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方法文章

生成人源诱导多能干细胞衍生的视网膜类器官以模拟视网膜色素变性

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DOI：

10.3791/64045

⸱

2022年6月16日

 ,  , 
1Beijing Tongren Hospital, Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory, Beijing Tongren Eye Center, Capital Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在本实验方案中，生成了视网膜色素变性患者来源的诱导性多能干细胞（iPSC）三维视网膜类器官。这些类器官成功地重现了视网膜色素变性疾病的某些临床表型。

摘要

视网膜色素变性（RP）是一种罕见的遗传性视网膜变性疾病，全球患病率约为1/4,000。大多数RP患者表现为进行性光感受器退化，导致周边视力丧失、夜盲，最终完全失明。迄今为止，已有超过90个基因中的数千种突变被报道与RP相关。目前，针对所有致病基因及不同突变类型的动物模型仍十分有限，这在很大程度上阻碍了对基因/突变致病机制的解析，并限制了治疗手段和药物的研发。患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）衍生的三维视网膜类器官（ROs）相较于细胞和动物模型，为研究人类早发性疾病提供了更优的体系。为研究RP，研究人员利用这些患者来源的三维视网膜类器官重现了RP的临床表型。在RP患者来源的类器官中，视紫红质的错误定位现象明显。与其他动物模型相比，患者iPSC来源的视网膜类器官模型能更准确地模拟RP的特征，是研究疾病发病机制及开展药物研发的理想途径。

引言

人类视网膜疾病，例如视网膜色素变性及年龄相关性黄斑变性，由于缺乏合适的实验模型，其发病机制尚不明确1,2尽管小鼠视网膜与人类视网膜非常相似，且是研究视网膜变性病因的有力工具，但小鼠与人类之间仍存在巨大的物种差异3,4例如，小鼠和人类的感光细胞核结构不同，且小鼠视网膜不具有黄斑5,6诱导性多能干细胞（iPSC）技术使我们能够通过重编程将生物体的特化细胞逆转至初始的多能状态 "重编程" 转录因子和/或化合物组合介导的过程7,8,9,10这些诱导多能干细胞具有近乎无限的分裂和增殖能力，能够分化为多种类型的细胞。近年来，由诱导多能干细胞衍生的三维视网膜类器官已被用于模拟人类视网膜发育的早期事件，并阐明人类视网膜疾病的病理生理机制。11,12,13,14,15视网膜类器官具有诸多优势：（1）可用于重现 体内 视网膜发育与疾病发病机制研究；（2）可用于高通量药物筛选和基因治疗的临床前试验；（3）可作为视网膜变性类疾病的治疗方案临床前评估工具16,17.

本项目的一个目标是研究视网膜色素变性（retinal pigmentosa, RP）的发病机制，该疾病由于具有极高的异质性而至今无法治愈18。迄今为止，已发现超过90个基因与RP相关19,20。其中，RPGR基因被认为是RP最常见的致病基因之一15，约占所有RP病例的16%4,21,22。研究人员已成功构建携带RPGR基因移码突变的诱导多能干细胞（iPSCs），并将其分化为结构有序、层次分明的三维视网膜类器官14。利用这些类器官，观察到了光感受器层形态异常以及光感受器中视蛋白的错位现象。

综上所述，本文详细描述了一种逐步且易于操作的方案，用于生成患者来源的三维视网膜类器官23,24。这些类器官成功地再现了部分疾病的临床表型，为研究视网膜发育和疾病机制、药物筛选以及未来临床前基因治疗的评估提供了令人鼓舞的模型。

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方案

本方案遵循首都医科大学人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 细胞培养与诱导多能干细胞的制备

  1. 选择RPGR患者进行本研究。本研究使用了三名患者、一名家族携带者和三名健康对照者。患者1在RPGR基因的第14号外显子中存在c.1685_1686delAT突变，患者2在RPGR基因的第15号外显子中存在c.2234_2235delGA突变，患者3在RPGR基因的第15号外显子中存在c.2403_2404delAG突变。选择三名健康志愿者作为对照14。通过静脉穿刺采集患者和健康对照者的外周全血样本，并将其置于血液采集管中（材料表）。
  2. 使用密度梯度介质通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）25。在培养皿中，将经细胞因子激活的CD34+ PBMCs在8 mL生长增强培养基中扩增（表1）。
  3. 1周后，使用转染系统（材料表）对CD34阳性外周血单个核细胞进行电穿孔，并选择CD34阳性细胞及内置的T-01程序，不作任何修改。转染一组重编程质粒（2 µg），该质粒可表达人OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c-MYC和KLF4蛋白。
  4. 将转染后的细胞接种于经人重组玻璃粘连蛋白包被的六孔板中，每孔2 mL DMEM/F12培养基，并添加B-27（1x）、N-2（1x）、PD0325901（0.5 µM）、bFGF（100 ng/mL）、CHIR99021（3 µM）、HA-100（10 µM）、A-83-01（0.5 µM）和hLIF（1000 U/mL），以维持iPSC的生长。
  5. 转导3周后，手动挑选iPSC克隆，随后转移至六孔板中，并在试剂B（材料表）中进行扩增培养。
    注：六孔板应预先包被人重组玻璃粘连蛋白。将玻璃粘连蛋白溶液用DPBS稀释至终浓度为10 µg/mL。将稀释后的玻璃粘连蛋白加入组织培养处理过的六孔板中。轻轻摇晃培养器皿，使玻璃粘连蛋白溶液均匀覆盖六孔板表面。于37 °C孵育至少1小时。
  6. 当iPSC融合度达到约80%-90%时，使用0.5 mM EDTA将细胞解离，并按1:8或1:10的比例传代。在传代当天，向试剂B（表1）中加入blebbistatin（2.5 µM）。
    注：Blebbistatin用于促进细胞黏附和干细胞存活，并防止干细胞凋亡。18小时后，应更换为新鲜的试剂B。

2. 人类视网膜类器官的生成

注意：当iPSCs达到约80%-90%融合度时，必须进行解离。

  1. 使用 0.5 mM EDTA 在 37 ℃ 下解离人诱导多能干细胞（hiPSC）集落 ◦C，5 分钟。
  2. 通过轻柔吹打将hiPSC细胞团分离为单细胞。计数细胞用于传代培养，并将其在试剂B中培养。表1).
  3. 第0天，在96个V型底锥形孔中每孔接种12,000个细胞，每孔体积为100 μL，用于细胞重聚集 µ分化培养基的L（升）表1).
  4. 第6天，小心吸除细胞培养基，并加入100 µ含有20的分化培养基的L μM Y 27632 和 1.5 nM (55 ng/mL) hBMP4。
  5. 第9天，更换一半的分化培养基，以维持hBMP4浓度在约0.75 nM。
  6. Aspire 60 µL 的分化培养基，并加入 60 µ新鲜分化培养基中的 L，含有 20 μ每孔加入 Y-27632
  7. 第12天，用新鲜的分化培养基替换一半的原有分化培养基，使hBMP4浓度达到0.375 nM。
  8. 第18天，使用10 mL枪头将类胚体转移至新的培养皿中，在倒置显微镜下用显微外科刀将每个类胚体切割为2-4块，以产生更多的类器官。
  9. 将同一组的细胞团块转移至一个15 mL离心管中。待细胞团块沉降至管底后，吸除上清液。
  10. 用1 mL神经视网膜培养基（DMEM/F12、10%胎牛血清、1% N-2补充剂、0.5 µM视黄酸，0.1 mM牛磺酸，1%青霉素-链霉素），转移至含有15 mL神经视网膜培养基的无粘附培养皿中。每个培养皿中放入10–15个视网膜类器官。
  11. 每5天更换一次培养基。由于视黄酸对光敏感，培养过程需避光进行。图1）并使用倒置显微镜检查自组织人视网膜组织的形成情况26,27,28,29.

3. 视网膜类器官的分析

  1. 人诱导多能干细胞来源的三维视网膜免疫荧光染色
    1. 在 4 °C 条件下，用 1 mL 新配制的 4% 多聚甲醛 DPBS 溶液固定三维视网膜 20 分钟。然后用 1 mL DPBS 缓冲液冲洗类器官。
    2. 称取 0.5 g 琼脂糖（材料表），将琼脂糖粉末与 100 mL DPBS 混合于可微波加热的烧瓶中。使用微波炉加热 1–3 分钟，直至琼脂糖完全溶解。将琼脂糖溶液冷却至约 40 °C。
    3. 将类器官包埋于 2% DPBS 琼脂糖中。
    4. 使用振动切片机将样品切成 50 µm 厚的切片。将切片置于粘附性显微镜载玻片（材料表）上，并于 −80 °C 保存。
    5. 在室温（RT）下解冻切片 15 分钟。
    6. 用 DPBS 洗涤切片 5 分钟，重复 3 次。
    7. 使用含 0.5% Triton X-100 的 DPBS 溶液在室温下对切片进行透化处理 15 分钟。
    8. 移除透化溶液，用 DPBS 洗涤切片 5 分钟，重复 3 次。
    9. 在室温下用含 1% BSA 和 0.5% Triton X-100 的 DPBS 溶液孵育切片 30 分钟。
    10. 在 4 °C 条件下，用抗视紫红质抗体（1:1000）和抗 L/M 视蛋白抗体（1:1000）稀释于含 1% BSA 和 0.1% Triton X-100 的溶液中孵育切片 16 小时。
    11. 用 DPBS 洗涤切片 5 分钟，重复 3 次。
    12. 在室温下用驴抗小鼠和兔二抗（1:500）稀释于含 1% BSA 和 0.1% Triton X-100 的溶液中孵育切片 1 小时。
    13. 在室温下用含 30 nM 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 DPBS 溶液染色 15 分钟，用于细胞核染色。
    14. 用 DPBS 洗涤切片 5 分钟，重复 5 次。
    15. 用封片介质（材料表）封片并加盖盖玻片（材料表）。置于避光盒中，4 °C 保存，最长可保存 4 周。
  2. RNA 提取与 RNA 测序
    1. 在相同分化时间点（第 0 天、第 47 天、第 91 天、第 121 天和第 151 天），于冰上收集各对照组和患者来源的 1–3 个（根据大小）三维视网膜，加入 1 mL RNA 提取试剂（材料表）中。
    2. 使用匀浆器（材料表）对样品进行破碎处理，开启 1 分钟，关闭 30 秒，重复三个循环，并检查样品破碎情况。
    3. 当样品完全匀浆后停止匀浆操作，剧烈涡旋振荡管子 30 秒。
    4. 将样品在冰上孵育 15 分钟。
    5. 在 4 °C 条件下以 13,800 x g 离心 15 分钟，将上清液转移至新的 2 mL 无 RNase 的离心管中。
    6. 向管中加入 0.4 mL 氯仿，涡旋混匀，然后在 4 °C 条件下以 13,800 x g 离心 10 分钟。
    7. 小心转移无色上层液体（约 2/3）至新的无 RNase 离心管中。避免吸取或扰动含有 DNA 的白色中间层。
    8. 加入 0.5 mL 冷异丙醇，涡旋 30 秒，然后在 4 °C 条件下以 13,800 x g 离心 15 分钟。管底侧壁可见沉淀形成。
    9. 用移液枪头小心吸除上清液，保留沉淀。
      注：当 RNA 纯度很高时，沉淀呈胶状且透明。
    10. 加入 1 mL 冷 70% 乙醇，剧烈涡旋振荡 30 秒，然后在 4 °C 条件下以 13,800 x g 离心 10 分钟。
    11. 用移液枪头小心吸除上清液，在室温下通风橱中将沉淀空气干燥 5–10 分钟。切勿过度干燥。
    12. 加入 20–50 µL 无 RNase 的水，通过上下吹打小心重悬沉淀。
    13. 取 1 µL RNA 样品用于分光光度计检测（材料表）。分别从对照组和患者样本中获得约 10 µg 总 RNA，用于 Illumina 文库构建30。
    14. 将 RNA 在 −80 °C 保存。

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结果

示意图描述了生成健康个体及患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）视网膜类器官的分化流程（图1）。从iPSC到视网膜类器官（ROs）的整个过程可能因多种因素而产生差异。iPSC的状态是决定RO生成的关键步骤。此外，强烈建议研究人员记录每一步操作、所有培养基的目录号及批号，以确保整个实验过程可追溯。在图2A中，展示了健康个体与患者来源的iPSC视网膜类器官在第130天时视杆细胞标志物Rhodopsin（红色）和L/M视锥细胞标志物L/M-opsin（绿色）的免疫染色结果。在患者来源的iPSC视网膜类器官中，外核层（ONL）的细胞形态遭到破坏，这与视网膜色素变性（RP）的临床表型一致。采用RNA-seq分析比较了健康个体与患者来源的iPSC视网膜类器官在第0天、第47天、第91天、第121天和第151天时光感受器转录因子的差异。结果显示，在患者来源的iPSC视网膜类器官中，部分光感受器转录因子及成熟调控基因的表达水平显著低于对照组iPSC来源的视网膜类器官。值得注意的是，在第91天、第121天和第151天，健康视网膜中CRX、...

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讨论

视网膜类器官是由人诱导多能干细胞（hiPSCs）或胚胎干细胞（ESCs）衍生而来的三维层状结构，是模拟人类视网膜发育时空模式的极具前景的模型31,32。视网膜类器官包含多种视网膜细胞类型，如光感受器细胞、双极细胞、神经节细胞、无长突细胞、水平细胞以及 Müller 胶质细胞33。二维培养无法精确模拟光感受器细胞外段的方向与发育过程。尽管视网膜类器官的生成是一个耗时较长的过程，通常需要超过6个月的高强度劳动，但这些三维人视网膜类器官仍是一种优良的实验体系，原因在于：I）该体外（in vitro）方法具有不同的神经发育分化阶段，且与体内（in vivo）发育过程相似；更重要的是，II）它们能够形成结构良好且组织有序的组织，包含多种类型的视网膜细胞；III）它们使得对具有不同遗传背景的多种患者样本进行遗传操作成为可能34,35。...

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披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

我们感谢李艳萍（M.S. Yan-ping Li）和刘卓林（Zhuo-lin Liu）在技术方面提供的支持以及对本文稿提出的有益意见。本工作部分得到了国家自然科学基金（82171470、31871497、81970838、Z20J00122）、北京市自然科学基金（Z200014、82125007）和国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2017YFA0105300）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔 V 型底锥形板Sumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83–01R&D Systems2939/10
黏附性显微镜载玻片CITOtest188105
琼脂糖Gene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b 装置LonzaAAB-1001转染系统
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&D Systems3718-FB
布雷菲德菌素 ANuwacell BiotechnologiesRP01008
采血管BD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
盖玻片CITOGLAS10212440C
cTarget hPSC 培养基Nuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham’s F12Gibco10565-042
驴抗小鼠 488InvitrogenA-21202
驴抗兔 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
包埋介质FluorSaveTM 试剂345789
EX-CYTE 生长增强培养基Sigma811292生长增强培养基
胎牛血清Gibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8密度梯度介质
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-谷氨酰胺补充剂
HA-100STEMCELL Technologies72482
Ham’s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
匀浆器EDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove’s 改良杜尔贝科培养基Gibco12440053
KnockOut 血清替代物 - 多物种GibcoA3181502血清替代培养基
L/M-视蛋白Milliporeab5405
单硫代甘油SigmaM6145
N-2 补充剂Thermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop 分光光度计Thermo Fisher ScientificND2000分光光度计
ncEpic 125x 补充剂Nuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x 补充剂
ncEpic 基础培养基Nuwacell BiotechnologiesRP01001-01基础 hPSC 培养基
ncLaminin511 人重组蛋白Nuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
青霉素-链霉素Gibco15140-122
重组人 BMP4R&D Systems314-BP
视黄酸SigmaR2625
视紫红质SigmaO4886
RNeasy 小量试剂盒Qiagen74104
RNeasy 小量试剂盒Qiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM 培养基STEMCELL Technologies09600
牛磺酸SigmaT8691
Trizol 试剂Invitrogen15596026
纤连蛋白Nuwacell BiotechnologiesRP01002
V-Lance 刀片Alcon Surgical8065912001

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