胞前体细胞发生去分化。若无这些细胞的参与，肠上皮将无法从放疗及其他严重组织损伤中恢复。谱系示踪技术的最新进展使得研究人员能够在组织再生过程中追踪细胞的激活、分化和迁移过程，并已成功应用于肠道研究。本研究旨在描述一种在辐射损伤后分析小鼠肠上皮内细胞的方法。

引言

如果将人类肠道上皮完全展平，其表面积大约相当于半个羽毛球场地的大小1。实际上，这层分隔人体与肠道内容物的单层细胞被折叠成一系列指状突起（绒毛）和凹陷结构（隐窝），以最大化肠道的表面积。上皮细胞沿隐窝-绒毛轴进行分化。绒毛主要由吸收营养的肠细胞、分泌黏液的杯状细胞以及产生激素的肠内分泌细胞组成；而隐窝则主要包含产生防御素的潘氏细胞、活跃的和静息的干细胞以及祖细胞2,3,4,5。此外，这些细胞与下方间叶区室中的基质细胞、免疫细胞以及管腔内的微生物群之间存在双向通信，形成一个复杂的相互作用网络，对维持肠道稳态以及损伤后的修复至关重要6,7,8。

肠道上皮是人体内自我更新速度最快的组织，其更新周期为2-6天9,10,11。在稳态条件下，位于肠隐窝基底部的活跃干细胞（隐窝基底柱状细胞）表达富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（LGR5），能够快速分裂并产生祖细胞，这些祖细胞可分化为所有其他类型的肠道上皮细胞系。然而，由于其较高的有丝分裂速率，活跃干细胞及其直接子代祖细胞对γ射线损伤特别敏感，照射后会发生凋亡5,12,13,14。当这些细胞丢失后，肠隐窝内的储备干细胞以及非干细胞（包括部分祖细胞和某些终末分化的细胞）会被激活，补充隐窝基底部的细胞群，进而重建绒毛的细胞组成，从而实现肠道上皮的再生15。利用谱系示踪技术，多个研究团队已证实，储备型（静息态）干细胞能够在活跃干细胞丢失后支持组织再生过程13,16,17,18,19,20,21,22。这类细胞的特征是表达多梳复合物蛋白1癌基因（Bmi1）、小鼠端粒酶逆转录酶基因（mTert）、Hop同源框基因（Hopx）以及富含亮氨酸重复序列蛋白1基因（Lrig1）。此外，已有研究表明，非干细胞在损伤后也具备补充肠隐窝的能力23,24,25,26,27,28,29,30,31。特别是，分泌细胞和肠吸收细胞的祖细胞在损伤后可发生去分化，逆转为类干细胞状态，并支持肠道上皮的再生。近期研究发现，一些表达多种标志物的细胞在损伤后能够获得类干细胞特性（如DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+）32,33,34,35,36。令人意外的是，Yu等人发现即使是成熟的潘氏细胞（LYZ+）也能参与肠道再生过程37。此外，除了引起肠道上皮细胞凋亡和破坏上皮屏障功能外，辐射还会导致肠道菌群失调、免疫细胞活化、促炎反应的启动以及间充质细胞和基质细胞的激活38,39。

伽马辐射是癌症治疗中一种有价值的治疗工具，尤其适用于结直肠肿瘤40。然而，辐射会通过诱导细胞损伤而导致细胞凋亡，显著影响肠道稳态。辐射暴露会引起多种紊乱，延缓患者的康复过程，急性期表现为黏膜损伤和炎症，长期则表现为腹泻、失禁、出血和腹痛。这一系列症状被称为胃肠道放射毒性。此外，辐射诱发的透壁性纤维化和/或血管硬化可能在治疗数年后才显现38,41。在造成损伤的同时，辐射也会诱导肠道细胞产生修复反应，激活负责启动和协调再生过程的信号通路42。放射性小肠疾病可源于对其他器官（如宫颈、前列腺、胰腺、直肠）进行的盆腔或腹部放疗41,43,44,45,46。因此，肠道辐射损伤是一个重要的临床问题，深入理解其病理生理机制有望推动干预措施的发展，以减轻与放疗相关的胃肠道并发症。除辐射外，还有其他技术可用于研究肠上皮的再生功能。目前已开发出用于研究炎症及其后续再生过程的转基因和化学诱导小鼠模型47。葡聚糖硫酸钠（DSS）可在肠道内诱导炎症，并引发类似于炎症性肠病的特征48。DSS处理与致癌化合物偶氮甲烷（AOM）联合使用可导致结肠炎相关性癌症的发生48,49。缺血-再灌注损伤是另一种用于研究肠上皮再生潜能的方法，但该技术需要丰富的操作经验和外科知识50。此外，上述技术造成的损伤类型不同于辐射，可能涉及不同的再生机制。同时，这些模型耗时较长，而辐射技术相对短暂。近年来，利用从小肠和结肠来源的类肠体（enteroids）和类结肠体（colonoids）建立的体外（in vitro）方法，已与辐射损伤结合用于研究肠道再生机制51,52。然而，这些技术尚不能完全模拟其所代表的器官53,54。

本方案介绍了一种小鼠γ射线损伤模型，并结合一种遗传模型（经他莫昔芬处理后，可示踪源自储备干细胞群体的细胞谱系（Bmi1-CreER;Rosa26eYFP））。该模型采用12 Gy的全身照射，可诱导出足以激活储备干细胞的肠道损伤，同时仍可在损伤后7天内进一步研究肠道再生能力55。

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方案

所有小鼠均饲养于纽约州立大学石溪分校实验动物资源部（DLAR）。所有涉及动物实验的研究和操作均经纽约州立大学石溪分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。涉及动物实验的操作均严格遵循批准的动物操作规程（IACUC #245094）进行。

注意：小鼠品系 B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-CreER) 和 B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) 均购自商业来源（见材料表），并按先前所述方法杂交以获得 Bmi1-CreER;Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) 小鼠 56,57,58。

1. Bmi1-Cre ER;Rosa26 eYFP 小鼠的饲养

  1. 将小鼠饲养在温度为68–72 °F、湿度为30–70%的动物房中，保持12 h光照/12 h黑暗循环，并自由供应水和普通饲料 随意摄取.
  2. 在实验开始前，使用标准的PCR基因分型技术确认小鼠的基因型57,58.

2. 动物与材料的准备

  1. 将小鼠转移至实验环境 在进行任何实验前，将小鼠置于饲养室中至少适应7天。
  2. 根据性别和年龄匹配实验组和对照组动物。
  3. 对对照组动物进行他莫昔芬诱导的Cre介导重组，但不进行照射（假处理，0 Gy），同时确保实验组动物接受他莫昔芬注射并暴露于γ射线照射。
  4. 配制他莫昔芬溶液。将他莫昔芬粉末溶于无菌玉米油中，终浓度为30 mg/mL。以60%的振幅进行超声处理，每次超声30秒，间歇30秒，累计超声3分钟，随后在室温（RT）避光旋转孵育1小时。他莫昔芬溶液可在−20 °C冷冻保存，但避免反复冻融超过一次。建议每次使用前新鲜配制，不长期储存。
    注意：他莫昔芬对光敏感。在室温下旋转时需用锡箔纸包裹。
    警告：他莫昔芬为潜在有害物质：健康危害（GHS08）和环境危害（GHS09）。
  5. 配制5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）储备液。将EdU粉末溶于总体积1/5的无菌二甲基亚砜（DMSO）中，然后缓慢加入剩余4/5体积的无菌超纯水。待完全溶解后，分装并保存于−20 °C。
    警告：5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）和二甲基亚砜（DMSO）为潜在有害物质：EdU 属于健康危害（H340 和 H631），可能引起遗传性缺陷，且怀疑对生育能力或未出生婴儿造成损害；DMSO 属于易燃液体（H227）、引起皮肤刺激（H315）和引起严重眼刺激（H319）。EdU 可能导致遗传缺陷，DMSO 可引起皮肤和眼部刺激。
  6. 准备组织采集和固定的试剂：用蒸馏水稀释乙醇，配制70%乙醇水溶液，将DPBS冷却至4 °C，并配制改良Bouin固定液缓冲液（含50%乙醇和5%乙酸的蒸馏水溶液）2O）和10%缓冲甲醛。
    警告：乙醇是一种潜在危险物质：危害健康（H225-H319），易燃（GHS02），可引起急性毒性（GHS07）。乙酸是一种潜在危险物质：危害健康（H226-H314），易燃（GHS02），具有腐蚀性（GHS05）。 甲醛是一种潜在的有害物质：危害健康（H350、H315、H317、H318、H370），具有腐蚀性。甲醛可能致癌，引起皮肤和眼睛刺激，导致器官损伤，并引发过敏性皮肤反应。
  7. 根据批准的方法准备安乐死所需的设备（CO₂）2 腔室（例如），小鼠解剖工具包（剪刀、镊子），培养皿，连接10 mL注射器用于冲洗肠道的16 G灌胃针，以及组织学包埋盒。

3. 全身γ射线照射（TBI）及组织采集

  1. 在γ射线照射前两天，向实验动物注射单剂量他莫昔芬，以诱导Cre介导的重组及BMI1/EYFP+细胞谱系示踪。称量每只动物体重，并计算40 mg/kg体重剂量的他莫昔芬，将其重悬于玉米油中。用70%乙醇消毒腹部区域，使用连接1 mL注射器的27G针头进行腹腔注射。
  2. 在接下来的48小时内观察动物，以排除潜在的他莫昔芬毒性反应。
  3. 按照当地机构规定，将小鼠转移至辐照室。
  4. 根据当前精确的剂量率，计算137Cs源释放的辐照时间。例如，若当前剂量率为75.9 rad/min（0.759 Gy min−1 = 75.9 cGy m−1），则暴露时间（分钟）计算公式为：所需剂量 / 0.759。若需对动物进行12 Gy全身辐照（TBI），暴露时间约为15.81分钟（即15分钟48秒）。
  5. 用70%乙醇溶液对γ辐照仪的样品室进行消毒；将吸水垫和动物放入样品室内。
    注：假处理动物应置于辐照室内，但不接受γ射线照射。
  6. 盖上盖子并关闭样品室。
  7. 设定γ辐照仪对动物进行12 Gy全身辐照（TBI）：
    1. 将钥匙转至START位置以启动设备。
    2. 使用数字键盘输入操作员编号，按ENTER键确认。
    3. 使用数字键盘输入个人识别码（PIN），按ENTER键确认。
    4. 按1进入选项菜单。
    5. 按1进入定时器设置。
    6. 按1设置辐照时间。
    7. 使用数字键盘输入下一循环的定时设置（格式为hh:mm:ss），按ENTER键确认。
    8. 再次按ENTER键确认设置。
    9. 连续按CLEAR键两次返回主菜单。
    10. 按下START键开始辐照。
  8. 在辐照期间离开房间。预设时间结束后，设备将自动停止并发出蜂鸣声。
    警告：铯-137（137Cs）是一种致命危险物质（健康危害：H314）。大量外部暴露于 137Cs可导致烧伤、急性放射病甚至死亡。 
  9. 将钥匙转至STOP位置以关闭设备。
  10. 打开样品室，取下盖子，将动物转移回笼具中，并用70%乙醇溶液对样品室进行消毒。
  11. 将动物转移回常规饲养室，并观察其治疗后的状态。
  12. 每日监测动物体重，若出现健康状况改变、痛苦表现或体重下降超过初始体重15%的情况，应立即实施安乐死（即使未到预定时间点）。
  13. 在预定安乐死前3小时，消毒腹部区域，使用28G胰岛素注射器向小鼠腹腔注射100 µL EdU储备液。
  14. 在辐照后0 h、3 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h和168 h收集近端肠道组织。
    1. 根据本机构标准实施CO2安乐死。
      警告：二氧化碳为有害物质（H280）。内含加压气体，受热可能爆炸。可能置换氧气，导致快速窒息。
    2. 随后解剖小肠近端部分，去除附着组织，使用连接10 mL注射器的16 G直头喂养针以冷DPBS冲洗，再用同一装置以改良Bouin固定液灌注固定，沿纵轴切开，并采用此前描述的“瑞士卷”技术（swiss-roll technique）卷起近端肠道59。
  15. 将组织置于组织学包埋盒中，放入盛有10%中性缓冲福尔马林的容器内，在室温下放置24–48小时。福尔马林体积应足以完全浸没组织包埋盒。孵育时间结束后，用镊子将包埋盒转移至盛有70%乙醇的容器中。随后进行组织石蜡包埋。
    注：组织石蜡包埋由石溪大学研究组织学核心实验室完成。此步骤后可暂停流程，石蜡块可在室温下保存。
    ​警告：福尔马林为潜在危险物质：健康危害（H350、H315、H317、H318、H370），具腐蚀性。福尔马林可能致癌，引起皮肤和眼睛刺激，导致器官损伤及过敏性皮肤反应。

4. 组织学分析

  1. 将含有石蜡包埋组织样本的组织学包埋盒置于冰上至少 1 小时以降温。使用切片机制备厚度为 5 µm 的切片用于染色。每种组织均应水平切片，以完整覆盖整个卷曲的样本。
    1. 切完石蜡块后，将组织切片转移至预热至 45 °C 的水浴中，并将切片展平于带电荷的载玻片上。将载玻片置于室温下的架上过夜干燥。
      注意：此步骤可作为暂停点，载玻片可在室温下储存。
  2. 将载玻片放入玻片架中，在 65 °C 烤箱中烘烤过夜。也可缩短烘烤时间至 1–2 小时。但对于新近（不足 1 个月）制备的切片，不建议缩短时间。
    注意：将手动玻片染色装置置于化学通风橱下，并在化学通风橱内完成二甲苯、乙醇和苏木精的孵育步骤。
  3. 次日，将玻片架置于化学通风橱中静置 10 分钟，使载玻片冷却。
  4. 将玻片架浸入盛有 100% 二甲苯的容器中，脱蜡 3 分钟。更换新鲜的 100% 二甲苯，重复孵育一次。
    注意：自此步骤起，务必始终保持样本处于湿润状态。
    警告：二甲苯为潜在有害物质：易燃（GHS02），可致急性毒性（GHS07），属于健康危害物质（H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412）。其潜在危害包括：若吞咽或吸入可致死亡，可引起皮肤、眼睛及呼吸道刺激。此外，可能通过引起嗜睡或头晕影响运动功能，并在长期或反复暴露下导致器官损伤。
  5. 通过将玻片架依次浸入下列乙醇梯度溶液中对切片进行再水化：100% 乙醇，2 分钟；95% 乙醇，2 分钟；70% 乙醇，2 分钟。
  6. 将玻片架转移至盛有蒸馏水的容器中，并用流动蒸馏水冲洗 2 分钟。
  7. 将玻片架放入盛有苏木精溶液的容器中，染色 5 分钟（在化学通风橱内进行）。
  8. 将玻片架转移至盛有自来水的容器中，用流动自来水冲洗，直至苏木精染色呈现蓝紫色，通常约需 2 分钟。
  9. 将玻片架转移至盛有 5% (w/v) 碳酸锂溶液的容器中，浸入 10 次。
    警告：碳酸锂为潜在有害物质：可致急性毒性（GHS07），属于健康危害物质（H302 - H319）。若吞咽有害，与皮肤接触有害，并可引起严重眼刺激。
  10. 将玻片架转移至盛有蒸馏水的容器中，并用流动蒸馏水冲洗 2 分钟。
  11. 将玻片架放入盛有伊红的容器中，染色 5 分钟。
  12. 将玻片架转移至盛有 70% 乙醇的容器中，短暂冲洗（10 秒）。
  13. 将玻片架依次浸入乙醇梯度溶液中进行脱水：95% 乙醇，浸洗 5 次；100% 乙醇，浸洗 5 次。
  14. 将玻片架放入盛有 100% 二甲苯的容器中，透明化处理 3 分钟。更换新鲜的 100% 二甲苯，重复孵育一次。
  15. 将载玻片从架中取出，用纸巾擦干组织周围的区域，根据样本大小，在样本表面滴加一滴或两滴基于二甲苯的封片介质。轻轻将盖玻片覆盖在载玻片上（注意避免产生气泡）。必要时可轻压以确保平整。整个载玻片表面应被完全覆盖并密封。
  16. 将载玻片置于化学通风橱下过夜干燥。通常封片介质在 24 小时内即可固化。为确认干燥程度，可制作测试样本：取一张空白载玻片，滴加一滴封片介质，置于化学通风橱下过夜。次日轻触液滴，检查是否已完全固化。
  17. 待载玻片完全干燥后，使用光学显微镜或配备明场通道的更高级显微镜观察组织的组织学形态。
    1. 将显微镜载玻片置于载物台上，移动至样本位于视野中央，调节焦距旋钮对焦，并使用 10x 和/或 20x 放大倍数的物镜，与对照组织（假照射组织）进行组织学比较分析。
    2. 若显微镜配备相机，同时采集图像。
      ​注意：此步骤可作为暂停点；载玻片可在室温下储存，后续再进行分析。但存放时间不应超过 30 天，因染色会随时间逐渐褪色。

5. 免疫荧光染色

  1. 将含有石蜡包埋组织样本的组织学盒置于冰上至少 1 小时以降温。使用切片机制备厚度为 5 µm 的切片用于染色。每种组织均应水平切片，以完整覆盖整个卷曲的样本。
    1. 切割石蜡块后，将组织切片转移至 45 °C 预热的水浴中，并将切片贴附于带电荷的载玻片上。将载玻片置于室温下的架上过夜干燥。
      注意：此步骤可作为暂停点，载玻片可在室温下储存。
  2. 将载玻片放入玻片架中，在 65 °C 烤箱中烘烤过夜。也可缩短烘烤时间至 1–2 小时，但对于新近（不到 1 个月前）切制的切片不建议缩短时间。
    注意：将手动玻片染色装置置于化学通风橱下，并在化学通风橱内完成二甲苯、乙醇以及 H2O2/甲醇的孵育步骤。
  3. 次日，将玻片架置于化学通风橱内静置 10 分钟，使载玻片冷却。
  4. 将玻片架浸入盛有 100% 二甲苯的容器中 3 分钟以脱蜡。更换新鲜的 100% 二甲苯重复孵育一次。
    注意：自此步骤起，务必始终保持样本处于湿润状态。
  5. 在化学通风橱内，将载玻片置于盛有甲醇配制的 2% 过氧化氢溶液的容器中孵育 30 分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。
    警告：甲醇为潜在有害物质：健康危害（H225-H301、H311、H331-H370），易燃（GHS02），并可引起急性毒性（经口、经皮、吸入）（GHS08）。过氧化氢为潜在有害物质：具有腐蚀性（GHS05），并可引起急性毒性（GHS07）。
  6. 通过乙醇梯度对切片进行复水处理：依次将玻片架浸入下列溶液的容器中：100% 乙醇，3 分钟；95% 乙醇，3 分钟；70% 乙醇，3 分钟。
  7. 将玻片架转移至盛有蒸馏水的容器中，并用流动的蒸馏水冲洗 2 分钟。
  8. 为进行抗原修复，将玻片架转移至盛有 250 mL 枸橼酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween-20，pH 6.0）的容器中，使用去封闭室在 110 °C 下加热 10 分钟。
  9. 将整个容器转移至冷室，使其在 30 分钟内逐渐冷却。
  10. 30 分钟后，将枸橼酸盐缓冲液更换为蒸馏水，并用流动的蒸馏水冲洗，直至所有漂浮的石蜡碎片被清除。
  11. 将载玻片逐个从架上取出，轻敲纸巾以吸去多余液体，再用纸巾小心擦干样本周围的区域。使用可形成疏水屏障的笔（PAP 笔）在样本周围画出封闭轮廓。随后将载玻片放入湿盒中。
  12. 加入 200 µL 含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBS-Tween 封闭液覆盖样本表面，确保无泄漏。在湿盒中 37 °C 孵育 30 分钟。
  13. 轻敲载玻片以去除封闭液，将载玻片放回湿盒中。加入 100 µL 用封闭缓冲液稀释的适当浓度的一抗溶液，4 °C 轻柔振荡孵育过夜。对于 BMI1/EYFP，使用鸡抗 GFP 抗体（稀释比例 1:500）；对于 Ki-67，使用兔抗 Ki-67 抗体（稀释比例 1:200）。
  14. 轻敲载玻片以去除一抗溶液，将载玻片放入玻片架并转移至盛有 TBS-Tween 的容器中。振荡洗涤 5 分钟，重复 3 次，每次均使用新鲜的 TBS-Tween 缓冲液。
  15. 将载玻片逐个从架上取出，轻敲纸巾去除多余洗涤液后放入湿盒中。加入 100 µL 用封闭缓冲液稀释的适当浓度的二抗溶液，37 °C 孵育 30 分钟。二抗应偶联荧光染料。对于 BMI1/EYFP，使用驴抗鸡 Alexa Fluor 647（稀释比例 1:500）；对于 Ki-67，使用山羊抗兔 Alexa Fluor 488（稀释比例 1:500）。
  16. 轻敲载玻片以去除二抗溶液，将载玻片放入玻片架并转移至盛有 TBS-Tween 的容器中。振荡洗涤 5 分钟，重复 3 次，每次均使用新鲜的 TBS-Tween 缓冲液。
  17. 将载玻片逐个从架上取出，轻敲纸巾去除多余洗涤液后放入湿盒中。加入 100 µL 按照制造商说明配制并使用 Alexa Fluor 555 荧光染料的 EdU 染色液。
  18. 轻敲载玻片以去除 EdU 溶液，将载玻片放入玻片架并转移至盛有 TBS-Tween 的容器中。振荡洗涤 5 分钟，重复 2 次，每次均使用新鲜的 TBS-Tween 缓冲液。
  19. 将载玻片逐个从架上取出，轻敲纸巾去除多余洗涤液后放入湿盒中。加入 100 µL Hoechst 33258 溶液（以 TBS-Tween 稀释 1:1000）覆盖样本表面，进行 Hoechst 33258 复染。室温避光孵育 5 分钟。
  20. 轻敲载玻片以去除 Hoechst 33258 溶液，将载玻片放入玻片架并转移至盛有 TBS-Tween 的容器中。振荡洗涤 5 分钟。
  21. 将载玻片从架上取出，用纸巾擦干组织周围的区域，根据样本大小，在样本表面滴加一滴或两滴水性封片剂。轻轻盖上盖玻片（注意避免产生气泡），必要时可轻压以确保完全覆盖并密封整个载玻片表面。
  22. 将载玻片置于室温避光条件下过夜干燥。通常封片剂在 24 小时内即可固化。为确认干燥程度，可制作测试样本：取一空白载玻片，滴加一滴封片剂并置于化学通风橱中过夜，次日触摸检测是否已固化。
  23. 待载玻片完全干燥后，可使用配备相应发射波长滤光片的荧光显微镜分析染色结果，以观察 Ki-67、EdU 和 BMI1/EYFP 染色信号（分别为 535 nm、646 nm 和 700 nm）。
  24. 将载玻片置于显微镜载物台上，移动至视野中央，调节焦距旋钮，使用 10x 和/或 20x 物镜观察染色情况，并与对照组织（假照射组）进行比较。若显微镜配备相机，可分别采集各通道图像，后期进行合并。
    ​注意：此步骤可作为暂停点，载玻片可在 4 °C 下储存并后续分析。但储存时间不应超过 14 天，因染色信号会随时间逐渐减弱。

6. TUNEL 染色

  1. 将含有石蜡包埋组织样本的组织学盒置于冰上至少 1 小时以降温。使用切片机制备厚度为 5 µm 的切片用于染色。每种组织均应水平切片，以完整覆盖整个卷曲的样本。
    1. 切完石蜡块后，将组织切片转移至预热至 45 °C 的水浴中，并将切片展平于带电荷的载玻片上。将载玻片置于室温下的玻片架上过夜干燥。
      注意：此步骤可作为暂停点，载玻片可在室温下储存。
  2. 将载玻片放入玻片架中，在 65 °C 烤箱中烘烤过夜。
    注意：载玻片也可缩短烘烤时间至 1–2 小时。但对于新近（不足 1 个月前）切制的切片，不建议缩短时间。将手动玻片染色装置置于化学通风橱下，并在化学通风橱内进行二甲苯和乙醇的孵育步骤。
  3. 次日，将玻片架置于化学通风橱内静置 10 分钟，使载玻片冷却。
  4. 将玻片架浸入盛有 100% 二甲苯的容器中 3 分钟以脱蜡。更换新鲜的 100% 二甲苯重复孵育一次。
    注意：自此步骤起，务必始终保持样本处于湿润状态。
  5. 通过将玻片架依次浸入下列溶液的容器中，以梯度乙醇对切片进行再水化：100% 乙醇，3 分钟；95% 乙醇，3 分钟；90% 乙醇，3 分钟；80% 乙醇，3 分钟；70% 乙醇，3 分钟。
  6. 将玻片架转移至盛有蒸馏水的容器中，并用流动的蒸馏水冲洗 1 分钟。
  7. 将载玻片逐个从玻片架中取出，轻敲滤纸以吸去多余液体，并用滤纸小心擦干样本周围的区域。使用可形成疏水屏障的笔（PAP 笔）在样本周围画出封闭轮廓。随后将载玻片置于湿化孵育盒中。
  8. 孵育无 DNase 活性的蛋白酶 K：在疏水屏障内的样本表面加入 100 µL 无 DNase 活性的蛋白酶 K 溶液（以 DPBS 按 1:25 稀释），在湿化孵育盒中室温孵育 15 分钟。
    警告：蛋白酶 K 为潜在有害物质：健康危害（H315 - H319 - H334）。
  9. 通过轻敲载玻片于滤纸上除去蛋白酶 K 溶液；将载玻片放回玻片架，并转移至盛有 DPBS 的容器中。振荡洗涤 5 分钟，重复 2 次，每次均使用新鲜 DPBS。
  10. 配制 TUNEL 反应混合液：将标记液（1x）与酶液（10x）混合，充分吹打混匀。
  11. 将载玻片逐个从玻片架中取出，轻敲滤纸以除去多余洗涤液后置于湿化孵育盒中。在样本表面加入 50 μL TUNEL 反应混合液，在 37 °C 湿化孵育盒中避光孵育 60 分钟。作为阴性对照，仅使用标记液（不含 TdT）。
  12. 通过轻敲载玻片于滤纸上除去 TUNEL 反应液；将载玻片放回玻片架，并转移至盛有 DPBS 的容器中。振荡洗涤 5 分钟，重复 2 次，每次均使用新鲜 DPBS。
  13. 将载玻片逐个从玻片架中取出，轻敲滤纸以除去多余洗涤液后置于湿化孵育盒中。进行 Hoechst 33258 复染：在样本表面加入 100 µL Hoechst 33258 溶液（以 TBS-Tween 按 1:1000 稀释），室温避光孵育 5 分钟。
  14. 通过轻敲载玻片于滤纸上除去 Hoechst 33258 溶液；将载玻片放回玻片架，并转移至盛有 DPBS 的容器中。振荡洗涤 5 分钟。
  15. 将载玻片从玻片架中取出，用滤纸擦干组织周围区域，根据样本大小，在样本表面滴加一至两滴水性封片剂。轻轻盖上盖玻片（注意避免产生气泡），必要时可轻压以确保完全覆盖并密封。
  16. 将载玻片在室温避光条件下过夜干燥。通常封片剂在 24 小时内即可固化。为确认是否干燥，可制作测试样本：滴加一滴封片剂于载玻片上，室温避光过夜，次日轻触检测是否已固化。
  17. 待载玻片完全干燥后，可使用配备发射波长滤光片（可检测 TUNEL 染色，535 nm）的荧光显微镜观察染色结果。
  18. 将载玻片置于显微镜载物台上，移动至视野中央，调节焦距旋钮，使用 10x 和/或 20x 物镜观察染色情况，并与对照组织（假照射组）进行比较。若显微镜配备相机，可拍摄图像。应分别采集各通道图像，后期再进行合并。
    注意：此步骤可作为暂停点，载玻片可在 4 °C 保存并后续分析。但不宜保存超过 14 天，因染色信号会随时间逐渐减弱。

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结果

采用12 Gy全身照射（TBI）结合小鼠遗传谱系示踪技术，可对辐射损伤在肠道中的后果进行系统分析。首先，给予 Bmi1-CreER;Rosa26eYFP 小鼠单次他莫昔芬注射，以诱导Bmi1+ 静息干细胞群体中增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的表达。在注射他莫昔芬两天后，小鼠接受照射或假照射处理。安乐死前3小时，小鼠注射EdU。安乐死后，在照射后0 h、3 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h以及7天采集小肠样本进行分析。上述时间序列中代表性苏木精和伊红（H&E）染色图像（图1）展示了肠上皮对损伤的响应过程。0 h时间点代表稳态下的肠上皮结构（图1）；随后进入凋亡阶段，表现为在3 h至48 h期间隐窝区细胞大量丢失（图1）；之后进入再生阶段，在72 h至96 h期间可见大量高增殖活性细胞重新占据隐窝区域（图1

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讨论

本方案描述了一种稳定且可重复的辐射损伤模型。该模型可对损伤后7天内肠道上皮的变化进行精确分析。重要的是，所选的时间点反映了损伤的关键阶段，其特征是肠道发生一系列明确的改变（包括损伤期、凋亡期、再生期和恢复正常期）60。该辐射模型已被建立并经过仔细评估，能够适当地模拟接受放射治疗患者所经历的损伤表现61。超过一半的结直肠癌和妇科癌症患者会接受腹部放疗40,62,63。尽管现代放疗技术已能精确定位靶区，患者仍不可避免地使健康肠道组织受到照射，从而产生与本研究所述全身照射模型非常相似的病理生理变化。因此，本文描述的辐射模型有望用于研究患者和/或医务人员意外辐射暴露后的后果，对人类健康具有重要意义。

Bmi1-CreER;Rosa26eYFP...

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致谢

作者希望感谢石溪癌症中心组织学研究核心在组织样本制备方面提供的专业技术支持，以及石溪大学实验动物资源部在动物护理和操作方面的协助。本研究工作得到了美国国立卫生研究院资助项目DK124342（授予Agnieszka B. Bialkowska）和DK052230（授予Vincent W. Yang博士）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL注射器BD309659-
16G 可重复使用小型动物饲喂针：直头VWR20068-630-
27G × 1/2" 针BD305109-
28G × 1/2" Monoject 1 mL 胰岛素注射器Covidien1188128012-
5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL，溶于无菌DMSO:水（1:4 v/v），分装后于-20℃保存°C
Azer Scientific 10% 中性缓冲福尔马林Fisher Scientific22-026-213-
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J杰克逊实验室品系编号：006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J杰克逊实验室品系编号：010531
牛血清白蛋白第五组分，热激Millipore-Sigma3116956001
鸡抗GFP鸟纲GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 成像试剂盒，Invitrogen赛默飞世尔科技C10638-
玉米油Millipore-SigmaC8267-
脱扣室Biocare MedicalDC2012-
二甲基亚砜（DMSO）Fisher BioReagentsBP231-100光敏感
无DNase蛋白酶KInvitrogenC10618H在DPBS中按1:25稀释
驴抗鸡 AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-
伊红Fisher ScientificS176
荧光显微镜尼康Eclipse 90i，具备明场与荧光照明，配备物镜：10X、20X尼康
Fluoromount 水性封片介质Millipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0.759 Gy min-1
山羊抗兔 AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
苏木精溶液，Gill 3号Millipore-SigmaGHS332
Thermo Scientific HM 325 旋转式切片机Fisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258 五水合物（双苯并咪唑）赛默飞世尔科技H3569稀释比例 1:1000
过氧化氢溶液，ACS级，29-32%，Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-
原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素（Roche）Millipore-Sigma11684795910
Liquid Blocker Super PAP笔，迷你型Fisher ScientificDAI-PAP-S-M
碳酸锂（粉末/ACS认证），Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000.5 g/1 L dH2O
鲁尔锁式注射器 无菌 一次性使用 10 mLVWR89215-218-
甲醇VWRBDH1135-4LP
Pharmco 产品 乙醇，200 证明Fisher ScientificNC1675398-
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT 乙酸 ACS 级Capitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-
兔抗 Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL 封片介质Fisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie 用于在 65 度烘烤载玻片Fisher Scientific50-728-103
二水合柠檬酸钠Fisher ScientificS279-500
不锈钢解剖工具套装VWR25640-002
Superfrost Plus 显微载玻片 [尺寸：25 x 75 x 1 mm]VWR 48311-703
他莫昔芬Millipore-SigmaT564830 mg/mL，溶于无菌玉米油中，建议新鲜配制或于-20℃短期保存°C，光敏感
Tissue-Tek 24片载玻片架（带可拆卸手柄）Sakura4465
Tissue-Tek Accu-Edge 低剖面刀片樱花4689
Tissue-Tek 手动载玻片染色套装樱花4451
Tissue-Tek 染色皿，绿色带盖樱花4456
Tissue-Tek 染色皿，白色带盖樱花4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Unisette 处理盒VWR87002-292-
VWR 微型盖玻片VWR48393-081
二甲苯Fisher ScientificX5P-1GAL

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