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方法文章

一种新型高通量 离体 用于测试新型抗生素的绵羊皮肤伤口模型

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DOI：

10.3791/64041

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2022年9月16日

 ,  , 
1Sheffield Collaboratorium for Antimicrobial Resistance and Biofilms (SCARAB), University of Sheffield, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of Sheffield

本文内容

摘要

该方案描述了一种逐步建立的详细方法 离体 感染的绵羊皮肤伤口模型 金黄色葡萄球菌该高通量模型能更真实地模拟感染过程 体内 与传统微生物学技术相比，为研究人员提供了一个具有生理相关性的平台，用于评估新型抗菌药物的有效性。

摘要

抗菌药物的研发是一个成本高昂且成功率日益降低的过程，这使得进一步投资于抗菌药物发现研究的吸引力下降。如果能够在研究人员对药物设计和制剂具有更大控制权的先导化合物优化阶段实施“快速失败、低成本失败”的策略，则可使抗菌药物的发现及后续商业化变得更加有利可图。本文介绍了一种简单、经济、高通量且可重复的ex vivo绵羊创伤皮肤感染Staphylococcus aureus 模型的建立方法。该模型中细菌的生理状态模拟了实际感染过程，其增殖依赖于病原体对组织的损伤能力。通过检测到可存活细菌数量相较于接种量显著增加，可确认伤口感染的成功建立。该模型可作为在先导优化阶段评估新型抗菌药物有效性的平台。可以认为，该模型的可用性将为抗菌药物研发人员提供一种“快速失败、低成本失败”的研究工具，有助于提高后续动物实验的成功率。此外，该模型还将促进动物实验使用的减少与优化，并最终推动针对皮肤及软组织感染的新型抗菌药物更快、更经济地向临床转化。

引言

皮肤感染是一个重要的全球性问题，给世界各地的医疗保健机构带来了巨大的经济负担。病原体产生的多重耐药性及生物膜形成在难愈性伤口的流行中起着关键作用1,2,3,4。因此，皮肤和软组织感染成为导致住院时间延长以及后续再入院的常见原因之一5。伤口愈合延迟对患者和医疗系统均造成高昂代价，据估计，美国每年约有650万患者受到影响。在英国，皮肤感染及其相关并发症每年导致约7.5万人死亡2,4,6。

金黄色葡萄球菌（S. aureus） 是一种常从患者伤口中分离出的严重伤口病原体2,7。多重耐药性的出现率在2000年代急剧上升。在此期间，约60%的急性细菌性皮肤及皮肤结构感染培养结果为耐甲氧西林 S. aureus1多重耐药菌株数量的不断增加 葡萄球菌在过去20年中，耐药病原体（包括其他病原体）的出现表明，迫切需要快速开发具有新型作用机制的抗生素以克服耐药性问题。

然而，自21世纪初以来，抗生素研发项目普遍面临研发周期长、成功率低的问题，仅有17%进入美国临床试验的新型抗生素最终获得上市批准8。这表明结果之间存在差异 体外 新型抗生素的测试及其临床结果。可以认为，这种差异在很大程度上源于感染过程中细菌生理状态的不同。 体内 以及在使用常规微生物学方法检测抗生素效力时 体外 临床前阶段。因此，需要开发更能代表感染过程中细菌生理状态的新型实验室方法，以提高抗生素发现项目的成功率。

目前研究皮肤感染的方法包括活体动物（例如小鼠）实验、ex vivo 皮肤模型（例如猪皮肤）以及3D组织工程皮肤模型（例如人源皮肤）9,10,11,12。活体动物实验受到严格监管，通量相对较低。在动物模型中，创伤和感染会给动物带来显著痛苦，并引发伦理问题。无论是ex vivo模型还是组织工程皮肤模型，均需获得伦理审批，遵守当地及全球法律法规（如《人体组织法案》《赫尔辛基宣言》），且组织获取困难，部分申请可能需要数年才能完成13,14。这两种模型均耗费大量人力，且需要具备丰富的专业知识以确保实验成功。一些现有的ex vivo皮肤感染模型需要在创面床中使用预接种的圆片和添加剂以促进感染；尽管这些模型非常有用，但感染过程存在局限性，因为添加剂会限制创面床作为营养来源的利用10,15,16,17。本研究中描述的模型在创面床中不使用任何添加剂，从而确保感染的病理变化和活细胞计数结果完全源于创面床作为唯一营养来源的直接利用。

鉴于对新实验方法的需求，一种新型高通量 离体 用于评估新型抗生素疗效的绵羊皮肤感染模型已得到开发。皮肤感染研究面临诸多挑战——高昂的成本、伦理问题以及无法全面呈现疾病特征的模型20,21. 离体 模型和三维组织外植模型能够更直观地展示疾病进程以及治疗手段在更具临床相关性模型中的影响。本文描述了一种新型绵羊皮肤模型的建立方法，该模型 简单、可重复、具有临床相关性且通量高。选择绵羊皮肤是因为绵羊是常用于模拟感染反应的大型哺乳动物之一 体内此外，这些皮肤材料可方便地从屠宰场获得，确保研究中有稳定的皮肤供应，且其尸体未经烫洗处理，从而保证了良好的组织质量。本研究采用 S. aureus 以典型病原体为例；然而，该模型也适用于其他微生物。

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方案

本项目所用皮肤样本来源于 R.B Elliott 和 Son 屠宰场的羔羊头部。所有羔羊均被屠宰作为食物。这些头部未被丢弃，而是被重新用于科研。由于组织样本来自屠宰场废弃的材料，因此无需获得伦理审批。

1. 灭菌

  1. 在采集头部样本前，使用洁净的镊子并在200 °C干热灭菌烘箱中灭菌1小时，对镊子进行消毒。所有玻璃器皿在使用前于121 °C高压蒸汽灭菌15分钟。
  2. 所有操作均应在二级微生物操作柜内进行。所有试剂的配制均应按照制造商说明书进行。

2. 样品采集

  1. 在屠宰场，使用电击或高压气枪使斯瓦尔代羔羊昏迷后放血致死。屠宰后不超过4小时收集羔羊头部。

3. 头部的制备

  1. 将约 100 mL 的 200 ppm 二氧化氯溶液倒在样品区域，对羔羊前额部位进行消毒。使用电动剪刀剃除头部前额区域的毛发，并用 200 mL 的 200 ppm 二氧化氯溶液清洗该区域。
  2. 用乙醇和蓝色吸水纸擦拭该区域，涂抹脱毛膏并覆盖 35 分钟。使用刮刀轻轻刮除脱毛膏，并评估样品区域。若仍有大量毛发残留，请重复脱毛过程。
  3. 再使用 200 mL 二氧化氯溶液冲洗该区域，随后用乙醇冲洗，并用蓝色吸水纸擦拭。
  4. 使用无菌的 8 mm 活检打孔器，从准备好的区域切取 8 mm 的皮肤样本。使用无菌镊子和 15 号手术刀取出样本，并确保彻底去除所有皮下脂肪组织。
  5. 将样本放入装有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的 0.5 L 无菌广口瓶中，随后转移至含有 50 mL 200 ppm 二氧化氯溶液的无菌 50 mL 离心管中，倒置混匀两次，静置消毒 30 分钟。
  6. 从二氧化氯溶液中取出样本，将其置于装有 40 mL 无菌 PBS 的 50 mL 离心管中进行清洗。清洗后，将每份皮肤样本分别放入 24 孔板中的独立孔内。
  7. 加入 350 µL 预热的培养基，同时保持样本处于气-液界面状态。培养基的成分为：MK 培养基（含 Hank's 盐、L-谷氨酸和 1.75 mg/mL 碳酸氢钠的 Medium 199）与 Ham's F12 培养基按 1:1 比例混合，并添加胎牛血清（FBS，10% v/v）、表皮生长因子（EGF，10 ng/mL）、胰岛素（5 µg/mL）、青霉素-链霉素（100 U/mL）和两性霉素 B（2.5 µg/mL）。
  8. 使用透气性板封膜密封 24 孔板，置于 37 °C、含 5% CO2 的加湿组织培养箱中孵育，最长不超过 24 小时。

4. 皮肤样本的保存

  1. 孵育后，移除培养基，并用 500 µL 无菌 PBS 清洗样品。向每个样品中加入不含抗生素的培养基，在 37 °C、含 5% CO2 的湿润组织培养箱中孵育 24 小时，以去除样品中残留的抗生素。
  2. 若在不含抗生素的培养基中孵育 24 小时后出现浑浊或真菌污染，则弃去该样品。

5. 接种物的制备

  1. 取一支50 mL离心管，加入10 mL无菌胰蛋白胨大豆肉汤。取一新鲜的金黄色葡萄球菌（S. aureus）琼脂平板，用拭子蘸取数个菌落并转移至肉汤中。于37 °C、150 rpm条件下培养18小时。
  2. 在4,000 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。重复洗涤两次，以确保细胞充分清洗。
  3. 用无菌PBS将接种物浓度调节至OD600为0.6。通过手工活菌平板计数法确认接种量。

6. 皮肤样本的感染

  1. 使用无菌镊子将24孔板的插入物放入含有400 µL预热的无抗生素培养基的新鲜24孔板中。
  2. 移除皮肤样本中的培养基，用500 µL无菌PBS洗涤，并吸除洗涤液。用无菌镊子轻轻将样本固定在孔底。
  3. 使用4 mm穿孔活检针在中央制造一个伤口瓣膜，穿透深度约为1–2 mm。然后，使用15号刀片手术刀和无菌带齿Allis组织镊去除伤口瓣膜的表层。伤口尺寸的差异可能影响感染结果及终点菌落形成单位（CFU）。
  4. 所有样本造模完成后，用无菌镊子将其转移至24孔板插入物中。向伤口床中加入15 µL细菌接种液，随后在37 °C、含5% CO2的湿润组织培养箱中孵育24小时。
  5. 若需更长的孵育时间，每隔24小时更换一次培养基，即移除原有培养基并替换为新鲜培养基，继续在相同条件下孵育。

7. 细菌载量的测定

  1. 移除孔底部的培养基。使用无菌镊子将每个样本转移至分别装有1 mL无菌PBS的50 mL离心管中。
  2. 使用细头匀浆器对样本表面进行匀浆处理。注意确保创面床与匀浆器头部直接接触。
  3. 将每个样本在中高转速下匀浆35秒。匀浆过程可使细菌从创面床表面脱离，以便对细菌载量进行计数。
  4. 所有样本处理完毕后，依次将每个样本涡旋振荡，再进行移液操作。以确保细菌匀浆液充分混匀。
  5. 取20 µL涡旋后的匀浆液，加入含有180 µL无菌PBS的96孔板对应孔中。
  6. 将每个样本的匀浆液进行连续梯度稀释至1 × 10−7，然后取10 µL稀释后的匀浆液，分别以三复孔形式接种至胰蛋白胨大豆琼脂平板上。
  7. 将琼脂平板在37 °C条件下孵育18小时，随后计数菌落数量，以确定每个样本的CFU值。

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结果

在建立伤口感染模型之前，确定一种对皮肤进行灭菌的途径具有挑战性。难点在于如何在不损伤不同皮肤层的情况下实现皮肤灭菌，因为皮肤层的损伤可能会对感染结果产生非预期的影响。为了确定合适的灭菌方案，尝试了不同处理方法及其作用时间，如表1所述。污染情况通过皮肤样本在MK培养基中维持48小时后是否出现浑浊来判断。组织完整性则通过处理后立即进行苏木精-伊红（H&E）染色的组织学检查进行监测（图1）。结果显示，使用二氧化氯处理30分钟在有效且可重复地灭菌皮肤组织的同时，能够较好地保持组织完整性。

在实验设置中，将受损的无菌组织置于24孔插入式培养板的顶端室中，保持气液界面状态（图2A）。尝试了两种不同的损伤方法：一种是瓣膜切除法，即使用穿孔活检工具对组织造成损伤，并结合15号手术刀片和无菌齿状Allis组织镊去除受损组织的表层；另一种是划痕法，仅使用穿孔活检工具对组织造成损伤。尽管划痕模型在24小时后平均菌落形成单位（CFU）数量较高，但...

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讨论

抗菌药物的研发是一项重要但耗资巨大的事业，预计耗资约10亿美元，耗时约15年才能完成。超过90%的抗菌药物发现及抗菌药效的临床前研究由学术研究人员以及员工通常少于50人的中小型公司开展22。这些团队面临严重的资金限制，导致先导分子在转化研究后期阶段的失败可能带来灾难性后果。抗菌药物耐药性的上升速度已超过新型抗菌药物的开发速度，这进一步加剧了负责任地管理抗菌研究领域本已有限的投资的迫切需求23。

感染中细菌生理学的差异 体内 和 体外 实验室培养往往会导致在先导化合物筛选阶段高估活性化合物的抗菌效果。这种高估现象导致了后续转化阶段出现较高的淘汰率。目前可获得的 体外 结合了更接近感染期间细菌生理状态的抗菌功效测试平台 体内 将能够更准确地评估抗菌药物的有效性，并使研究人员在无需依赖昂贵且严格监管的动物实验的情况下，更好地控制先导化合物的优化过程。这类模型还将降低后续转化阶段的失败率，并可能提高抗菌药物研发对投资的吸引力...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

作者感谢英国工程与物理科学研究委员会（EPSRC，项目编号：EP/R513313/1）提供的经费支持。作者还感谢位于切斯特菲尔德卡洛的 R.B Elliot 和 Son 屠宰场提供羔羊头部，并在项目初期阶段给予的大力支持与配合；感谢 Kasia Emery 在本实验方案开发过程中提供的持续支持；感谢谢菲尔德大学感染、免疫与心血管疾病系的 Fiona Wright 处理组织学样本，并在整个项目过程中给予的极大帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔配套板SLS 353504
4 mm活检打孔器Williams MedicalD7484
50 ml离心管Fisher Scientific 10788561
8 mm活检打孔器Williams MedicalD7488
两性霉素B溶液，无菌Sigma A2942
Color Pro Style无线理发剪Wahl9639-2117X理发剪
双温控培养箱SLSOVe1020灭菌烘箱
表皮生长因子 SLSE5036-200UG
乙醇Honeywell458600-2.5L
F12 HAM培养基SigmaN4888
胎牛血清 Labtech InternationalCA-115/500
镊子Fisher Scientific15307805
脱毛膏Veet不适用
Heracell VIOS 160iThermo Scientific15373212 组织培养箱
Heraeus Megafuge 16RVWR521-2242离心机
220型手持式匀浆器Fisher Scientific15575809
220型匀浆器塑料搅拌头Fisher Scientific 15585819
24孔插入式培养板，0.4 µm膜VWR International353095
重组人胰岛素SLS91077C-1G
Medium 199（MK培养基）SigmaM0393
96孔细胞培养板，CostarFisher Scientific10687551
MultitronInfors不适用细菌培养箱
PBS片剂Sigma P4417-100TAB
青霉素-链霉素SLS P0781
微孔板封板膜Fisher ScientificESI-B-100
Safe 2020Fisher Scientific1284804II级微生物安全柜
15号手术刀片Fisher ScientificO305
Swann Morton手术刀Fisher Scientific11849002
碳酸氢钠SigmaS5761-1KG
带齿Allis组织镊RocialleRSPU500-322
胰蛋白酶大豆琼脂Merck Life Science UK Limited14432-500G-F
胰蛋白酶大豆肉汤Merck Life Science UK Limited41298-500G-F
Vimoba片剂Quip LabsVMTAB75BX

参考文献

  1. Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
  2. Rahim, K., et al. Bacterial contribution in chronicity of wounds. Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).
  3. Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591(2018).
  4. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  5. Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
  6. Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
  7. Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
  8. Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
  9. MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
  10. Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
  11. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
  12. Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
  13. Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
  14. Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
  15. Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
  16. Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
  17. Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
  18. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
  19. Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
  20. Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404(2017).
  21. Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
  22. Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
  23. Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
  24. Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
  25. Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804(2021).
  26. Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
  27. Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
  28. Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
  29. Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
  30. Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
  31. Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
  32. Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
  33. Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
  34. Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
  35. Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
  36. Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968(2019).
  37. Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
  38. Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909(2022).
  39. Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).

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