该方案描述了一种逐步建立的详细方法 离体 感染的绵羊皮肤伤口模型 金黄色葡萄球菌该高通量模型能更真实地模拟感染过程 体内 与传统微生物学技术相比，为研究人员提供了一个具有生理相关性的平台，用于评估新型抗菌药物的有效性。
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本文内容
摘要
摘要
抗菌药物的研发是一个成本高昂且成功率日益降低的过程，这使得进一步投资于抗菌药物发现研究的吸引力下降。如果能够在研究人员对药物设计和制剂具有更大控制权的先导化合物优化阶段实施“快速失败、低成本失败”的策略，则可使抗菌药物的发现及后续商业化变得更加有利可图。本文介绍了一种简单、经济、高通量且可重复的ex vivo绵羊创伤皮肤感染Staphylococcus aureus 模型的建立方法。该模型中细菌的生理状态模拟了实际感染过程，其增殖依赖于病原体对组织的损伤能力。通过检测到可存活细菌数量相较于接种量显著增加，可确认伤口感染的成功建立。该模型可作为在先导优化阶段评估新型抗菌药物有效性的平台。可以认为，该模型的可用性将为抗菌药物研发人员提供一种“快速失败、低成本失败”的研究工具，有助于提高后续动物实验的成功率。此外，该模型还将促进动物实验使用的减少与优化，并最终推动针对皮肤及软组织感染的新型抗菌药物更快、更经济地向临床转化。
引言
皮肤感染是一个重要的全球性问题，给世界各地的医疗保健机构带来了巨大的经济负担。病原体产生的多重耐药性及生物膜形成在难愈性伤口的流行中起着关键作用1,2,3,4。因此，皮肤和软组织感染成为导致住院时间延长以及后续再入院的常见原因之一5。伤口愈合延迟对患者和医疗系统均造成高昂代价，据估计，美国每年约有650万患者受到影响。在英国，皮肤感染及其相关并发症每年导致约7.5万人死亡2,4,6。
金黄色葡萄球菌（S. aureus） 是一种常从患者伤口中分离出的严重伤口病原体2,7。多重耐药性的出现率在2000年代急剧上升。在此期间，约60%的急性细菌性皮肤及皮肤结构感染培养结果为耐甲氧西林 S. aureus1
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方案
本项目所用皮肤样本来源于 R.B Elliott 和 Son 屠宰场的羔羊头部。所有羔羊均被屠宰作为食物。这些头部未被丢弃，而是被重新用于科研。由于组织样本来自屠宰场废弃的材料，因此无需获得伦理审批。
1. 灭菌
- 在采集头部样本前，使用洁净的镊子并在200 °C干热灭菌烘箱中灭菌1小时，对镊子进行消毒。所有玻璃器皿在使用前于121 °C高压蒸汽灭菌15分钟。
- 所有操作均应在二级微生物操作柜内进行。所有试剂的配制均应按照制造商说明书进行。
2. 样品采集
- 在屠宰场，使用电击或高压气枪使斯瓦尔代羔羊昏迷后放血致死。屠宰后不超过4小时收集羔羊头部。
3. 头部的制备
- 将约 100 mL 的 200 ppm 二氧化氯溶液倒在样品区域，对羔羊前额部位进行消毒。使用电动剪刀剃除头部前额区域的毛发，并用 200 mL 的 200 ppm 二氧化氯溶液清洗该区域。
- 用乙醇和蓝色吸水纸擦拭该区域，涂抹脱毛膏并覆盖 35 分钟。使用刮刀轻轻刮除脱毛膏，并评估样品区域。若仍有大量毛发残留，请重复脱毛过程。
- 再使用 200 mL 二....
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结果
在建立伤口感染模型之前，确定一种对皮肤进行灭菌的途径具有挑战性。难点在于如何在不损伤不同皮肤层的情况下实现皮肤灭菌，因为皮肤层的损伤可能会对感染结果产生非预期的影响。为了确定合适的灭菌方案，尝试了不同处理方法及其作用时间，如表1所述。污染情况通过皮肤样本在MK培养基中维持48小时后是否出现浑浊来判断。组织完整性则通过处理后立即进行苏木精-伊红（H&E）染色的组织学检查进行监测（图1）。结果显示，使用二氧化氯处理30分钟在有效且可重复地灭菌皮肤组织的同时，能够较好地保持组织完整性。
在实验设置中，将受损的无菌组织置于24孔插入式培养板的顶端室中，保持气液界面状态（图2A）。尝试了两种不同的损伤方法：一种是瓣膜切除法，即使用穿孔活检工具对组织造成损伤，并结合15号手术刀片和无菌齿状Allis组织镊去除受损组织的表层；另一种是划痕法，仅使用穿孔活检工具对组织造成损伤。尽管划痕模型在24小时后平均菌落形成单位（CFU）数量较高，但.......
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讨论
抗菌药物的研发是一项重要但耗资巨大的事业，预计耗资约10亿美元，耗时约15年才能完成。超过90%的抗菌药物发现及抗菌药效的临床前研究由学术研究人员以及员工通常少于50人的中小型公司开展22。这些团队面临严重的资金限制，导致先导分子在转化研究后期阶段的失败可能带来灾难性后果。抗菌药物耐药性的上升速度已超过新型抗菌药物的开发速度，这进一步加剧了负责任地管理抗菌研究领域本已有限的投资的迫切需求23。
感染中细菌生理学的差异 体内 和 体外 实验室培养往往会导致在先导化合物筛选阶段高估活性化合物的抗菌效果。这种高估现象导致了后续转化阶段出现较高的淘汰率。目前可获得的 体外 结合了更接近感染期间细菌生理状态的抗菌功效测试平台 体内 将能够更准确地评估抗菌药物的有效性，并使研究人员在无需依赖昂贵且严格监管的动物实验的情况下，更好地控制先导化合物的优化过程。这类模型还将降低后续转化阶段的失败率，并可能提高抗菌药物研发对投资的吸引力.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者感谢英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC，项目编号：EP/R513313/1）提供的经费支持。作者还感谢位于切斯特菲尔德卡洛的 R.B Elliot 和 Son 屠宰场提供羔羊头部，并在项目初期阶段给予的大力支持与配合；感谢 Kasia Emery 在本实验方案开发过程中提供的持续支持；感谢谢菲尔德大学感染、免疫与心血管疾病系的 Fiona Wright 处理组织学样本，并在整个项目过程中给予的极大帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔配套板 | SLS | 353504 | |
| 4 mm活检打孔器 | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml离心管 | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm活检打孔器 | Williams Medical | D7488 | |
| 两性霉素B溶液，无菌 | Sigma | A2942 | |
| Color Pro Style无线理发剪 | Wahl | 9639-2117X | 理发剪 |
| 双温控培养箱 | SLS | OVe1020 | 灭菌烘箱 |
| 表皮生长因子 | SLS | E5036-200UG | |
| 乙醇 | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM培养基 | Sigma | N4888 | |
| 胎牛血清 | Labtech International | CA-115/500 | |
| 镊子 | Fisher Scientific | 15307805 | |
| 脱毛膏 | Veet | 不适用 | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | 组织培养箱 |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | 离心机 |
| 220型手持式匀浆器 | Fisher Scientific | 15575809 | |
| 220型匀浆器塑料搅拌头 | Fisher Scientific | 15585819 | |
| 24孔插入式培养板，0.4 µm膜 | VWR International | 353095 | |
| 重组人胰岛素 | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199（MK培养基） | Sigma | M0393 | |
| 96孔细胞培养板，Costar | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | 不适用 | 细菌培养箱 |
| PBS片剂 | Sigma | P4417-100TAB | |
| 青霉素-链霉素 | SLS | P0781 | |
| 微孔板封板膜 | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | II级微生物安全柜 |
| 15号手术刀片 | Fisher Scientific | O305 | |
| Swann Morton手术刀 | Fisher Scientific | 11849002 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761-1KG | |
| 带齿Allis组织镊 | Rocialle | RSPU500-322 | |
| 胰蛋白酶大豆琼脂 | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| 胰蛋白酶大豆肉汤 | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba片剂 | Quip Labs | VMTAB75BX |
参考文献
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
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重印与许可
