单体α-突触核蛋白的结构集合影响其生理功能和理化性质。本方案描述了如何在生理条件下，对这种内在无序蛋白的单体进行毫秒级氢/氘交换质谱分析及后续数据处理，以获得其构象信息。
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本文内容
摘要
摘要
α-突触核蛋白（aSyn）是一种内在无序蛋白，其纤维状聚集体在路易小体和路易神经突中大量存在，而这些结构是帕金森病的典型病理特征。然而，该蛋白的许多生物学功能及其聚集过程在很大程度上均涉及其可溶性单体形式。要阐明aSyn生物学与病理生理学的分子机制，需要具有高分辨率的结构研究方法，并且对生物条件高度敏感。由于aSyn天然呈非折叠的亚稳态结构，使得单体形式的aSyn难以适用于多数结构生物学技术。本文介绍其中一种方法的应用：在毫秒时间尺度上对热力学稳定性较低且保护因子较弱的蛋白质（如aSyn）进行氢/氘交换质谱（HDX-MS）分析。在毫秒时间尺度下，HDX-MS数据包含了关于aSyn溶剂可及性和氢键结构的信息，而这些信息在较长标记时间下会丢失，最终可实现氨基酸水平的结构解析。因此，HDX-MS能够在高空间和时间分辨率下提供有关构象动力学与热力学、分子内及分子间相互作用，以及突变或环境条件改变对结构影响的信息。本文虽强调其广泛适用性，但重点演示了如何获取、分析和解读单体aSyn的毫秒级HDX-MS测量数据。
引言
帕金森病（PD）是一种影响全球数百万人的神经退行性疾病1。该病的特征是在脑部黑质致密带区域形成称为路易小体和路易神经突的胞质包涵体。这些胞质包涵体被发现含有内在无序蛋白aSyn的聚集物2。在帕金森病及其他突触核蛋白病中，aSyn会从可溶性的无序状态转变为不溶性的高度有序致病状态。在天然状态下，单体形式的aSyn通过其N端与C端之间的长程静电相互作用以及C端与非淀粉样β组分（NAC）区域之间的疏水相互作用，形成多种稳定的构象3,4,5,6。任何对这些稳定相互作用的干扰，例如突变、翻译后修饰或局部环境的变化，都可能导致单体错误折叠，从而引发聚集过程7。
尽管目前已有大量关于aSyn的寡聚体和纤维形式的研究8,9,10,11，但对aS....
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方案
1. aSyn 蛋白的表达与纯化
- 按照先前发表的文献方法制备 aSyn9。
- 透析至安全储存缓冲液中（例如 Tris，pH 7.2）。
- 如有需要，浓缩样品（例如，使用 3 kDa 截留分子量的离心滤管，在 14,000 × g 条件下离心约 10–30 分钟，参见材料表）。
注意：建议不要过度浓缩。aSyn 单体混合物的完整性在浓度超过 25 µM 时尚未得到验证。 - 分装后于 −80 °C 保存
注意：在上述储存条件下，aSyn 单体蛋白可稳定保存长达 1 年。
2. HDX 缓冲液的制备
注意：由于Tris具有较高的温度系数，需要根据HDX反应进行时的温度（本方案中为20 °C）对pH测量值进行校正。
- 通过将0.002 mol Tris溶解于100 mL LC-MS级水中，配制用于状态A和状态B的平衡缓冲液。对于状态B，向Tris缓冲液中加入29.8 mg KCl、14.2 mg MgCl2、36.8 g CaCl2和836 mg NaCl。调节pH至....
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结果
由于其内在无序的特性，在生理 pH 条件下捕捉 α-突触核蛋白（aSyn）复杂的结构变化十分困难。氢氘交换质谱（HDX-MS）通过监测蛋白质骨架酰胺氢的同位素交换，可探测蛋白质的构象动态及其相互作用，是少数能够在高空间和时间分辨率下获取此类信息的技术之一。本方案广泛适用于多种蛋白质和缓冲体系条件，文中通过在两种不同溶液条件下（状态 A 和状态 B）测量 aSyn 的交换动力学，对此进行了示例验证。8，如步骤 2.1–2.2 中所定义
首先，对 aSyn 进行了映射实验，并获得了肽段覆盖图谱，如图1所示。该图谱覆盖了蛋白质序列的100%，平均冗余度为3.79。100%的覆盖度表明蛋白质中的所有氨基酸均在蛋白质消化产物中被检测到，从而能够对 aSyn 的氢氘交换行为进行全面分析。冗余度值表示重叠肽段的数量。较高的冗余度值可提高最终图谱的结构分辨率，前提是针对重叠肽段的数据进行减法展平处理32。
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讨论
本文描述了以下实验步骤：（1）对单体 aSyn 进行肽段图谱分析，以获得最高的序列覆盖率；（2）在生理条件下对单体 aSyn 获取毫秒级的 HDX-MS 数据；（3）对所得 HDX-MS 数据进行分析与解读。所提供的实验流程通常易于操作，每次标记实验（包含三个重复和八个时间点）通常仅需约 8 小时，而肽段图谱实验仅需约 2 小时。鉴于所使用的仪器完全自动化，完整数据集可在一天内完成采集。然而，在样品处理和缓冲液配制过程中，必须格外注意确保测量结果来源于处于目标状态下的弱稳定性蛋白（或蛋白区域）。重要的是，先前的研究表明，不同的储存条件（如冷冻和冻干）会导致 aSyn 单体形成不同的构象体，因此表征样品处理对 aSyn 单体构象集合的潜在影响至关重要10。事实上，HDX-MS 对此类构象扰动具有高度敏感性，其动态范围可从微秒级持续至至少数月。此外，若仅严格研究 aSyn 单体，则强烈建议进行过滤，以去除样品在储存或操作过程中可能形成的非目标寡聚体和纤维。同时，HDX-MS 所用缓冲液的 pH 或 pD 必须严格控制在目标值的 ±0.05 范围内，因为任何偏差都会显著影响氢氘交换的本征速率，从.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
NS 由大学理事会钻石禧年奖学金资助。JJP 受英国研究与创新署未来领袖奖学金支持 [资助编号：MR/T02223X/1]。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 色谱柱 | Waters Corporation | 186002346 | 分析柱 |
| 乙腈 HPLC 级 >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | 用于液相色谱流动相 |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | 用于氢氘交换缓冲液的盐 |
| Chronos | Axel Semrau（购自 Waters Corporation） | 667006090 | 调度软件，可自动实现多次氢氘交换-质谱（HDX-MS）样品进样。其他厂商也提供替代软件，例如 HDXDirector 或 LEAP Shell |
| 氯化氘 | Goss Scientific（Cambridge Isotope Laboratories） | DLM-2-50 | 用于氢氘交换标记缓冲液 |
| 重水（99.9% D2O） | Goss Scientific（Cambridge Isotope Laboratories） | DLM-4 | 氘代水 |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | 同位素归属与氘掺入量计算 |
| Enzymate BEH 胃蛋白酶柱 | Waters Corporation | 186007233 | 胃蛋白酶消化柱 |
| 甲酸，99.0% LC/MS 级 | Fisher Scientific | 10596814 | 用于液相色谱流动相 |
| 盐酸胍 | Sigma Aldrich | RDD001-500G | 变性剂/促溶剂 |
| HDfleX | 埃克塞特大学 | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | 用于氢氘交换缓冲液的盐 |
| LEAP HDX-2 CTC PAL 取样机器人 | Waters Corporation | 725000637 | 自动进样机器人 |
| 亮氨酸脑啡肽 | Waters Corporation | 186006013 | 用于质谱锁喷校准 |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | 控制进样方法和质谱仪的软件 |
| 最大回收小瓶 | Waters Corporation | 600000670CV | 每包100个，含瓶盖——用于 LEAP HDX-2 中的淬灭板 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | 用于氢氘交换缓冲液的盐 |
| Millipore 0.22 µm 注射器滤器 | Millipore | N9CA7069B | 注射器滤器 |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | 快速混合淬灭-流动毫秒级氢氘交换仪器 |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | 用于氢氘交换缓冲液的盐 |
| Peltier 温度控制器 | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier 控制器，用于精确设定 LEAP 机器人中各腔室的温度 |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | 肽段鉴定软件。其他厂商也提供替代软件。 |
| 试剂瓶盖 | Waters Corporation | 186004632 | 每包100个 |
| LEAP HDX-2 用试剂瓶 | Waters Corporation | 186001420 | 每包100个，不含瓶盖——用于 LEAP HDX-2 中的缓冲液 |
| 氘氧化钠（99.5% 溶于 D2O） | Goss Scientific（Cambridge Isotope Laboratories） | DLM-57 | 用于氢氘交换标记缓冲液 |
| 离心过滤管（3 kDa 截留分子量） | Amicon（Merck Sigma Aldrich） | UFC5003 | 微量离心管，用于蛋白质浓缩。有助于缓冲液置换和氢氘交换-质谱实验中的精确上样 |
| Synapt G2-Si 质谱仪 | Waters Corporation | 176850035 | 质谱仪 |
| 完全回收小瓶 | Waters Corporation | 600000671CV | 每包100个，含瓶盖——用于 LEAP HDX-2 中的标记板 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | 缓冲液 |
| Trizma 碱 | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | 缓冲液 |
| 尿素 | Sigma Aldrich | U5378-1KG | 变性剂/促溶剂 |
| VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 色谱柱 | Waters Corporation | 186004623 | 捕获脱盐柱 |
参考文献
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N.
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重印与许可
