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毫秒级氢/氘交换质谱法用于生理条件下α-突触核蛋白结构动力学研究

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DOI：

10.3791/64050

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2022年6月23日

 , 
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

本文内容

摘要

单体α-突触核蛋白的结构集合影响其生理功能和理化性质。本方案描述了如何在生理条件下，对这种内在无序蛋白的单体进行毫秒级氢/氘交换质谱分析及后续数据处理，以获得其构象信息。

摘要

α-突触核蛋白（aSyn）是一种内在无序蛋白，其纤维状聚集体在路易小体和路易神经突中大量存在，而这些结构是帕金森病的典型病理特征。然而，该蛋白的许多生物学功能及其聚集过程在很大程度上均涉及其可溶性单体形式。要阐明aSyn生物学与病理生理学的分子机制，需要具有高分辨率的结构研究方法，并且对生物条件高度敏感。由于aSyn天然呈非折叠的亚稳态结构，使得单体形式的aSyn难以适用于多数结构生物学技术。本文介绍其中一种方法的应用：在毫秒时间尺度上对热力学稳定性较低且保护因子较弱的蛋白质（如aSyn）进行氢/氘交换质谱（HDX-MS）分析。在毫秒时间尺度下，HDX-MS数据包含了关于aSyn溶剂可及性和氢键结构的信息，而这些信息在较长标记时间下会丢失，最终可实现氨基酸水平的结构解析。因此，HDX-MS能够在高空间和时间分辨率下提供有关构象动力学与热力学、分子内及分子间相互作用，以及突变或环境条件改变对结构影响的信息。本文虽强调其广泛适用性，但重点演示了如何获取、分析和解读单体aSyn的毫秒级HDX-MS测量数据。

引言

帕金森病（PD）是一种影响全球数百万人的神经退行性疾病1。该病的特征是在脑部黑质致密带区域形成称为路易小体和路易神经突的胞质包涵体。这些胞质包涵体被发现含有内在无序蛋白aSyn的聚集物2。在帕金森病及其他突触核蛋白病中，aSyn会从可溶性的无序状态转变为不溶性的高度有序致病状态。在天然状态下，单体形式的aSyn通过其N端与C端之间的长程静电相互作用以及C端与非淀粉样β组分（NAC）区域之间的疏水相互作用，形成多种稳定的构象3,4,5,6。任何对这些稳定相互作用的干扰，例如突变、翻译后修饰或局部环境的变化，都可能导致单体错误折叠，从而引发聚集过程7。

尽管目前已有大量关于aSyn的寡聚体和纤维形式的研究8,9,10,11，但对aSyn单体形式的研究仍至关重要，亟需更深入地理解哪些构象具有功能（及其作用机制），以及哪些构象易于发生聚集8,9,10,11。由于aSyn本质上是无序结构，分子量仅为14 kDa，且难以结晶，因此大多数结构生物学技术难以适用于aSyn单体的研究。然而，毫秒级氢氘交换质谱（millisecond HDX-MS）能够测量单体aSyn的构象动态，并已近期获得了一些其他方法难以甚至无法获取的重要结构信息12,13,14。毫秒级HDX-MS通过监测酰胺氢的同位素交换，反映特定蛋白区域在毫秒时间尺度上的溶剂可及性及氢键网络参与情况，从而灵敏地测量蛋白构象集合的平均状态。必须强调HDX-MS的“毫秒”特性，因为aSyn具有天然未折叠和亚稳态的特性，其氢交换动力学极为迅速，远低于传统HDX-MS系统的检测下限。例如，在细胞内条件下，aSyn分子的大部分在不到1秒的时间内已完成氢向氘的完全交换。目前已有多个实验室开发了快速混合装置；本研究中采用的是一种原型快速混合淬灭流动仪，可实现50 ms的死时间及1 ms的时间分辨率，用于执行HDX-MS15。尽管毫秒级HDX-MS近期在aSyn研究中展现出关键价值，但它在更广泛地研究内在无序蛋白/区域以及大量仅含弱稳定环区或结构域的蛋白方面也具有重要潜力。例如，肽类药物（如胰岛素；GLP-1/胰高血糖素；替泽帕肽）和肽融合蛋白（如HIV抑制剂FN3-L35-T1144）是重要的药物形式，其溶液相中的结构与稳定性信息对药物研发决策至关重要；然而，这些肽段部分通常仅具有弱稳定性，在秒级时间尺度的HDX-MS中难以检测16,17,18,19,20。新兴的在秒至分钟时间域内进行标记的HDX-MS方法已被用于解析DNA G-四链体的结构信息，但通过应用毫秒级HDX-MS，有望将该技术拓展至更多样化的寡核苷酸结构研究21。

HDX-MS 实验可在三个不同层面进行：（1）自下而上法（将标记的蛋白质进行蛋白酶解消化），（2）中等向下法（将标记的蛋白质进行蛋白酶解消化，所得肽段再通过软解离技术进一步碎裂），（3）自上而下法（通过软解离技术直接碎裂标记的蛋白质）22因此，亚分子水平的HDX-MS数据可将氢氘交换行为定位至蛋白质的特定区域，这使得此类实验必须具备足够的序列覆盖率。任何HDX-MS实验的结构分辨率均依赖于蛋白经酶解或软解离后所产生的蛋白酶切肽段或片段的数量。在上述三种实验类型中，每个肽段/片段上酰胺氢交换的变化均被映射回蛋白质的一级结构，以反映蛋白质局部区域的行为特征。尽管软解离可实现最高的结构分辨率，但此类实验的详细描述不在本研究的范围之内，本研究聚焦于aSyn单体构象的测定。采用常规方法即可获得优异的结果 "自下而上" 此处描述的工作流程。

本文提供了以下实验步骤：（1）aSyn 样品及氢氘交换质谱（HDX-MS）缓冲液的制备与处理方法；（2）自下而上（bottom-up）HDX-MS 实验中的肽段图谱分析方法；（3）在生理条件下（特别是毫秒时间尺度）使用自制仪器对单体 aSyn 进行 HDX-MS 数据采集（已有其他仪器可用于毫秒级标记）；（4）HDX-MS 数据的处理与分析方法。本文以生理 pH（7.40）下两种溶液条件中的单体 aSyn 为例进行说明。尽管这些方法在 aSyn 研究中具有重要价值，但其适用于任何蛋白质，并不仅限于内在无序蛋白。

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方案

1. aSyn 蛋白的表达与纯化

  1. 按照先前发表的文献方法制备 aSyn9。
  2. 透析至安全储存缓冲液中（例如 Tris，pH 7.2）。
  3. 如有需要，浓缩样品（例如，使用 3 kDa 截留分子量的离心滤管，在 14,000 × g 条件下离心约 10–30 分钟，参见材料表）。
    注意：建议不要过度浓缩。aSyn 单体混合物的完整性在浓度超过 25 µM 时尚未得到验证。
  4. 分装后于 −80 °C 保存
    ​注意：在上述储存条件下，aSyn 单体蛋白可稳定保存长达 1 年。

2. HDX 缓冲液的制备

注意：由于Tris具有较高的温度系数，需要根据HDX反应进行时的温度（本方案中为20 °C）对pH测量值进行校正。

  1. 通过将0.002 mol Tris溶解于100 mL LC-MS级水中，配制用于状态A和状态B的平衡缓冲液。对于状态B，向Tris缓冲液中加入29.8 mg KCl、14.2 mg MgCl2、36.8 g CaCl2和836 mg NaCl。调节pH至7.40 ± 0.05。
    注意：平衡缓冲液必须包含α-突触核蛋白（aSyn）研究所需的条件。本实验中为pH 7.4下的20 mM Tris，含或不含盐。
  2. 通过将0.002 mol Tris溶解于100 mL氘代水中，配制用于状态A和状态B的标记缓冲液。对于状态B，向Tris标记缓冲液中加入29.8 mg KCl、14.2 mg MgCl2、36.8 g CaCl2 和836 mg NaCl。标记缓冲液的pD值应对应于平衡缓冲液的pH值。由于pH = pD - 0.41，调节至pH计读数为6.99 ± 0.0523,24。
    注意：标记缓冲液的组分需与平衡缓冲液相同，仅使用氘代水配制。
  3. 通过称取0.010 mol Tris和0.050 mol尿素，并用LC-MS级水定容至100 mL，配制淬灭缓冲液。在0.5 °C下调节pH至2.50 ± 0.05。
    注意：在进行氢氘交换（HDX）实验前，必须筛选淬灭缓冲液，以确定目标蛋白的最佳淬灭条件。需测试不同浓度和组合的变性剂（如尿素和盐酸胍）及还原剂（如三(2-羧乙基)膦），并结合洗脱体积和温度等物理参数，以有效使淬灭后的蛋白解折叠并消化。本研究中，含100 mM Tris和0.5 M尿素、pH 2.50的淬灭缓冲液为最优选择。
  4. 在Duran玻璃瓶中称取0.125 mol盐酸胍，加入25 mL甲醇和250 µL甲酸，再用LC-MS级水定容至250 mL，配制消化柱清洗缓冲液。
    注意：对于Enzymate BEH胃蛋白酶柱（见材料表），使用含0.5 M盐酸胍、10%（v/v）甲醇和0.1%（v/v）甲酸的柱清洗缓冲液。
  5. 通过移液枪将0.5 µL甲酸加入249.5 mL LC-MS级水中，配制注射器弱清洗液。
  6. 将等体积的LC-MS级水、甲醇、乙腈和异丙醇混合，并加入甲酸至终浓度为2%（v/v），配制注射器强清洗液。
    ​注意：为防止不同缓冲液、蛋白样品之间的交叉污染，并实现进样口的清洁，必须配制注射器清洗液，并确保通往阀门的流路（通常称为"清洗衬管"）完全充满液体。甲酸在注射器弱清洗液中为可选组分。

3. 肽图谱分析流程

  1. 按照以下步骤准备样品。
    1. 使用 0.22 µm 注射器滤膜对来自 −80 °C 冰箱的 aSyn 蛋白储备液进行过滤。在 280 nm 处测定过滤后蛋白储备液的吸光度，利用比尔-朗伯定律确定其浓度。用平衡缓冲液（步骤 2.1）将蛋白稀释至 5 µM 的浓度。
      注意：比尔-朗伯定律：A = εcl，其中 A 为吸光度，ε 为蛋白在测定波长（此处为 280 nm）下的消光系数，单位为 M−1cm−1，c 为蛋白浓度（单位 M），l 为光程（单位 cm）。对于野生型 aSyn26，ε = 5960 M−1cm−1。
  2. 设置液相色谱方法。
    1. 创建一个进样文件，以 7000–9000 psi 的压力进行 3 分钟的上样/捕获，随后在 7 分钟内从 5% 乙腈梯度洗脱至 40% 乙腈，再进行多次清洗步骤，使用 5%–95% 乙腈-水溶液清洗 10 分钟。
    2. 确保锁喷雾（例如亮氨酸脑啡肽，参见材料表）在 2000 psi 下流动，并连接至质谱仪的源锁喷雾探针。
  3. 设置质谱 MSE 方法。
    注意：MSE 是一种宽带数据非依赖性采集方法，无需前体离子质量隔离。因此，在选定的 m/z 范围内所有离子均会通过碰撞诱导解离（CID）进一步碎裂27。
    1. 在 MS 方法文件中选择MSE Continuum，设置采集时间为 2–10 分钟，电喷雾离子源，正离子分辨率模式。在 50–2000 Da 范围内采集 MSE 数据，每 0.3 秒扫描一次。
    2. 对于函数 1（低能量），设置捕获和传输碰撞能量为 4 V。对于函数 2（高能量），设置传输碰撞能量恒定为 4 V，捕获碰撞能量则根据表 1中各映射能量水平所列数值进行设置。
      注意：也可使用离子淌度 MSE 方法。用户可根据需要选择其他映射方法（例如数据依赖性采集或 DDA）。
  4. 设置自动进样机器人（参见材料表）。
    1. 将 50 µL 的 5 µM 蛋白加入一个总回收小瓶中。将该小瓶置于 HDX 右侧腔室的样品位置。确保该腔室温度为 0.5 °C。
    2. 将一管平衡缓冲液和两管标记缓冲液分别加入 HDX 左侧腔室的试剂位 1、2 和 3。通过设置帕尔帖温控器（参见材料表）确保该腔室温度为 20 °C。将一管淬灭缓冲液加入 HDX 右侧腔室的试剂位 1。
    3. 在 HDX 左侧腔室的反应位中加入八个总回收小瓶，在 HDX 右侧腔室的反应位中加入八个最大回收小瓶。
      注意：为确保充分清洗并最大程度提高分配体积的可重复性，建议对自动进样器的注射器执行清洗和引液操作。例如，在开始映射实验前执行以下序列：（1）弱清洗，（2）强清洗，（3）弱清洗。该序列可多次重复，建议执行最多 20 次，或直至注射器完全润湿。
    4. 在调度软件中设置包含适当 LC 和 MS 方法的样品列表，并启动运行程序。
      注意：本研究中使用 Chronos 作为调度软件（参见材料表）。
  5. 处理映射数据。
    1. 使用适当的软件从映射实验文件中鉴定肽段（参见材料表）。
    2. 使用以下肽段筛选参数将肽段鉴定数据导入 DynamX（参见材料表）：最小强度 = 5000，最小序列长度 = 0，最大序列长度 = 40，最小产物数 = 1，每氨基酸最小产物数 = 0.25，最小连续产物数 = 2，产物总强度最小值 = 0，最小得分 = 0，最大 MH+ 误差（ppm）= 0。
      注意：也可根据推荐的工作流程28推导出优化设置。
    3. 从菜单中选择数据，点击导入 PLGS 结果。点击添加以选择用于谱图指认的相关数据文件。添加全部文件后，点击下一步并输入上述过滤设置。然后点击完成。
    4. 手动校正同位素归属，以在 DynamX 中获得 aSyn 的最终肽段覆盖图。

4. 毫秒级氢/氘交换研究

  1. 在开始氢氘交换（HDX）实验之前，清洁 FastHDX 原型仪器（参见材料表）。
    1. 打开兼容的 HDX 软件图形用户界面（GUI），并允许系统初始化。
    2. 将样品室温度设置为20 °C，将淬灭室温度设置为0.5 °C。点击设置以应用新温度。
    3. 在所有进样口处安装装有液相色谱-质谱级水的离心管。
    4. 在滴定仪管路输送选项卡中，检查左右两个注射器，并点击预冲洗以去除管路中可能存在的滞留气泡。重复操作直至所有气泡消失。
    5. 在宏选项卡中，选中所有注射器的复选框。点击校准注射器初始位置。点击清洗注射器加载环路。点击清洗所有混合环路体积。
    6. 再重复步骤 4.1.5 一次。
    7. 如果缓冲液注射器中出现气泡，可通过断开注射器并垂直排出气泡的方式进行脱气处理。重新安装注射器后，再次校准至零位。
  2. 设置 FastHDX 原型仪器以进行 HDX 实验。
    1. 在总回收瓶中加入 500 µL 过滤后的 5 µM aSyn，并将其置于台式冰箱中，以防止温度诱导的寡聚化和聚集。
    2. 在左右腔室的每个缓冲液入口（2. HDX 缓冲液制备步骤 1–3）中加入 50 mL 平衡缓冲液、标记缓冲液和淬灭缓冲液。
    3. 在胃蛋白酶清洗入口中加入 50 mL 柱清洗缓冲液（2. HDX 缓冲液制备步骤 4）。
    4. 为对蛋白质和柱清洗管路进行一次预冲洗，在滴定仪管路输送选项卡中选中左右两个注射器，并点击预冲洗 一次。
      注意：在软件中点击“预冲洗”后，任何后续点击都将导致预冲洗过程额外重复，从而消耗大量蛋白质样品。即使在按钮点击后软件存在延迟，也应谨慎操作以避免重复点击。
    5. 再重复步骤 4.1.5 一次。
    6. 在手动淬灭流选项卡中，输入所需设置，具体说明见步骤 4.2.7–4.2.10。
    7. 对于时间进程实验，使用符号点按钮以毫秒为单位输入时间。若需要重复实验，请多次输入相同时间点，例如，对于 50 ms 的三重复，需输入“50 50 50”。质谱仪软件中的样品列表（此处使用 MassLynx，参见材料表）必须与这些时间点完全匹配。
      注意：应使用质谱仪样品列表中的文件名和/或样品文本，以确保永久记录与 FastHDX 软件 GUI 中输入相对应的 HDX 标记时间。每个样品运行的标记时间不会在其他任何地方存储。
    8. 将捕获时间（分钟）设置为捕获时间的长度。此处设为 3.00。
    9. 将等待 HPLC 时间（分钟）=（捕获时间 + 运行时间 + 1.5 分钟）。
      注意：例如，对于捕获时间为 3 分钟、梯度为 17 分钟的实验，该值应为 21.50 分钟。
    10. 仅在样品运行之间进行空白实验时，才勾选运行空白框。如果勾选，请确保软件中的样品列表包含空白运行的条目（即每个样品运行后均有有效的空白行）。
    11. 当软件中的样品列表准备就绪后，高亮选中相应条目，并通过点击软件中的播放按钮和FastHDX启动运行。
      ​注意：由于氢/氘混杂现象，只能使用仅质谱方法或软解离技术（电子转移解离、电子捕获解离和紫外光解离）进行分析29。对于生理 pH 值为 7.40 的 aSyn，适用的时间点范围为 50 毫秒至 300 秒，因为这些时间点覆盖了完整的氘摄取曲线8。

5. 数据处理

  1. 从肽段作图实验中加载已进行光谱归属的肽段文件。在 DynamX 软件中打开 文件 菜单，然后点击 打开（参见 材料表）。
  2. 将原始文件导入首选的质量检测软件（例如 DynamX、HDExaminer 等）。打开 "数据" 菜单，点击 MS 文件。点击 新建状态，为所研究的每种蛋白质条件创建对应的状态。
    1. 点击 新建氘代时间点，以添加每个氢氘交换时间点。点击 新建 RAW 以导入 .raw 文件。将每个 .raw 文件拖动至正确位置。完成后点击 确定。
  3. 首先自动进行同位素归属（此步骤在上述 5.2 步骤后自动完成），然后手动校正同位素归属，以确保数据质量高。
  4. 将聚类数据导出为 .csv 文件，列的顺序如下：蛋白质名称、序列起始位置编号、序列终止位置编号、序列、修饰、片段、最大可能摄取量、单一同位素物种质量、状态名称、暴露时间、文件名、电荷、保留时间、强度和质心质量。
  5. 在质量检测软件中打开 数据 菜单，点击 导出聚类数据。

6. 数据分析

  1. 将导出的聚类数据载入首选的氢氘交换（HDX）分析软件中。此处使用 HDfleX30（参见材料表）。
  2. 对所有肽段和状态的实验数据进行拟合，选择适当的回交换校正方法，以获得氢氘交换反应的观测速率常数。
  3. 采用首选方法计算全局显著性阈值（HDfleX 支持多种选项），并执行混合显著性检验，以确定所比较状态间的显著差异31,32。
    注意：若观测到的差异大于全局阈值，且 p 值小于所选置信水平（例如 95%），则认为该差异具有显著性。

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结果

由于α-突触核蛋白（aSyn）本身具有内在无序的特性，因此在生理pH条件下捕捉其复杂的结构变化十分困难。氢-氘交换质谱法（HDX-MS）通过监测蛋白质骨架酰胺氢的同位素交换，来研究蛋白质的构象动态及其相互作用，是少数能够在高空间和时间分辨率下获取此类信息的技术之一。本方案广泛适用于多种蛋白质和缓冲条件，文中通过在两种不同溶液条件下（即步骤2.1–2.2中定义的State A和State B8）测量aSyn的交换动力学，对此进行了示例说明。

首先，对aSyn进行了映射实验，并获得了肽段覆盖图谱，如图1所示。该图谱覆盖了蛋白质序列的100%，平均冗余度为3.79。100%的覆盖度表明蛋白质中的所有氨基酸均在蛋白质消化产物中被检测到，从而能够对aSyn的氢氘交换行为进行全面分析。冗余度值表示重叠肽段的数量。较高的冗余度值可在对重叠肽段数据进行减法展平后，提高最终图谱的结构分辨率32。

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讨论

本文描述了以下实验步骤：（1）对单体 aSyn 进行肽段图谱分析，以获得最高的序列覆盖率；（2）在生理条件下对单体 aSyn 获取毫秒级的 HDX-MS 数据；（3）对所得 HDX-MS 数据进行分析与解读。所提供的实验流程通常易于操作，每次标记实验（包含三个重复和八个时间点）通常仅需约 8 小时，而肽段图谱实验仅需约 2 小时。鉴于所使用的仪器完全自动化，完整数据集可在一天内完成采集。然而，在样品处理和缓冲液配制过程中，必须格外注意确保测量结果来源于处于目标状态下的弱稳定性蛋白（或蛋白区域）。重要的是，先前的研究表明，不同的储存条件（如冷冻和冻干）会导致 aSyn 单体形成不同的构象体，因此表征样品处理对 aSyn 单体构象集合的潜在影响至关重要10。事实上，HDX-MS 对此类构象扰动具有高度敏感性，其动态范围可从微秒级持续至至少数月。此外，若仅严格研究 aSyn 单体，则强烈建议进行过滤，以去除样品在储存或操作过程中可能形成的非目标寡聚体和纤维。同时，HDX-MS 所用缓冲液的 pH 或 pD 必须严格控制在目标值的 ±0.05 范围内，因为任何偏差都会显著影响氢氘交换的本征速率，从...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

NS 由大学理事会钻石禧年奖学金资助。JJP 受英国研究与创新署未来领袖奖学金支持 [资助编号：MR/T02223X/1]。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 色谱柱 Waters Corporation186002346分析柱
乙腈 HPLC 级 >99.9% HiPerSolvVWR20060.420用于液相色谱流动相
CaCl2Sigma AldrichC5670用于氢氘交换缓冲液的盐
ChronosAxel Semrau（购自 Waters Corporation）667006090调度软件，可自动实现多次氢氘交换-质谱（HDX-MS）样品进样。其他厂商也提供替代软件，例如 HDXDirector 或 LEAP Shell
氯化氘Goss Scientific（Cambridge Isotope Laboratories）DLM-2-50用于氢氘交换标记缓冲液
重水（99.9% D2O）Goss Scientific（Cambridge Isotope Laboratories）DLM-4氘代水
DynamX 3.0Waters Corporation176016027同位素归属与氘掺入量计算
Enzymate BEH 胃蛋白酶柱Waters Corporation186007233胃蛋白酶消化柱
甲酸，99.0% LC/MS 级Fisher Scientific10596814用于液相色谱流动相
盐酸胍Sigma AldrichRDD001-500G变性剂/促溶剂
HDfleX埃克塞特大学N/Ahttps://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KClSigma AldrichP3911用于氢氘交换缓冲液的盐
LEAP HDX-2 CTC PAL 取样机器人Waters Corporation725000637自动进样机器人
亮氨酸脑啡肽Waters Corporation186006013用于质谱锁喷校准
MassLynxWaters Corporation667004007控制进样方法和质谱仪的软件
最大回收小瓶Waters Corporation600000670CV每包100个，含瓶盖——用于 LEAP HDX-2 中的淬灭板
MgCl2Sigma AldrichM8266用于氢氘交换缓冲液的盐
Millipore 0.22 µm 注射器滤器MilliporeN9CA7069B注射器滤器
ms2minApplied Photophysics LtdN/A快速混合淬灭-流动毫秒级氢氘交换仪器
NaClSigma AldrichS9888用于氢氘交换缓冲液的盐
Peltier 温度控制器LEAP Technologies Inc.HP115-COOL/DPeltier 控制器，用于精确设定 LEAP 机器人中各腔室的温度
ProteinLynx Global Server 3.0Waters Corporation715001030肽段鉴定软件。其他厂商也提供替代软件。
试剂瓶盖Waters Corporation186004632每包100个
LEAP HDX-2 用试剂瓶Waters Corporation186001420每包100个，不含瓶盖——用于 LEAP HDX-2 中的缓冲液
氘氧化钠（99.5% 溶于 D2O）Goss Scientific（Cambridge Isotope Laboratories）DLM-57用于氢氘交换标记缓冲液
离心过滤管（3 kDa 截留分子量）Amicon（Merck Sigma Aldrich）UFC5003微量离心管，用于蛋白质浓缩。有助于缓冲液置换和氢氘交换-质谱实验中的精确上样
Synapt G2-Si 质谱仪Waters Corporation176850035质谱仪
完全回收小瓶Waters Corporation600000671CV每包100个，含瓶盖——用于 LEAP HDX-2 中的标记板
Tris-HClSigma AldrichT3253-250G缓冲液
Trizma 碱Sigma AldrichT60040-B2005缓冲液
尿素Sigma AldrichU5378-1KG变性剂/促溶剂
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 色谱柱 Waters Corporation186004623捕获脱盐柱

参考文献

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