需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用DNA组装技术构建腺病毒载体

1.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64033

⸱

2022年6月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 2Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, National Center for Children’s Health, 3Henan Chemical Technician College, 4Research Unit of Critical Infection in Childre, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Chinese Academy of Sciences Joint Research Center for Emerging Infectious Diseases and Biosafety, Chinese Center for Disease Control and Prevention-Wuhan Institute of Virology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究构建了人腺病毒7型（HAdV-7）的感染性克隆，并通过对该感染性克隆进行改造，建立了E3基因缺失的HAdV-7载体系统。该策略可推广应用于其他野生型腺病毒基因转移载体的构建。

摘要

腺病毒载体作为基因治疗中的基因转导工具已应用超过三十年。本文介绍一种利用DNA组装方法，通过操作野生型HAdV-7基因组DNA来构建腺病毒载体的实验方案。首先，通过DNA组装技术，将病毒基因组DNA与来自质粒骨架的PCR产物（包含卡那霉素抗性基因和复制起点，即Kan-Ori）融合，构建出HAdV-7的感染性克隆pKan-Ad7。该过程通过设计一对PCR引物实现：引物5'端包含约25个核苷酸的HAdV-7反向末端重复序列（ITR）末端序列，中间为对HAdV-7基因组无切割作用的限制性内切酶位点，3'端为用于PCR扩增的模板特异性序列。其次，采用基于中间质粒的策略，在感染性克隆中将E3区替换为外源基因表达元件，从而构建腺病毒载体。简言之，先用双切酶Hpa I消化pKan-Ad7，将含有E3区的片段通过Gibson组装与另一段质粒骨架的PCR产物连接，构建中间质粒pKan-Ad7HpaI。为方便描述，将“限制性酶切-组装”方法简称为restriction-assembly，指结合限制性酶切与DNA组装的质粒克隆技术。利用restriction-assembly方法，将pKan-Ad7HpaI中的E3基因替换为绿色荧光蛋白（GFP）表达盒，再将修饰后的E3区从中间质粒中释放并重新插入感染性克隆，获得腺病毒质粒pKAd7-E3GFP。最后，用Pme I酶切线性化pKAd7-E3GFP，并转染HEK293包装细胞，以拯救重组HAdV-7病毒。综上所述，本文介绍了一种基于DNA组装的策略，可在无需特殊材料和仪器的普通分子生物学实验室中构建腺病毒载体。

引言

在过去的三十年中，重组腺病毒载体因其优异的生物学特性，如高效的基因转导能力、不整合到宿主基因组、可操作的病毒基因组以及易于大规模生产，已被广泛应用于疫苗开发、基因治疗1,2,3,4 以及基础研究领域。

目前，最常用的腺病毒载体是基于人腺病毒5型（HAdV-5）构建的5,6。尽管HAdV-5载体介导的转导已取得令人鼓舞的结果，但临床前和临床应用中也暴露出若干缺点，例如人群中普遍存在针对该载体的预存免疫反应，以及在缺乏柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）的细胞中转导效率较低。为克服这些问题，研究人员对基于其他人源或哺乳动物腺病毒类型的载体构建产生了极大兴趣3,7,8。

迄今为止，构建腺病毒载体最常用的方法是在细菌中进行同源重组 5。这类细菌菌株必须表达重组酶，而这可能影响其所携带质粒的稳定性或扩增能力。有些菌株甚至无法商业化获取。近年来，基于其他原理的方法，包括细菌人工染色体、直接克隆或直接DNA组装，已被用于生成腺病毒的感染性克隆或重组腺病毒载体9,10,11,12。然而，这些方法对于在该领域经验较少的研究人员而言，操作上存在一定难度。

2018年，实验室通过吉布森组装（Gibson assembly）将病毒基因组与携带质粒骨架的PCR产物直接连接，从而简化了腺病毒感染性克隆的构建过程13。此后，限制性酶切与吉布森组装方法被结合使用，以将外源基因插入已有的腺病毒质粒中14,15,16,17,18。为方便起见，下文将限制性酶切与吉布森组装的结合方法统称为“限制-组装”（restriction-assembly）。随后进一步发展了利用限制-组装技术从感染性克隆构建腺病毒载体的策略19。限制-组装的核心思想是在DNA组装反应中尽可能多地使用从质粒上切割下来的片段，同时以较短的PCR产物作为连接子或修补片段用于质粒修饰，并尽可能减少反应中所含片段的数量。这些优化显著提升了实验效率：可最大限度地降低由PCR或DNA组装引起的非预期突变风险，同时提高实验成功率。综上所述，实验室已建立了一条从野生型腺病毒到腺病毒载体的完整构建流程13,14,15,16,17,18,19。

本文旨在通过构建HAdV-7感染性克隆及E3缺失的复制型HAdV-7载体的实例，介绍这些方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：腺病毒被归类为生物安全等级2级（BSL-2）；所有使用病毒的操作均在生物安全2级实验室中进行。野生型HAdV-7于2017年从一名因急性呼吸道感染住院的10月龄婴儿在北京儿童医院采集的鼻咽抽吸物标本中分离获得20。病毒储备液保存于-80 °C。

1. HAdV-7 基因组 DNA 的提取

  1. 在含有 5 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）并添加 10% 胎牛血清（FBS）的 T-25 培养瓶中接种 2.0 × 106 个 HEK293 细胞，于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中培养。细胞应在 18–24 小时内达到 80%–90% 汇合度，并准备用于感染。
  2. 用野生型 HAdV-7 感染细胞 2 小时。吸除含病毒的培养基，向细胞中加入 5 mL 含 2% FBS 的新鲜 DMEM。
  3. 采用改良的 Hirt 法提取病毒基因组 DNA21
    1. 感染后 2 至 3 天，当 50%–90% 的细胞出现细胞病变效应（CPE）时，弃去培养上清液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞一次。
      注：细胞病变效应（CPE）是指病毒感染细胞后出现细胞变圆、肿胀，并松散附着或从培养瓶脱落形成葡萄串样聚集体的现象22。
    2. 在冰上用 1.0 mL 裂解缓冲液（含 25 mM Tris-HCl、0.5 mM EDTA、50 µg/mL 蛋白酶 K 和 0.8% SDS，pH 7.6）裂解培养瓶中的细胞 5 分钟。将裂解液转移至 1.5 mL 微量离心管中，于 50 °C 水浴中孵育 30 分钟。
    3. 向管中加入 120 µL 沉淀缓冲液。轻轻混匀后，将管置于冰上静置 30 分钟。
      注：沉淀缓冲液由 3 M CsCl、1 M 醋酸钾和 0.67 M 乙酸组成。该缓冲液有助于在离心后沉淀细胞碎片和染色体 DNA，而病毒基因组则保留在上清液中。
    4. 在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 25 分钟，然后将上清液（约 1.1 mL）转移至 15 mL 聚丙烯管中。
    5. 向管中加入 2.2 mL 冰冷的无水乙醇。轻轻混匀后，将管置于冰上静置 15 分钟。在室温下以 2000 × g 离心 5 分钟。
    6. 小心吸除上清液，用 800 µL 70% 乙醇洗涤沉淀物（病毒基因组 DNA）一次。在室温下以 15,000 × g 离心 6 分钟。弃去上清液，将管底的 DNA 沉淀在空气中干燥。注意不要过度干燥 DNA 沉淀，以免难以重新溶解。
    7. 将沉淀溶解于 200 µL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1 mM EDTA）中，加入 1 µL RNase A（10 mg/mL），于 37 °C 孵育 15 分钟。使用市售的基因组 DNA 纯化浓缩试剂盒对溶解的 DNA 进行纯化（见材料表）。
      ​注：使用实验室常用方法对病毒基因组 DNA 进行定量。通常，在感染腺病毒的 T-25 培养瓶 HEK293 细胞中可获得 1–5 µg 基因组 DNA。

2. 通过DNA组装构建HAdV-7感染性克隆

  1. 设计PCR引物以扩增质粒骨架（图1）。在PCR引物的5'端添加DNA组装所需的重叠序列。此外，在HAdV-7基因组两端加入非切割型限制性酶切位点（例如Pme I位点），以利于从感染性克隆中释放病毒基因组。
    注意：通过PCR扩增含有抗生素抗性基因和复制起始位点的质粒骨架，并将其与HAdV-7基因组合并。当使用线性化的病毒基因组而非环状腺病毒质粒时，可在包装细胞中更高效地拯救出腺病毒。在综合考虑上述因素后，引物设计如下所示 图1.
  2. 使用 pShuttle-CMV 为模板，以引物 Ad7KanF1 和 Ad7KanR1 进行 PCR，扩增包含卡那霉素抗性基因（Kan）和 pBR322 复制起点（Ori）的片段（Kan-Ori）表 S1设定PCR反应程序如下：98 °C预变性30 s，随后进行5个循环的变性（98 °C，8 s）、退火（68 °C，30 s）和延伸（72 °C，90 s），最后进行25个循环的变性（98 °C，8 s）以及退火与延伸（72 °C，2 min）。
  3. 将PCR产物通过电泳在1%琼脂糖凝胶中进行分离，并使用商品化的DNA凝胶回收试剂盒纯化目的片段。
  4. 将回收的Kan-Ori和HAdV-7病毒基因组DNA加入商品化的DNA组装主混合液中。总体积为20 µL，载体与病毒基因组DNA的摩尔比为1:2，设置组装反应体系。在50 °C孵育1小时。
    注意：在总体积为 20 µL 的反应体系中进行，包含 1–3 µL 载体、7–9 µL 病毒基因组 DNA 和 10 µL DNA 组装主混合液。
  5. 转化感受态细胞 E. coli 使用10 µL连接产物通过热激法转化TOP10细胞。将转化混合物涂布于含卡那霉素（50 µg/mL）的Luria-Bertani（LB-Kan）平板上。37 °C培养至少12小时。
  6. 在37 °C、200–250 rpm轻度振荡条件下，将至少三个克隆分别接种于5 mL LB-Kan培养基中培养12 h。使用商品化的质粒小提试剂盒提取质粒DNA。
  7. 使用限制性内切酶消化质粒，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的大小（图2A此外，通过测序确认融合位点。正确的组装质粒命名为 pKan-Ad7。
  8. 从正确的克隆中培养100 mL细菌培养物。使用商品化的质粒大提试剂盒（Plasmid Maxprep Kit）提取质粒。

3. 计算机模拟 中间质粒的构建与修饰

注意：通常应先构建一个中间质粒，而如何构建一个理想的中间质粒是关键步骤。质粒设计需要使用带有限制性内切酶分析模块的DNA分析软件，例如pDRAW32（一款免费软件，可从 www.acaclone.com获取）。

  1. 将 pKan-Ad7 的 DNA 序列导入 pDRAW32 以绘制质粒图谱。在图谱上标注感兴趣的区域。对于 pKan-Ad7，标注了 E1、E3 区域以及质粒骨架（Kan-Ori）。
  2. 运行 pDRAW32 程序。首先点击 设置 > 酶切位点选择，然后点击 最小/最大切割数。在“最小”框中输入 1，在“最大”框中输入 2，并勾选“在整个序列中”前的复选框。最后点击 确定，以在图谱上显示唯一的和双切位点的限制性内切酶位点。
    注意：通常仅选择识别序列长度为 6 bp 或更长的限制性内切酶。如图 3A所示，共有 17 种酶符合该筛选条件。
  3. 考虑位于 E3 区域两侧的第一个限制性酶切位点，因为计划对 E3 区域进行修饰。Hpa I、Sal I、Avr II-Mlu I 和 Spe I 均满足该要求。
    注意：在本实验中选择 Hpa I，因为用该酶消化 pKan-Ad7 可产生携带 E3 区域的最短片段，较小的中间质粒将更有利于后续修饰。选择 Sal I 位点也有其优势——此类中间质粒适用于同时对 E1 和 E3 区域进行修饰（图 S1）。
  4. 创建一个最终序列文件，显示中间质粒 pKan-Ad7HpaI 的双链 DNA 序列。该虚拟序列可作为设计重叠引物的模板。
    1. 复制两个 Hpa I 限制性酶切位点之间包含 E3 区域的序列。为便于后续组装，需在 Hpa I 酶切位点外侧各复制约 20 bp 的序列（Tm 值大于或等于 48°C）（图 3C，overlap-Final 1 和 overlap-Final2）。
    2. 在上述序列的两端添加 Pme I 的识别序列（图 3C，gtttaaac）。
    3. 在 Pme I 酶切位点外侧添加含有抗生素抗性基因和复制起点的质粒骨架序列（图 3C，Kan-Ori）。
    4. 将最终序列导入 pDRAW32 以绘制质粒图谱。在图谱上标注 E3 区域。
    5. 运行 pDRAW32 程序。首先点击 设置 > 酶切位点选择，然后点击 最小/最大切割数。在“最小”和“最大”框中均输入 1，并勾选“在整个序列中”前的复选框。最后点击 确定，以在图谱上显示唯一的限制性内切酶位点。可以看出，有多种唯一酶切位点可用于 E3 区域的修饰。
      注意：在本实验中选择 BstZ17 I 和 Mlu I 用于部分 E3 区域的替换。双酶切组合也可能有用。例如，可选择双切酶 Ssp I 与唯一酶切位点 BssH II 联合使用，通过重叠延伸 PCR 替换整个 E3 区域。
  5. 以该虚拟序列为模板设计引物，用于构建中间质粒（图 3C）。
    注意：为了缩短每条引物的长度，共设计了四条引物。使用引物 Ad7HpaIF1 和 Ad7HpaIR1 扩增得到的 PCR 产物将作为模板，进一步使用引物 Ad7HpaIF2 和 Ad7HpaIR2 扩增获得最终的 PCR 片段（图 3C）。

4. 在 HEK293 细胞中拯救感染性重组腺病毒

注意：本文中构建的三种腺病毒均按照以下方案进行拯救。

  1. 用 2 µL Pme I 在 37 °C 条件下消化 10 µg 重组腺病毒质粒，总体积为 100 µL，反应 5 小时，以线性化质粒。取 1 µL 消化后的 DNA 在 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测。消化应产生一条约 34 kb 的腺病毒基因组片段和一条约 2.5 kb 的质粒骨架（Kan-Ori）。
  2. 使用基因组DNA清洁与浓缩试剂盒纯化残留的线性化腺病毒质粒。
  3. 在DMEM加10% FBS中培养HEK293细胞。接种HEK293细胞（2 × 10⁵）6 在转染前一天，将细胞接种于T-25培养瓶中，使其在次日达到70%–80%汇合度。使用5 µg经Pme I酶切的腺病毒质粒，按照商品化转染试剂的操作说明转染HEK293细胞。
    注意：转染细胞的培养基应每3天更换一次。
  4. 每天观察细胞，当出现彗星样焦点时，收集细胞及培养基至15 mL聚丙烯管中图2B，表明病毒复制。
  5. 裂解细胞 通过 三次冻融循环。在 1200 x g 条件下离心 12 分钟后 g 在室温下收集上清液，并于 -80 °C 保存，用于后续病毒扩增。
    ​注意：当重组腺病毒表达GFP或其他荧光蛋白时，由于可在荧光显微镜下直观观察到由荧光蛋白阳性细胞形成的病灶，因此更容易判断病毒是否成功拯救。

5. 构建E3缺失的HAdV-7基因组质粒

注意：HAdV-7 基因组长度为 35,239 bp，E3 区位于基因组的 27,354 bp 至 31,057 bp 之间。为构建中间质粒，需寻找在感染性克隆质粒上具有两个切割位点的内切酶，或两种在质粒上各有一个切割位点的内切酶。可选用的酶包括 Hpa I、Sal I，或 Avr II 与 Mlu I。需将 BstZ17 I（28,312 bp）与 Mlu I（30,757 bp）之间的序列删除，并替换为 CMV-GFP-PA 盒或 CMV-mCherry-PA 盒。

  1. 用 Hpa I 酶切 600 ng pKan-Ad7。通过琼脂糖凝胶电泳后，使用 DNA 凝胶回收试剂盒分别纯化大片段 pKAd7-HpaI-FL（约 30 kb）和小片段 pKAd7-HpaI-FS（约 7 kb）。将 pKAd7-HpaI-FL 储存于 -20 °C。
  2. 以 pShuttle-CMV 为模板，使用引物 Ad7HpaIF1 和 Ad7HpaIR1（表 S1）通过 PCR 扩增包含 Kan 和 Ori 的片段。回收 PCR 产物（2541 bp）并稀释，作为第二轮 PCR 的模板，使用引物 Ad7HpaIF2 和 Ad7HpaIR2 扩增 Kan-Ori2。
    1. 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化 PCR 产物（2584 bp）。设置 PCR 反应程序如下：98 °C 预变性 30 s，随后进行 30 个循环，每个循环包括 98 °C 变性 8 s，72 °C 退火与延伸 2 min。
      注：Kan-Ori2 的中间部分为包含 Kan 和 Ori 的片段，其后接一段在小片段 pKAd7-HpaI-FS 中不存在的独特限制性内切酶识别序列（例如 Pme I），以及与大片段 pKAd7-HpaI-FL 的同源重组区域；最外侧序列为与小片段 pKAd7-HpaI-FS 同源的区域。
  3. 将第 5.1 步中回收的 pKAd7-HpaI-FS 与 PCR 产物 Kan-Ori2 加入 DNA 组装主混合液中，50 °C 孵育 1 小时。随后执行步骤 2.4–2.6。正确构建的质粒命名为 pKan-Ad7HpaI（约 10 kb）。
  4. 以 pShuttle-GFP23 为模板，使用引物 Ad7E3GFPF1 和 Ad7E3GFPR1（表 S1）通过 PCR 扩增包含 CMV 启动子、GFP 编码序列（CDS）和 SV40 多聚腺苷酸信号（PA）的 CMV-GFP-PA 片段（约 1.7 kb）。通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化 PCR 产物（1650 bp）。
    注：引物中应包含可与经 BstZ17 I 和 Mlu I 酶切的 pKan-Ad7HpaI 进行组装的同源区域，并引入一个在质粒 pKan-Ad7 中不存在的独特限制性酶切位点（例如 Sbf I），以便后续进行限制性酶切-组装。
  5. 用 BstZ17 I 和 Mlu I 酶切 300 ng pKan-Ad7HpaI。通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化 7.3 kb 的片段（大部分 E3 区域被删除）。将回收的 7.3 kb 片段与回收的 CMV-GFP-PA 片段（约 1.6 kb）加入 DNA 组装主混合液中。执行步骤 2.4–2.6。正确构建的质粒命名为 pKAd7-E3GFP（约 9 kb）。
    注：BstZ17 I 与 Mlu I 之间的所有序列均属于 E3 区域。
  6. 用 Pme I 酶切 300 ng pKAd7-HE3GFP。通过凝胶电泳后使用 DNA 凝胶回收试剂盒纯化大片段（约 6.4 kb）。将纯化的片段与第 5.1 步中回收的 pKAd7-HpaI-FL 加入 DNA 组装主混合液中，50 °C 孵育 1 小时。执行步骤 2.4–2.6。 正确构建的质粒命名为 pKAd7-E3GFP。
  7. 按照第 3 节所述方法，将经 Pme I 线性化的 pKAd7-E3GFP 转染至 HEK293 细胞。所拯救的腺病毒命名为 Ad7-E3GFP。
  8. 以 pKFAV4-CX19A 为模板，使用引物 Ad7E3CHEF1 和 Ad7E3CHER1，通过 PCR 扩增包含 CMV 启动子、mCherry 编码序列（CDS）和 SV40 多聚腺苷酸信号的 CMV-mCherry-PA 片段（约 1.6 kb）。通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化 PCR 产物。
  9. 用 Sbf I 酶切 600 ng pKAd7-E3GFP，纯化约 35 kb 的片段。将 35 kb 片段与回收的 CMV-mCherry-PA 片段加入 DNA 组装主混合液中，50 °C 孵育 1 小时。执行步骤 2.4–2.6。 正确构建的质粒命名为 pKAd7-E3CHE。
  10. 按照第 3 节所述方法，将经 Pme I 线性化的 pKAd7-E3CHE 转染至 HEK293 细胞。所拯救的腺病毒命名为 Ad7-E3CHE。

6. 在 HEK293 细胞中扩增和纯化重组腺病毒

  1. 在八个直径为150 mm的TC处理培养皿中，接种已生长至80%-90%汇合度的HEK293细胞单层，并加入腺病毒。在37 °C下轻度振荡培养2小时，然后将上清液更换为25 mL含2% FBS的DMEM。
  2. 将细胞在37 °C下继续培养2-3天。
    1. 当八个直径为150 mm的培养皿中大多数细胞出现细胞病变效应（CPE）时，弃去大部分上清液。使用细胞刮刀收集感染细胞，最终将细胞悬液以约6.0 mL体积转移至15 mL聚丙烯管中。
    2. 通过三次冻融循环裂解细胞以释放病毒。在室温下以1200 × g离心12分钟，澄清裂解液。收集含有病毒的上清液。
  3. 向上清液中加入MgCl2（0.1 mM）和苯甲酸核酸酶（benzonase nuclease，50 U/mL），在37 °C下轻轻涡旋振荡40分钟。再向上清液中加入NaCl（600 mM），并在37 °C下继续轻轻涡旋振荡40分钟。在室温下以1200 × g离心12分钟，收集含病毒的上清液用于纯化。
  4. 用10 mM Tris-HCl配制不同浓度的氯化铯（CsCl）溶液，分别为1.35 g/mL、1.30 g/mL和1.25 g/mL。
    1. 使用移液器将0.8 mL 1.35 g/mL的CsCl溶液加入5.1 mL Ultra-Clear离心管底部，然后依次缓慢加入0.8 mL 1.30 g/mL的CsCl溶液和0.8 mL 1.25 g/mL的CsCl溶液，使其分层。
    2. 最后，小心地将约2.5 mL来自步骤6.3收集的上清液覆盖在1.25 g/mL CsCl溶液上方，并用10 mM Tris-HCl缓冲液加满至距离管口2-3 mm处。
  5. 在摆动桶转子中，以200,000 × g、8 °C离心2小时，加减速过程需缓慢，以分离完整病毒颗粒与缺陷病毒颗粒。
    注：离心后可在CsCl梯度中清晰观察到数条白色条带。
  6. 使用移液器小心移除空颗粒带和细胞碎片层，用2 mL注射器收集最下方含有成熟病毒的条带。
  7. 将收集的病毒悬液转移至20 K MWCO透析盒中，在含10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM MgCl2和2%甘油（pH 8.0）的透析缓冲液中，于4 °C透析过夜。
    1. 次日更换为含10 mM Tris-Cl、150 mM NaCl、1 mM MgCl2和5%甘油（pH 8.0）的新鲜透析缓冲液，继续在4 °C透析5小时。
    2. 使用2 mL注射器收集透析后的病毒颗粒。分装成多个所需小体积（20-200 µL）的等份样品，并将纯化后的病毒储存于-80 °C。
      ​注：可通过测定基因组DNA含量确定纯化病毒的颗粒滴度，通过有限稀释法在HEK293细胞上计数GFP阳性细胞来测定感染性滴度。

7. 通过限制性酶切鉴定重组腺病毒基因组

  1. 用重组腺病毒感染在T-25培养瓶中生长至80%-90%汇合度的HEK293细胞单层，于37 °C孵育2小时。随后更换为含2% FBS的新鲜DMEM培养基。
  2. 当细胞病变效应（CPE）在2-3天内出现时，收集培养上清液，并按照步骤1.3中所述的改良Hirt法提取病毒基因组DNA。
  3. 用指定的酶消化重组腺病毒的基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。以重组腺病毒质粒作为对照。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

人腺病毒7型（HAdV-7）感染性克隆构建策略如图1和图2所示。随机选取两个感染性克隆质粒，分别用BstZ17 I、BamH I和EcoR V进行鉴定。结果显示，酶切片段大小与预期一致（图2A），表明质粒构建正确。将Pme I线性化的质粒转染HEK293细胞后12天，可在细胞中观察到彗星样病灶（图2B），表明病毒成功拯救。

在本研究中，构建了E3基因缺失的腺病毒载体，以过表达GFP（图4）或mCherry作为示例。在对E3区域进行改造时，首先构建了中间质粒pKan-Ad7HpaI（图3）。选取三个菌落的质粒进行EcoR V和Hind III酶切分析，电泳结果显示所有质粒均正确构建（图5A...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

不同的腺病毒具有不同的组织嗜性，且人体内针对不同腺病毒的预存免疫反应的发生率可能存在显著波动24，这促使人们关注开发新型腺病毒载体用于基因治疗或疫苗研制。然而，对于一般的分子生物学实验室而言，建立一种新的腺病毒载体系统仍然十分繁琐。

本文介绍了一种利用限制性酶切和吉布森组装技术从野生型腺病毒中构建载体的实验方案13,14,15,16,17,18,19。总体而言，该过程可分为三个步骤。首先，将质粒骨架的PCR产物与腺病毒基因组DNA混合，通过吉布森组装构建出具有感染性的DNA克...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由北京市自然科学基金（7204258）、国家自然科学基金（82161138001，82072266）、中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2019-I2M-5-026）以及北京市卫生健康委首都卫生发展科研专项“北京市重要呼吸道病原体分子溯源研究与应用”（2021-1G-3012）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 聚丙烯微量离心管AxygenMCT-150-C病毒储存
15 mL 聚丙烯离心管Corning430790病毒储存
150 mm 组织培养处理培养皿Corning430599HEK293E 细胞培养
20 K MWCO 透析盒ThermoFisher Scientific66005病毒透析
乙酸Amresco714DNA 提取
Afl IINEBR0520酶切
琼脂糖Takara5260电泳
Age INEBR0552酶切
Asc INEBR0558酶切
BamH INEBR0136酶切
苯并酶核酸酶SigmaE8263-25KU病毒纯化
BsrG INEBR0575酶切
细胞刮刀Corning3008刮取细胞 
CsClSigmaC3032病毒纯化
DNA 凝胶回收试剂盒ZymoD4045DNA 回收
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 细胞培养基
大肠杆菌 TOP10 感受态细胞TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104连接产物转化
EcoR VNEBR3195酶切
EDTAThermo Fisher ScientificR3104DNA 提取
胎牛血清 (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 细胞培养
基因组 DNA 清洁与浓缩试剂盒ZymoD4065DNA 纯化
甘油上海麦克林生化科技有限公司G810575病毒透析
HEK293 细胞ATCCCRL-1573病毒扩增
高保真 DNA 聚合酶NEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104酶切
硫酸卡那霉素Amresco408质粒筛选
Kpn INEBR3142酶切
λ/HindIII DNA 标准分子量标记Takara3403电泳
LB 肉汤BD240230细菌 LB 平板制备
LB 培养基Solarbio Life ScienceL1010细菌培养基
MgCl₂Sigma63068病毒透析
微量离心机Thermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RDNA 提取
NaClSigmaS5886病毒透析
Nde INEBR0111酶切
NEBuilder HiFi DNA 组装预混液NEBE2621DNA 组装
Nhe INEBR0131酶切
磷酸盐缓冲液CytivaSH30256.01细胞洗涤
移液器Thermo Fisher ScientificMatrix吸取培养基
质粒大提试剂盒北京维基生物科技有限公司N001DNA 提取
质粒小提试剂盒天根生化科技（北京）有限公司DP103DNA 提取
Pme INEBR0560酶切
乙酸钾Amresco698DNA 提取
蛋白酶 KThermo Fisher ScientificAM2542DNA 提取
pShuttle-CMVStratagene240007PCR 模板
RNaseBeyotimeD7089DNA 提取
Sal INEBR0138酶切
Sbf INEBR3642酶切
SDSAmresco227DNA 提取
摆动转子HITACHIS52ST病毒纯化
T-25 细胞培养瓶Corning430639HEK293E 细胞培养
T-75 细胞培养瓶Corning430641HEK293E 细胞培养
转染试剂Polyplus-transfection114-15转染
透射电子显微镜FEITECNAI 12病毒观察
Tris-HClAmresco234病毒透析
超速离心机HITACHIHimac CS120GXII病毒纯化

参考文献

  1. Lasaro, M. O., Ertl, H. C. New insights on adenovirus as vaccine vectors. Molecular Therapy. 17 (8), 1333-1339 (2009).
  2. Fuchs, J. D., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 35-Vectored HIV-1 vaccine in adenovirus serotype 5 seronegative and seropositive individuals. Journal of AIDS & Clinical Research. 6 (5), (2015).
  3. Milligan, I. D., et al. Safety and immunogenicity of novel adenovirus type 26- and modified vaccinia ankara-vectored ebola vaccines: a randomized clinical trial. JAMA. 315 (15), 1610-1623 (2016).
  4. Zhu, F. C., et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 395 (10240), 1845-1854 (2020).
  5. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  6. Danthinne, X., Imperiale, M. J. Production of first generation adenovirus vectors: a review. Gene Therapy. 7 (20), 1707-1714 (2000).
  7. Guo, X., et al. Systemic and mucosal immunity in mice elicited by a single immunization with human adenovirus type 5 or 41 vector-based vaccines carrying the spike protein of Middle East respiratory syndrome coronavirus. Immunology. 145 (4), 476-484 (2015).
  8. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  9. Jang, Y., Bunz, F. AdenoBuilder: A platform for the modular assembly of recombinant adenoviruses. STAR Protocols. 3 (1), 101123(2022).
  10. Zhou, X., Sena-Esteves, M., Gao, G. Construction of recombinant adenovirus genomes by direct cloning. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (5), (2019).
  11. Ruzsics, Z., Lemnitzer, F., Thirion, C. Engineering adenovirus genome by bacterial artificial chromosome (BAC) technology. Methods in Molecular Biology. 1089, 143-158 (2014).
  12. Zhou, D., et al. An efficient method of directly cloning chimpanzee adenovirus as a vaccine vector. Nature Protocols. 5 (11), 1775-1785 (2010).
  13. Zou, X. H., et al. DNA assembly technique simplifies the construction of infectious clone of fowl adenovirus. Journal of Virological Methods. 257, 85-92 (2018).
  14. Guo, X., et al. Site-directed modification of adenoviral vector with combined DNA assembly and restriction-ligation cloning. Journal of Biotechnology. 307, 193-201 (2020).
  15. Liu, H., et al. Single plasmid-based, upgradable, and backward-compatible adenoviral vector systems. Human Gene Therapy. 30 (6), 777-791 (2019).
  16. Yan, B., et al. User-friendly reverse genetics system for modification of the right end of fowl adenovirus 4 genome. Viruses. 12 (3), 301(2020).
  17. Zhang, W., et al. Fiber modifications enable fowl adenovirus 4 vectors to transduce human cells. Journal of Gene Medicine. 23 (10), 3368(2021).
  18. Zou, X., et al. Fiber1, but not fiber2, is the essential fiber gene for fowl adenovirus 4 (FAdV-4). Journal of General Virology. 102 (3), 001559(2021).
  19. Guo, X., et al. Restriction-assembly: a solution to construct novel adenovirus vector. Viruses. 14 (3), 546(2022).
  20. Duan, Y., et al. Genetic analysis of human adenovirus type 7 strains circulating in different parts of China. Virologica Sinica. 36 (3), 382-392 (2021).
  21. Arad, U. Modified Hirt procedure for rapid purification of extrachromosomal DNA from mammalian cells. Biotechniques. 24 (5), 760-762 (1998).
  22. Knipe, D. M. H. P. M. Fields' Virology. 2, 1733(2013).
  23. Liu, H. Y., Han, B. J., Zhong, Y. X., Lu, Z. Z. A three-plasmid system for construction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 162 (1-2), 8-13 (2009).
  24. Mennechet, F. J. D., et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence. Expert Review of Vaccines. 18 (6), 597-613 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

HAdV 7 PCR Gibson HEK293

本文已发表

视频即将推出

联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。