电离辐射下肠道上皮的再生

摘要

胃肠道是放射治疗癌症过程中最易受损的器官之一，同时在受到此类损伤后也是再生能力最强的器官系统之一。本方案介绍了一种研究肠上皮再生能力的高效方法。

摘要

肠上皮由单层细胞组成，却包含多种终末分化的细胞类型，这些细胞由位于肠隐窝底部的活跃增殖的肠干细胞生成。然而，在急性肠道损伤发生时，这些活跃的肠干细胞会发生细胞死亡。伽马射线辐照是一种广泛使用的结直肠癌治疗方法，尽管具有良好的治疗效果，但其副作用之一是耗竭活跃的干细胞池。事实上，患者在接受放疗期间常出现胃肠道辐射综合征，部分原因即在于活跃干细胞的耗竭。肠隐窝中活跃肠干细胞的丢失会激活一群通常处于静息状态的储备肠干细胞，并诱导分泌型细胞和肠上皮细胞前体细胞发生去分化。若无这些细胞的参与，肠上皮将无法从放疗及其他严重组织损伤中恢复。谱系示踪技术的最新进展使得研究人员能够在组织再生过程中追踪细胞的激活、分化和迁移过程，并已成功应用于肠道研究。本研究旨在描述一种在辐射损伤后分析小鼠肠上皮内细胞的方法。

引言

如果将人类肠道上皮完全展平，其表面积大约相当于半个羽毛球场地的大小¹。实际上，这层分隔人体与肠道内容物的单层细胞被折叠成一系列指状突起（绒毛）和凹陷结构（隐窝），以最大化肠道的表面积。上皮细胞沿隐窝-绒毛轴进行分化。绒毛主要由吸收营养的肠细胞、分泌黏液的杯状细胞以及产生激素的肠内分泌细胞组成；而隐窝则主要包含产生防御素的潘氏细胞、活跃的和静息的干细胞以及祖细胞^2,3,4,5。此外，这些细胞与下方间叶区室中的基质细胞、免疫细胞以及管腔内的微生物群之间存在双向通信，形成一个复杂的相互作用网络，对维持肠道稳态以及损伤后的修复至关重要^6,7,8。

肠道上皮是人体内自我更新速度最快的组织，其更新周期为2-6天^9,10,11

方案

所有小鼠均饲养于纽约州立大学石溪分校实验动物资源部（DLAR）。所有涉及动物实验的研究和操作均经纽约州立大学石溪分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。涉及动物实验的操作均严格遵循批准的动物操作规程（IACUC #245094）进行。

注意：小鼠品系 B6;129-Bmi1^{tm1(cre/ERT)Mrc}/J (Bmi1-Cre^ER) 和 B6.129X1-Gt(ROSA)26Sor^tm1(EYFP)Cos/J (Rosa26^eYFP) 均购自商业来源（见材料表），并按先前所述方法杂交以获得 Bmi1-Cre^ER;Rosa26^eYFP (Bmi1^ctrl) 小鼠 ^56,57,58。

1. Bmi1-Cre ^ER;Rosa26 ^eYFP

结果

采用12 Gy全身照射（TBI）结合小鼠遗传谱系示踪技术，可对辐射损伤在肠道中的后果进行系统分析。首先，给予 Bmi1-Cre^ER;Rosa26^eYFP 小鼠单次他莫昔芬注射，以诱导Bmi1⁺ 静息干细胞群体中增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的表达。在注射他莫昔芬两天后，小鼠接受照射或假照射处理。安乐死前3小时，小鼠注射EdU。安乐死后，在照射后0 h、3 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h以及7天采集小肠样本进行分析。上述时间序列中代表性苏木精和伊红（H&E）染色图像（图1）展示了肠上皮对损伤的响应过程。0 h时间点代表稳态下的肠上皮结构（图1）；随后进入凋亡阶段，表现为在3 h至48 h期间隐窝区细胞大量丢失（图1）；之后进入再生阶段，在72 h至96 h期间可见大量高增殖活性细胞重新占据隐窝区域（图1

讨论

本方案描述了一种稳定且可重复的辐射损伤模型。该模型可对损伤后7天内肠道上皮的变化进行精确分析。重要的是，所选的时间点反映了损伤的关键阶段，其特征是肠道发生一系列明确的改变（包括损伤期、凋亡期、再生期和恢复正常期）⁶⁰。该辐射模型已被建立并经过仔细评估，能够适当地模拟接受放射治疗患者所经历的损伤表现⁶¹。超过一半的结直肠癌和妇科癌症患者会接受腹部放疗^40,62,63。尽管现代放疗技术已能精确定位靶区，患者仍不可避免地使健康肠道组织受到照射，从而产生与本研究所述全身照射模型非常相似的病理生理变化。因此，本文描述的辐射模型有望用于研究患者和/或医务人员意外辐射暴露后的后果，对人类健康具有重要意义。

Bmi1-Cre^ER;Rosa26^eYFP.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL注射器	BD	309659	-
16G 可重复使用小型动物饲喂针：直头	VWR	20068-630	-
27G × 1/2" 针	BD	305109	-
28G × 1/2" Monoject 1 mL 胰岛素注射器	Covidien	1188128012	-
5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）	Santa Cruz Biotechnology	sc284628A	10 mg/mL，溶于无菌DMSO:水（1:4 v/v），分装后于-20℃保存°C
Azer Scientific 10% 中性缓冲福尔马林	Fisher Scientific	22-026-213	-
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J	杰克逊实验室	品系编号：006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J	杰克逊实验室	品系编号：010531
牛血清白蛋白第五组分，热激	Millipore-Sigma	3116956001
鸡抗GFP	鸟纲	GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 成像试剂盒，Invitrogen	赛默飞世尔科技	C10638	-
玉米油	Millipore-Sigma	C8267	-
脱扣室	Biocare Medical	DC2012	-
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher BioReagents	BP231-100	光敏感
无DNase蛋白酶K	Invitrogen	C10618H	在DPBS中按1:25稀释
驴抗鸡 AF647	Jackson ImmunoResearch	703-605-155
DPBS	Fisher Scientific	21-031-CV	-
伊红	Fisher Scientific	S176
荧光显微镜尼康Eclipse 90i，具备明场与荧光照明，配备物镜：10X、20X	尼康
Fluoromount 水性封片介质	Millipore-Sigma	F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor	Best Theratronics Ltd.	-	0.759 Gy min-1
山羊抗兔 AF488	Jackson ImmunoResearch	111-545-144
苏木精溶液，Gill 3号	Millipore-Sigma	GHS332
Thermo Scientific HM 325 旋转式切片机	Fisher Scientific	23-900-668
Hoechst 33258 五水合物（双苯并咪唑）	赛默飞世尔科技	H3569	稀释比例 1:1000
过氧化氢溶液，ACS级，29-32%，Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-603-252	-
原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素（Roche）	Millipore-Sigma	11684795910
Liquid Blocker Super PAP笔，迷你型	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
碳酸锂（粉末/ACS认证），Fisher Chemical	Fisher Scientific	L119-500	0.5 g/1 L dH2O
鲁尔锁式注射器 无菌 一次性使用 10 mL	VWR	89215-218	-
甲醇	VWR	BDH1135-4LP
Pharmco 产品 乙醇，200 证明	Fisher Scientific	NC1675398	-
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT 乙酸 ACS 级	Capitol Scientific	AAP-281000ACSCSLT	-
兔抗 Ki67	BioCare Medical	CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL 封片介质	Fisher Scientific	22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie 用于在 65 度烘烤载玻片	Fisher Scientific	50-728-103
二水合柠檬酸钠	Fisher Scientific	S279-500
不锈钢解剖工具套装	VWR	25640-002
Superfrost Plus 显微载玻片 [尺寸：25 x 75 x 1 mm]	VWR	48311-703
他莫昔芬	Millipore-Sigma	T5648	30 mg/mL，溶于无菌玉米油中，建议新鲜配制或于-20℃短期保存°C，光敏感
Tissue-Tek 24片载玻片架（带可拆卸手柄）	Sakura	4465
Tissue-Tek Accu-Edge 低剖面刀片	樱花	4689
Tissue-Tek 手动载玻片染色套装	樱花	4451
Tissue-Tek 染色皿，绿色带盖	樱花	4456
Tissue-Tek 染色皿，白色带盖	樱花	4457
Tween 20	Millipore-Sigma	P7949
Unisette 处理盒	VWR	87002-292	-
VWR 微型盖玻片	VWR	48393-081
二甲苯	Fisher Scientific	X5P-1GAL