利用DNA组装技术构建腺病毒载体

摘要

本研究构建了人腺病毒7型（HAdV-7）的感染性克隆，并通过对该感染性克隆进行改造，建立了E3基因缺失的HAdV-7载体系统。该策略可推广应用于其他野生型腺病毒基因转移载体的构建。

摘要

腺病毒载体作为基因治疗中的基因转导工具已应用超过三十年。本文介绍一种利用DNA组装方法，通过操作野生型HAdV-7基因组DNA来构建腺病毒载体的实验方案。首先，通过DNA组装技术，将病毒基因组DNA与来自质粒骨架的PCR产物（包含卡那霉素抗性基因和复制起点，即Kan-Ori）融合，构建出HAdV-7的感染性克隆pKan-Ad7。该过程通过设计一对PCR引物实现：引物5'端包含约25个核苷酸的HAdV-7反向末端重复序列（ITR）末端序列，中间为对HAdV-7基因组无切割作用的限制性内切酶位点，3'端为用于PCR扩增的模板特异性序列。其次，采用基于中间质粒的策略，在感染性克隆中将E3区替换为外源基因表达元件，从而构建腺病毒载体。简言之，先用双切酶Hpa I消化pKan-Ad7，将含有E3区的片段通过Gibson组装与另一段质粒骨架的PCR产物连接，构建中间质粒pKan-Ad7HpaI。为方便描述，将“限制性酶切-组装”方法简称为restriction-assembly，指结合限制性酶切与DNA组装的质粒克隆技术。利用restriction-assembly方法，将pKan-Ad7HpaI中的E3基因替换为绿色荧光蛋白（GFP）表达盒，再将修饰后的E3区从中间质粒中释放并重新插入感染性克隆，获得腺病毒质粒pKAd7-E3GFP。最后，用Pme I酶切线性化pKAd7-E3GFP，并转染HEK293包装细胞，以拯救重组HAdV-7病毒。综上所述，本文介绍了一种基于DNA组装的策略，可在无需特殊材料和仪器的普通分子生物学实验室中构建腺病毒载体。

引言

在过去的三十年中，重组腺病毒载体因其优异的生物学特性，如高效的基因转导能力、不整合到宿主基因组、可操作的病毒基因组以及易于大规模生产，已被广泛应用于疫苗开发、基因治疗^1,2,3,4 以及基础研究领域。

目前，最常用的腺病毒载体是基于人腺病毒5型（HAdV-5）构建的^5,6。尽管HAdV-5载体介导的转导已取得令人鼓舞的结果，但临床前和临床应用中也暴露出若干缺点，例如人群中普遍存在针对该载体的预存免疫反应，以及在缺乏柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）的细胞中转导效率较低。为克服这些问题，研究人员对基于其他人源或哺乳动物腺病毒类型的载体构建产生了极大兴趣^3,7,8。

迄今为止，构建腺病毒载体最常用的方法是在细菌中进行同源重组 

方案

注意：腺病毒被归类为生物安全等级2级（BSL-2）；所有使用病毒的操作均在生物安全2级实验室中进行。野生型HAdV-7于2017年从一名因急性呼吸道感染住院的10月龄婴儿在北京儿童医院采集的鼻咽抽吸物标本中分离获得²⁰。病毒储备液保存于-80 °C。

1. HAdV-7 基因组 DNA 的提取

1. 在含有 5 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）并添加 10% 胎牛血清（FBS）的 T-25 培养瓶中接种 2.0 × 10⁶ 个 HEK293 细胞，于 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中培养。细胞应在 18–24 小时内达到 80%–90% 汇合度，并准备用于感染。
2. 用野生型 HAdV-7 感染细胞 2 小时。吸除含病毒的培养基，向细胞中加入 5 mL 含 2% FBS 的新鲜 DMEM。
3. 采用改良的 Hirt 法提取病毒基因组 DNA²¹
   1. 感染后 2 至 3 天，当 50%–90% 的细胞出现细胞病变效应（CPE）时，弃去培养上清液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞一次。
      注：细胞病变效应（CPE）是指病毒感染细胞后出现细胞变圆、肿胀，并松散附着或从培养瓶脱落形成葡萄串样聚....

结果

人腺病毒7型（HAdV-7）感染性克隆构建策略如图1和图2所示。随机选取两个感染性克隆质粒，分别用BstZ17 I、BamH I和EcoR V进行鉴定。结果显示，酶切片段大小与预期一致（图2A），表明质粒构建正确。将Pme I线性化的质粒转染HEK293细胞后12天，可在细胞中观察到彗星样病灶（图2B），表明病毒成功拯救。

在本研究中，构建了E3基因缺失的腺病毒载体，以过表达GFP（图4）或mCherry作为示例。在对E3区域进行改造时，首先构建了中间质粒pKan-Ad7HpaI（图3）。选取三个菌落的质粒进行EcoR V和Hind III酶切分析，电泳结果显示所有质粒均正确构建（图5A.......

讨论

不同的腺病毒具有不同的组织嗜性，且人体内针对不同腺病毒的预存免疫反应的发生率可能存在显著波动²⁴，这促使人们关注开发新型腺病毒载体用于基因治疗或疫苗研制。然而，对于一般的分子生物学实验室而言，建立一种新的腺病毒载体系统仍然十分繁琐。

本文介绍了一种利用限制性酶切和吉布森组装技术从野生型腺病毒中构建载体的实验方案^{13,14,15,16,17,18,19}。总体而言，该过程可分为三个步骤。首先，将质粒骨架的PCR产物与腺病毒基因组DNA混合，通过吉布森组装构建出具有感染性的DNA克.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 聚丙烯微量离心管	Axygen	MCT-150-C	病毒储存
15 mL 聚丙烯离心管	Corning	430790	病毒储存
150 mm 组织培养处理培养皿	Corning	430599	HEK293E 细胞培养
20 K MWCO 透析盒	ThermoFisher Scientific	66005	病毒透析
乙酸	Amresco	714	DNA 提取
Afl II	NEB	R0520	酶切
琼脂糖	Takara	5260	电泳
Age I	NEB	R0552	酶切
Asc I	NEB	R0558	酶切
BamH I	NEB	R0136	酶切
苯并酶核酸酶	Sigma	E8263-25KU	病毒纯化
BsrG I	NEB	R0575	酶切
细胞刮刀	Corning	3008	刮取细胞
CsCl	Sigma	C3032	病毒纯化
DNA 凝胶回收试剂盒	Zymo	D4045	DNA 回收
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)	Cytiva	SH30022.01	HEK293 细胞培养基
大肠杆菌 TOP10 感受态细胞	TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.	CB-104	连接产物转化
EcoR V	NEB	R3195	酶切
EDTA	Thermo Fisher Scientific	R3104	DNA 提取
胎牛血清 (FBS)	Cytiva	SV30208.02	HEK293 细胞培养
基因组 DNA 清洁与浓缩试剂盒	Zymo	D4065	DNA 纯化
甘油	上海麦克林生化科技有限公司	G810575	病毒透析
HEK293 细胞	ATCC	CRL-1573	病毒扩增
高保真 DNA 聚合酶	NEB	M0491	PCR
Hind III	NEB	R3104	酶切
硫酸卡那霉素	Amresco	408	质粒筛选
Kpn I	NEB	R3142	酶切
λ/HindIII DNA 标准分子量标记	Takara	3403	电泳
LB 肉汤	BD	240230	细菌 LB 平板制备
LB 培养基	Solarbio Life Science	L1010	细菌培养基
MgCl₂	Sigma	63068	病毒透析
微量离心机	Thermo Fisher Scientific	Sorvall Legend Micro 21R	DNA 提取
NaCl	Sigma	S5886	病毒透析
Nde I	NEB	R0111	酶切
NEBuilder HiFi DNA 组装预混液	NEB	E2621	DNA 组装
Nhe I	NEB	R0131	酶切
磷酸盐缓冲液	Cytiva	SH30256.01	细胞洗涤
移液器	Thermo Fisher Scientific	Matrix	吸取培养基
质粒大提试剂盒	北京维基生物科技有限公司	N001	DNA 提取
质粒小提试剂盒	天根生化科技（北京）有限公司	DP103	DNA 提取
Pme I	NEB	R0560	酶切
乙酸钾	Amresco	698	DNA 提取
蛋白酶 K	Thermo Fisher Scientific	AM2542	DNA 提取
pShuttle-CMV	Stratagene	240007	PCR 模板
RNase	Beyotime	D7089	DNA 提取
Sal I	NEB	R0138	酶切
Sbf I	NEB	R3642	酶切
SDS	Amresco	227	DNA 提取
摆动转子	HITACHI	S52ST	病毒纯化
T-25 细胞培养瓶	Corning	430639	HEK293E 细胞培养
T-75 细胞培养瓶	Corning	430641	HEK293E 细胞培养
转染试剂	Polyplus-transfection	114-15	转染
透射电子显微镜	FEI	TECNAI 12	病毒观察
Tris-HCl	Amresco	234	病毒透析
超速离心机	HITACHI	Himac CS120GXII	病毒纯化