DiI染料填充作为一种简单且经济的工具用于可视化纤毛感觉神经元 秀丽隐杆线虫

摘要

DiI染料填充是一种常用的方法 秀丽隐杆线虫 用于可视化部分纤毛感觉神经元，从而识别影响感觉神经元结构或功能的遗传突变。

摘要

C. elegans 长期以来被用作一种简单且易于操作的模型，用于研究神经元结构及神经系统的多种功能。在成年雌雄同体的302个神经元中，有60个被归类为具有纤毛的感觉神经元。这些神经元在 C. elegans 的多种行为中起核心作用，包括但不限于化学感应、机械感应和渗透压感应、雄性交配以及dauer形成。几十年来，C. elegans 研究领域内的研究人员一直使用红色荧光脂溶性染料DiI来观察直接暴露于外界环境的一类纤毛感觉神经元。该染料可进入神经元的纤毛末端，并相对均匀地分布于树突、胞体和轴突中。这一简单而强大的方法是筛选影响纤毛感觉神经元结构或功能缺陷的遗传突变体的理想初筛工具。本文介绍了一种优化的染色方法，用于可视化 C. elegans 中暴露于环境的八对纤毛神经元（amphid）和两对尾纤毛神经元（phasmid）。我们还探讨了在麻醉动物中使用这一低成本方法进行细胞染料填充模式成像的操作技巧。

引言

Caenorhabditis elegans（C. elegans）易于操作，繁殖周期短，且维持成本低。由于这些及其他诸多优势，C. elegans 已成为研究多种生物学过程的首选模式生物，尤其是神经系统发育与功能的研究。《神经遗传学杂志》（Journal of Neurogenetics）最近专门出版了一期特刊，探讨该领域研究的历史性影响¹。它们在研究初级纤毛功能方面尤其具有优势，因为初级纤毛参与感知化学和物理环境条件²。

成年雌雄同体 C. elegans 共有 302 个神经元，其中 60 个神经元在其树突末梢具有初级纤毛³。这 60 个具纤毛的神经元被归类为感觉神经元，参与多种 C. elegans 行为，包括但不限于化学感应、机械感应和渗透压感应、雄性交配以及滞育幼虫形成^3,4。其中有两类暴露于外界环境的感觉神经元，分别是头部的 16 个纤毛鞘神经元（8 对）和尾部的 4 个尾纤毛神经元（2 对）^3,5。....

方案

1. 溶液的配制

1. 配制漂白溶液。在15 mL离心管中加入2 mL漂白剂、500 µL 10 M NaOH和7.5 mL去离子水（dH₂O）。
   注意：漂白溶液在室温（RT）下保存可稳定长达1周。
2. 配制M9缓冲液。将3 g KH₂PO₄、6 g Na₂HPO₄和5 g NaCl溶于1 L无菌水中，经高压灭菌处理以灭菌。待其完全冷却至室温后，加入1 mL无菌的1 M MgSO₄。
3. 配制DiI储备液。将10 mg DiI加入5 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，得到终浓度为2 mg/mL的DiI DMF溶液。DiI对光敏感，因此溶液需始终用铝箔包裹避光。DiI的DMF溶液可在-20 °C长期保存，使用时无需解冻。
   警告：DMF具有可燃性，且接触皮肤或吸入时有害。操作该溶液时应在化学通风橱内进行，远离明火，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

2. 通过漂白处理分离同步化群体

注意：在开始之前，收集该流程所有步骤所需的全部设备和溶液。次氯酸钠溶液的配制对时间非常敏感，因此在开始前备齐所需材料可确保实验方案顺利进行。

结果

成年N2线虫在染料填充后24小时进行成像，结果显示双侧头感器神经元（图1A，A'）和尾感器神经元（图1D，D'）中荧光信号清晰，且分布相对均匀。在这些动物中，头感器神经元的树突投射和细胞体可被清晰区分。树突投射中无染料聚集现象，染料填充的神经元各部分均未出现荧光信号中断。在尾感器神经元中，细胞体也可被清楚识别，尽管其树突投射的信号通常比头感器更弱。这可能是由于使用DiI染色时，被标记的尾感器神经元数量较少所致^3,5。综合这些结果表明，染料能够成功进入暴露于外部环境的纤毛感觉神经元，并均匀扩散至细胞的所有结构中。

当对携带两个基因突变（bbs-5 和 nphp-4）导致纤毛功能障碍.......

讨论

成功的染色填充依赖于对动物发育阶段、遗传背景以及成像前经过时间的仔细考量。某些基因突变会破坏暴露在外的感觉纤毛神经元的结构和/或功能，导致动物无法正常进行染色填充。因此，对新的 C. elegans 突变体进行染色填充可作为初步筛选感觉神经元结构或功能缺陷的简便方法。然而，该技术的一个局限性在于，它无法用于确定感觉神经元中存在何种类型的缺陷。因此，对于新发现的染色填充缺陷，应结合行为分析实验以评估感觉神经元功能，并利用转基因报告基因系统来鉴定可能存在的结构缺陷。

在为动物进行染料填充做准备时，正确的同步化是实验方案中的关键步骤，以确保在相似发育阶段的动物之间进行比较。通过漂白法进行年龄同步化是秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域常用的方法。该方法可从产卵期成虫中分离出受精胚胎，且在短时间暴露条件下，胚胎的卵壳能够保护其免受漂白剂的有害影响¹⁴。然而，在漂白阶段（步骤2.5）必须密切观察动物，因为仍有可能发生过度漂白，导致胚胎以及产卵期成虫的降解。若所使用的品系存在产卵缺陷（某些纤毛功能异常的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DiI	Biotium	60010	不溶于水，用DMF配制成2 mg/mL溶液。溶液对光敏感，需用铝箔包裹。于-20 °C保存。溶液可长期保存多年。
盐酸左旋咪唑	Fisher	AC187870100	用M9缓冲液配制成10 mM溶液。于-20 °C保存。溶液可长期保存多年。
M9缓冲液	IPM Scientific	11006-517	可直接购买，也可根据方案中的配方自行配制。
N2 (C. elegans品系)	CGC	N2	秀丽隐杆线虫野生型分离株
YH2125 (C. elegans品系)	n/a	n/a	由Yoder实验室构建（Bentley-Ford等，2021）