使用多通道薄膜电极对小鼠视觉诱发电位的地形 EEG 记录

摘要

本方案描述了一种简单的程序，用于在小鼠中使用 32 个多通道薄膜电极获取和分析颅视觉诱发电位的地形。

摘要

视觉诱发电位 （VEP） 允许在临床前小鼠模型中表征视觉功能。有多种方法可以测量小鼠的 VEP，从无创 EEG、皮下单电极和 ECoG 到全侵入性皮层内多通道视觉皮层记录。在急性实验环境中进行局部皮层内微电极测量之前，获得视觉反应的整体地形 EEG 水平特征可能很有用。例如，一个用例是在研究其对局部皮层内水平的影响之前，评估耳聋模型中 VEP 地形的全局跨模态变化。多通道颅脑电图是获取这种皮层视觉活动概览测量的可靠方法。多通道颅脑电图通过标准化、一致的方法提供可比的结果，例如，识别皮层视觉功能的跨模式、病理或与年龄相关的变化。目前的研究提出了一种在麻醉小鼠中使用 32 通道薄膜 EEG 电极阵列获得闪光诱发 VEP 的地形分布的方法。结合时域和频域分析，该方法允许快速表征和筛选小鼠皮层视觉功能的地形和基本视觉特性，并且可以与各种急性实验设置相结合。

引言

小鼠是视力和眼科疾病退行性过程的临床前模型 1,2,3,4。视觉诱发电位 （VEP） 通常用于测量皮质视觉功能，例如，在病理模型中评估视觉退化 ^5,6。VEP 潜伏期、传导时间、振幅、多焦点特征或皮质视觉诱发电位的空间敏锐度提供有关视觉系统功能完整性的诊断信息 ^7,8,9。

在小鼠中，可以使用不同复杂程度的方法在各种空间尺度上测量皮质视觉诱发电位，从无创脑电图、皮下针状电极和颅骨植入螺钉，到皮质上层 ECoG 的全侵入性颅内入路，再到皮层内电极记录^{10、11、12、13、14、15、16、17}.这些方法具有不同的优点和缺点。例如，少量电极仅提供有关皮质 VEP 分布的有限信息，而皮下针状电极通常无法确保一致的记录位置。此外，植入螺钉或完全侵入性方法需要破坏、穿透或移除颅骨，并且通常仅提供局部信息。

在急性实验中，通常需要对皮层视觉功能进行初步全面概述，最终进行进一步的实验步骤，并与局部皮层内记录进行比较。例如，首先使用一个潜在的用例来研究耳聋或听力损失的视觉跨模态重组对 VEP 地形和皮层视觉活动^18,19 的脑电图水平影响，然后再研究对局部皮层内水平的影响。

带有薄膜多电极阵列的多通道脑电图记录可以提供小鼠颅骨的系统化 VEP 地形图^{20、21、22、23、24}。这种上颅记录比 ECoG 记录具有优势，因为它保持了颅骨的完整性并避免了对皮质表面的直接作。此外，薄膜多电极提供标准化电极配置，允许比较类似于人类标准化脑电图系统的实验之间的视觉诱发时空脑活动²⁵。标准化框架还有助于使用常见的脑电图分析工具箱（例如，Fieldtrip、Chronux、EEGLAB 和 ERPLAB）在时域和频域或连接性方面分析小鼠脑电图 26,27,28,29,30,31。

本方案描述了使用 32 通道薄膜电极对小鼠进行地形 VEP 记录的程序。这可以用作急性实验的一部分，然后是额外的实验步骤，例如来自特定大脑区域的皮层内微电极记录。这里演示了如何使用鼠标的 32 通道薄膜电极可靠地记录颅脑闪光诱发的 VEP。此外，还介绍了时域和频域中地形 VEP 记录的示例性分析。

方案

所有动物均按照德国 （TierSchG， BGBl. I S. 1206， 1313） 和欧盟 （ETS 123;指令 2010/63/EU） 动物研究指南。动物实验得到了德国国家当局（下萨克森州消费者保护和食品安全办公室，LAVES）的批准，并由大学动物福利官员进行监督。本研究使用一只 3 月龄雄性 C57BL/6J 小鼠。

1. 动物细节

1. 在小鼠中执行适合特定研究问题的 VEP 测量。
2. 注意小鼠生理学中的菌株特性，这些特性可以通过改变麻醉药敏感性、癫痫发作易感性、年龄或遗传背景来影响实验。
   注意:具有不同遗传背景的小鼠品系通常可能会出现其他感觉障碍（例如，C57BL/6 进行性听力损失），这些障碍可能被忽视但间接影响视觉处理（例如，跨模态影响¹⁹）。

2. 全身麻醉的诱导

1. 在记录部位准备手术区域。确定鼠标的术前重量。
2. 用氯胺酮/甲苯噻嗪腹腔注射麻醉，剂量为 100 mg/kg 氯胺酮盐酸盐、4 mg/kg 甲苯噻嗪盐酸盐和 5mg/kg 卡洛芬（见 材料表）。
3. 注射后，立即将鼠标放回笼子中。
4. 将红外加热灯（参见 材料表）放置在适当的距离，并等待全身麻醉完全诱导至少 5 分钟。
5. 观察自发运动的停止和扶正反射的丧失。检查脚趾捏反射是否消失。

3. 全身麻醉的生理监测和维持

1. 将鼠标转移到加热垫上的记录位置。
2. 使用连接到温度控制系统的直肠温度探头，将核心体温保持在 37.6-37.8 °C。
3. 确保鼠标的最佳体温。除了加热垫外，如果需要，还可以通过提高室温来最大限度地减少热量损失。
4. 将两个皮下银丝电极（直径 0.2 毫米，见 材料表）放在右肩和左后腿附近，用于心电图监测。
5. 将银线 ECG 电极连接到 ECG 放大器。
6. 实验期间在示波器上监测心率和心电图（参见 材料表）。
   注意:在氯胺酮/甲苯噻嗪充分麻醉期间，心率可在 160-250 bpm^32,33 之间。心率可能因小鼠品系、年龄和生理状态而异。
7. 检查脚趾捏反射和生命体征。没有脚趾捏反射反应表明麻醉水平足够。
8. 在手术过程中密切监测眼睛的状态和质量，并使用滴眼液或凝胶。
9. 通过定期检查生理参数、心率、反射和脑电图活动来监测足够的麻醉水平。
10. 如果全身麻醉水平变得太轻，请额外应用剂量的氯胺酮/甲苯噻嗪 （ip）。
11. 快速进行实验步骤，以尽量减少全身麻醉的持续时间和用于维持全身麻醉的额外氯胺酮/甲苯噻嗪的后续剂量。

4. 电极放置和记录设置

1. 在记录部位，通过检查脚趾捏反射重新评估足够的麻醉深度。
2. 用电动剃须刀剃掉头顶。
3. 为了允许自由视野，在实验过程中不要将小鼠固定在立体定向框架中。
4. 使用利多卡因（如果您当地的动物护理机构指南另有要求）。
5. 在头皮上做一个 1 厘米的中线切口。
6. 使用小血管夹将皮肤向两侧缩回，以将皮肤固定到位并露出颅骨。
7. 用棉签和生理盐水 NaCl （0.9%） 清洁颅骨表面。
8. 将用于脑电图的银丝参考电极（直径 0.2 毫米）皮下安装在鼻子上方（鼻子参考）或耳后（乳突）处。
9. 通过探头连接器将鼻子参考连接到头部tage（参见 材料表）参考输出。
10. 接下来，使用通过探针连接器连接到头部并连接到电极支架的适配器将 EEG 电极连接到头部tage（参见 材料表）。
11. 将多通道薄膜 EEG 电极（参见 材料表）放在颅骨上，以前囟作为参考位置，以确保每个实验的标准化电极位置。
12. 用一滴盐水调整电极的位置。当颅骨表面仍然潮湿时，电极很容易移动。然后，用棉签小心擦干头骨。
13. 等到盐水溶液干燥并且电极牢固地附着在颅骨上。
14. 用一小滴硅油覆盖电极，以避免电极粘附在覆盖的皮肤上。此步骤有助于在记录后轻松移除电极。
    注意:注意不要涂抹过多的硅油，以免电极与颅骨的接触恶化。
15. 将皮肤贴在电极上以保护并尽量减少电噪声。
16. 在皮肤上滴一小滴组织粘合剂（见 材料表）以防止皮肤切口重新打开。

5. 脑电图记录和 VEP 测量

1. 在采集过程中使用 1-9000 Hz 之间的宽滤波器过滤 EEG 信号。使用宽滤波器设置来控制伪影。稍后在脱机处理期间执行噪声和充分筛选。
2. 通过检查高频电噪声、50/60 Hz 伪影和 ECG 伪影，检查正在进行的 EEG 活动的信号质量。为动物和设备应用足够的接地和参考连接，或应用足够的屏蔽。
3. 通过观察脑电图活动来检查麻醉深度。尽量避免"太深"的麻醉状态，其特征是发生突发抑制 EEG 活动。考虑实验的时间过程，并确保麻醉在记录过程中不会变得太轻。
4. 使用 LED 频闪仪（或其他类型的视觉刺激）产生超短闪光（参见 材料表）（图 1）。
5. 将频闪仪放置在鼠标前方 30 厘米的距离处进行双眼视觉刺激。
   注意:在实验过程中，鼠标和频闪仪被放置在黑暗且隔音的房间里。
6. 刺激前让小鼠适应黑暗 5 分钟。
7. 通过使用 TTL 脉冲触发频闪仪来引发频闪仪闪烁。
   注意: 由于频闪仪的高电压，可能会出现刺激伪影。这可以通过增加距离或屏蔽电极来衰减。
8. 使用由刺激 PC 控制的多功能 I/O 设备（参见 材料表）生成硬件 TTL 触发器，以触发光源（即频闪仪）。
9. 将 TTL 信号并行发送到采集系统，为刺激开始提供高精度时间戳。
10. 从 LED 频闪仪发送与闪光灯同步的 TTL 输出作为反馈和第二个控制，以获得准确的刺激开始触发时间戳。将此记录与录制文件一起注册。
11. 设置刺激率（例如，刺激间隔 = 2 s）。设置刺激重复次数（例如，n = 150 次重复）
12. 在频闪仪上手动调整强度（例如，在固定值为 3000 lm 时，闪光持续时间为 512 μs）。
    注意:然而，这必须适应特定的实验问题。
13. 开始刺激演示，用记录软件记录脑电信号（参见 材料表），并将数据保存在记录 PC 上。

6. 实验完成、电极去除和电极清洁

1. 如果记录是较长协议的一部分，请继续执行进一步的实验步骤。
2. 在实验结束时，根据机构指南^23,34 对动物实施安乐死。
3. 小心地取下 EEG 电极（因为它们可以重复使用）。
4. 慢慢地应用液体，从颅骨中取出电极。
   注意:电极会粘在颅骨表面;避免在移除过程中损坏铂位点。
5. 实验后用等渗盐水 NaCl （0.9%） 清洁电极，并将其浸入蛋白质去除剂和消毒溶液（参见 材料表）中 30 分钟。
6. 将电极阵列存放在干燥、受保护的地方。

7. 基本的 VEP 信号处理:时域和频域

1. 将原始数据文件导入分析软件（参见 材料表）。
2. 使用 1-100 Hz 之间的巴特沃斯带通零相位滤波器过滤脑电图信号。
   注意:根据相应的研究问题 27,35,36 选择合适的过滤器类型和参数。
3. 将信号下采样到 1000 Hz。
4. 将脑电图信号分割成试验并平均试验以产生视觉诱发电位并确定 N1 峰值潜伏期。
   注意:如有必要，可以离线执行重新引用（例如，共同平均引用、双极引用、局部平均"拉普拉斯"引用）²³。
5. 使用分析软件确定特定感兴趣时间点的电压值并绘制电压分布图。
6. 通过计算所有电极通道的空间标准差来计算全局场功率³⁷ 。
7. 使用 Chronux Toolbox^28,31 计算多锥度时频频谱图。使用带宽乘积 TW = 3 和 K = 5 锥度，窗口大小为 300 ms，步长为 30 ms。

结果

用多通道 EEG 记录视觉诱发电位可以评估小鼠 VEP 振幅、潜伏期或频率分量的地形。 图 2A 显示了用 3 个月大雄性 C57BL/6J 小鼠的上颅 32 通道脑电图记录的闪光诱发 VEP 地形图的示例。最强的视觉诱发活动发生在视觉皮层上方的枕骨区域。

图 2B 显示了闪蒸前后不同时间点颅骨上的电压分布。VEP 最强的 N1 振幅发生在枕中央区域上方的刺激后 50 毫秒。随后在刺激后 300 毫秒，枕骨和额叶区域出现潜在逆转和正峰值。 图 1B 中的蝶形图显示了 VEP N1 分量在 46 毫秒时的峰值潜伏期，在发病后约 300 毫秒处出现正峰值。

图 2C 显示了从所有 EEG 通道^37,38

讨论

本文介绍了一种使用薄膜电极记录颅外多通道脑电图的方法，以及如何在小鼠中获得视觉诱发电位的一致地形表示。在这里，我们示例性地展示了双眼闪光刺激，但这种方法也可以应用于其他类型的视觉刺激（即单眼、空间光栅、局灶性视野），例如使用更大的显示器。

该方案中的一个关键步骤是电极的定位。必须确保精确和一致的电极定位，以实现实验之间的可比性。重要的是，需要记录电极位置以供以后比较（即作显微镜图像）。尽管可以使用不同类型的薄膜电极和配置（来自其他分销商），但建议决定一种定义的电极配置并坚持使用，以便在实验中具有反向可比性。第二个关键方面是电极与颅骨的良好接触。接触质量会影响电极阻抗和信号质量⁴⁰.因此，与所有电极位点的颅骨相似的接触很重要，尤其是对于分析空间响应分布。如果电极通道显示噪声信号（即高频分量），则必须确保与颅骨有足够的接触，并且必须在实验期间测试阻抗。但是，目前的 VEP 记录对于整体信号质量来说非常可靠。

如果研究...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bepanthen 5% 右泛醇	拜耳		Ophtamic gel
Cheetah 软件 5.11	Neuralnyx	5.11 神经	生理信号记录软件
数字 Lynx SX	Neuralynx	数字 Lynx 16SX	记录系统
心电图差分放大器	Otoconsult	WDA2 V1.0
电动剃须刀	Aesculap	GT420
电极支架	TSE 系统	430005-HE
检查灯	Heine	HL 5000	冷光源灯
加热垫 + 温度控制系统	CWE	TC-1000 小鼠
组织曲 0.5 mL	B.Braun		组织胶粘剂
红外加热灯	Sanitas	SIL 06
氯胺酮 10%	WDT		盐酸酮
LED 频闪仪	Monarch	Nova Strobe PBL	视觉刺激
Matlab 2021a	The Mathworks	2021a	刺激控制和分析
Moria 血管夹	Fine Science Tools	18320-11
小鼠脑电图电极	NeuroNexus	H32（网状）	32 通道脑电图电极。厚度：20 &μ;m;长度：8.6 毫米;宽 6.8 毫米。铂金站点：500 μm 直径
鼠标框架			要求提供定制信息
多功能I/O设备	National Instruments	PCIe-6353带BNC 2090A	模拟刺激产生、输出和触发
NaCl 0.9%	B.Braun		等渗、无菌、无热原的
Neuralynx HS36	Neuralynx	HS-36	Headstage
Neuronexus 探头连接器	Neuralynx	ADPT-HS36-N2T-32A	电极连接器
示波器	Tektronix	TDS 2014B
Progent 强效清洁剂	Menicon		用于硬性透气镜片的蛋白质去除剂和消毒溶液
记录 PC	HP	HP Z800	录音机
Rimadyl （卡洛芬）	Zoetis		卡洛芬
硅油 M 1000	Carl Roth	4045.1
银线	科学产品	AG-8W	直径 203 &m;心电图和参考电极
隔音室	IAC 声学
立体定向显微作器	TSE Systems	430005-M/P	用于脑电图电极放置
刺激电脑	戴尔	Dell Precision T5810	刺激电脑
手术显微镜	蔡司	Op-Mi 聚焦
手术胶带	3M	1527-0	1.25 厘米 x 9.1 米
Thilo-Tears 3 mg/g	Alcon Pharma GmbH		眼凝胶
Vaselin Lichtenstein	Winthrop		White vaselin 软膏
甲苯噻嗪 2%	Bernburg		盐酸甲苯噻
嗪 赛洛卡因喷雾剂 （10 mg/puff）	阿斯彭		利多卡因