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DiI染料填充作为一种简单且经济的工具用于可视化纤毛感觉神经元 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/64052

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2025年3月21日

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1Biology Department, Southern Oregon University

通讯作者： Melissa LaBonty <labontym@sou.edu>

本文内容

摘要

DiI染料填充是一种常用的方法 秀丽隐杆线虫 用于可视化部分纤毛感觉神经元，从而识别影响感觉神经元结构或功能的遗传突变。

摘要

C. elegans 长期以来被用作一种简单且易于操作的模型，用于研究神经元结构及神经系统的多种功能。在成年雌雄同体的302个神经元中，有60个被归类为具有纤毛的感觉神经元。这些神经元在 C. elegans 的多种行为中起核心作用，包括但不限于化学感应、机械感应和渗透压感应、雄性交配以及dauer形成。几十年来，C. elegans 研究领域内的研究人员一直使用红色荧光脂溶性染料DiI来观察直接暴露于外界环境的一类纤毛感觉神经元。该染料可进入神经元的纤毛末端，并相对均匀地分布于树突、胞体和轴突中。这一简单而强大的方法是筛选影响纤毛感觉神经元结构或功能缺陷的遗传突变体的理想初筛工具。本文介绍了一种优化的染色方法，用于可视化 C. elegans 中暴露于环境的八对纤毛神经元（amphid）和两对尾纤毛神经元（phasmid）。我们还探讨了在麻醉动物中使用这一低成本方法进行细胞染料填充模式成像的操作技巧。

引言

Caenorhabditis elegans（C. elegans）易于操作，繁殖周期短，且维持成本低。由于这些及其他诸多优势，C. elegans 已成为研究多种生物学过程的首选模式生物，尤其是神经系统发育与功能的研究。《神经遗传学杂志》（Journal of Neurogenetics）最近专门出版了一期特刊，探讨该领域研究的历史性影响1。它们在研究初级纤毛功能方面尤其具有优势，因为初级纤毛参与感知化学和物理环境条件2。

成年雌雄同体 C. elegans 共有 302 个神经元，其中 60 个神经元在其树突末梢具有初级纤毛3。这 60 个具纤毛的神经元被归类为感觉神经元，参与多种 C. elegans 行为，包括但不限于化学感应、机械感应和渗透压感应、雄性交配以及滞育幼虫形成3,4。其中有两类暴露于外界环境的感觉神经元，分别是头部的 16 个纤毛鞘神经元（8 对）和尾部的 4 个尾纤毛神经元（2 对）3,5。

几十年来，秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域的科研人员一直使用亲脂性染料，例如红色荧光染料1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI），在活体动物中对多种不同组织进行可视化观察6,7,8,9。当线虫接触DiI时，该染料会迅速且容易地嵌入20个暴露于体外的纤毛神经元（包括耳状神经节和尾感神经节）的树突、轴突和胞体膜中，并呈现相对均匀的分布。在野生型线虫中，通过荧光成像可在较宽的时间窗口内观察到这些神经元中的染料信号。如果初级纤毛存在任何形态或功能异常，染料可能无法正常填充神经元，导致部分或全部细胞的信号减弱，甚至完全缺失6,7,10,11。上述任何一种结果均可提示遗传变异体中纤毛感觉神经元可能存在的结构或功能缺陷。

本文旨在展示利用染料填充技术在C. elegans中可视化纤毛感觉神经元结构的简便性（图1）。我们将在野生型和突变型线虫中应用该技术，以说明不同遗传背景如何表现出多样的染料填充结果，这些结果通常与其纤毛感觉神经元的结构或功能完整性相关。我们展示了染料填充后30分钟、24小时和48小时的染色效果，并涵盖多种不同年龄的线虫，以帮助确定活体成像的最佳时间进程。此外，我们还列举了染色和成像过程中可能出现的问题，并提供了避免这些问题的实用建议。通过使用该方法，无论规模大小的研究机构均可进一步拓展C. elegans纤毛感觉神经元生物学的研究基础。染料填充技术操作简单、成本低廉，可被纳入本科生实验课程，使其在无需复杂技术背景的前提下即可开展C. elegans和荧光显微镜的相关实验。此外，人类与C. elegans在初级纤毛生物学相关基因，以及更广泛的感觉神经元功能基因方面具有显著的保守性12。持续开展C. elegans中纤毛相关基因功能及其遗传互作的研究，最终有望加深我们对人类纤毛病复杂性的理解13。

方案

1. 溶液的配制

  1. 配制漂白溶液。在15 mL离心管中加入2 mL漂白剂、500 µL 10 M NaOH和7.5 mL去离子水（dH2O）。
    注意：漂白溶液在室温（RT）下保存可稳定长达1周。
  2. 配制M9缓冲液。将3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4和5 g NaCl溶于1 L无菌水中，经高压灭菌处理以灭菌。待其完全冷却至室温后，加入1 mL无菌的1 M MgSO4。
  3. 配制DiI储备液。将10 mg DiI加入5 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，得到终浓度为2 mg/mL的DiI DMF溶液。DiI对光敏感，因此溶液需始终用铝箔包裹避光。DiI的DMF溶液可在-20 °C长期保存，使用时无需解冻。
    警告：DMF具有可燃性，且接触皮肤或吸入时有害。操作该溶液时应在化学通风橱内进行，远离明火，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

2. 通过漂白处理分离同步化群体

注意：在开始之前，收集该流程所有步骤所需的全部设备和溶液。次氯酸钠溶液的配制对时间非常敏感，因此在开始前备齐所需材料可确保实验方案顺利进行。

  1. 用 1 mL M9 缓冲液将未饥饿、带有卵的成年线虫从培养板上冲洗下来。通过轻微倾斜培养板，使线虫聚集在板的一侧。
    注意：通常建议收集约 50–100 条未饥饿、带有卵的成年线虫，以获得可靠的卵产量。然而，几乎任意数量的带卵成虫均可用于次氯酸钠处理。可用于收集的带卵成虫数量因动物的遗传背景不同而有较大差异。收集的动物数量越多，通常获得的卵也越多。
  2. 使用玻璃巴斯德吸管，将含有线虫的 M9 缓冲液收集并转移至已标记的 1.5 mL 微量离心管中。
  3. 以 350 g 离心 30 秒。该转速足以使活体线虫沉降到管底，同时不会对其造成损伤。
  4. 倾去大部分多余的 M9 缓冲液，保留管底的线虫不受扰动。
  5. 加入 1 mL 配制好的次氯酸钠溶液，使线虫悬浮于溶液中，直至其开始解体。定期倒置离心管以促进组织裂解。通过体视显微镜定期观察组织裂解及卵的释放情况。该过程通常需要 5 至 10 分钟。
  6. 当管中主要为已释放的卵，仅剩少量可见的线虫组织时，使用标准台式微量离心机以最大速度（通常为 15,000–21,000 g）离心 30 秒，使卵沉降到管底。
  7. 用玻璃吸管尽可能倾去次氯酸钠溶液，注意不要扰动沉淀的卵。加入 1 mL M9 缓冲液，以终止残留次氯酸钠对卵的降解作用。
    注意：步骤 2.6 和 2.7 应迅速完成。离心、去除次氯酸钠溶液及 M9 缓冲液洗涤的延迟可能导致卵产量降低，原因是卵会持续降解。
  8. 再次以 21,000 g 离心 30 秒，倾去上清液，注意不要扰动沉淀的卵。
  9. 再用 1 mL M9 缓冲液洗涤两次，每次洗涤后倾去液体，注意不要扰动沉淀的卵。
  10. 最后一次洗涤后，倾去大部分 M9 缓冲液，然后通过轻弹离心管或剧烈震荡，将卵重新悬浮于残留液体中。
  11. 使用无菌玻璃吸管，取一滴含卵的溶液转移至铺有 E. coli 的新鲜 NGM 培养板表面。尽量将液滴滴加在 E. coli 附近，每板约添加 100 个卵。这些卵的发育年龄大致同步。
    注意：若卵产量较高，导致每滴溶液中卵数超过 100 个，可向含卵的离心管中加入额外的 M9 缓冲液以稀释其浓度。

3. 染料填充步骤

  1. 根据需要染色的菌株数量，标记相应数量的1.5 mL微量离心管。为每根管子制作铝箔盖，以便在加入对光敏感的DiI溶液后避光。
  2. 使用约1 mL M9缓冲液，将同步化发育阶段的线虫从NGM平板上冲洗下来。确保每个平板上含有约100只线虫，这些线虫来自在漂白同步化过程中放置于平板上的100个卵。将收集的线虫转移至已正确标记的1.5 mL微量离心管中。
    注意：染料填充适用于多种发育阶段。本研究展示了从三龄幼虫（L3）到成虫（L3后48小时）阶段的线虫染料填充。
  3. 以350 g 离心30秒，使线虫沉降至管底。
  4. 倾去M9缓冲液，注意不要扰动沉降在管底的线虫。
  5. 再用1 mL M9缓冲液清洗两次，每次清洗后倾去液体，注意不要扰动已沉降的线虫。最后一次清洗时，倾去液体后保留约200 µL M9缓冲液在管中。
  6. 用铝箔包裹所有离心管以避光，并向每管的M9缓冲液中直接加入1 µL DMF溶解的DiI染料。
    注意：若调整M9缓冲液和DiI的用量，请确保DiI在M9缓冲液中的比例保持为1:200。
  7. 在室温下轻轻摇动或振荡所有离心管，持续2小时。
  8. 以350 g 离心30秒，使线虫沉降至管底。
  9. 倾去含有DiI的液体，用M9缓冲液清洗三次，每次清洗后均需倾去液体。
  10. 最后一次清洗并倾去液体后，将线虫以少量（约50 µL）M9缓冲液转移至含有E. coli的新鲜NGM平板上。
  11. 染色后让线虫在新鲜NGM平板上恢复至少30分钟。观察前用铝箔覆盖平板，以保护DiI荧光染料。染料填充后24小时内观察，荧光信号无明显减弱；在48小时或更晚时，信号可能开始减弱（见图2）。

4. 成像染料填充

  1. 制备2%琼脂糖的无菌水溶液。使用微波炉彻底溶解琼脂糖。
    注意：2%琼脂糖水溶液可多次重复使用，直至因水分反复蒸发导致琼脂糖浓度过高而变得过于黏稠为止。
  2. 取玻璃载片和22 mm × 22 mm盖玻片以制备琼脂糖垫。用玻璃移液器将少量熔融的2%琼脂糖水溶液滴加至一张玻璃载片上，迅速将盖玻片覆盖在琼脂糖液滴上。待琼脂糖垫完全凝固后，移去盖玻片，使琼脂糖垫保留在玻璃载片上。
    注意：应避免在琼脂糖垫中产生气泡，因为气泡可能阻碍对生物体的成像。
  3. 在琼脂糖垫表面加入5–10 µL麻醉剂（10 mM 左旋咪唑）。将5–20只生物体转移至麻醉剂中，然后将盖玻片重新放回琼脂糖垫上。
  4. 根据可用设备及筛选和成像需求，使用体视、复合和/或共聚焦荧光显微镜观察生物体。DiI的激发峰为550 nm，发射峰为564 nm；因此，应使用与四甲基罗丹明/花青染料3/黄色荧光蛋白（TRITC/Cy3/YFP）兼容的滤光片组进行观察。
    注意：获得清晰染料填充图像所需的合适显微镜设置（如曝光时间、增益和激光功率）可能因显微镜类型不同而异，用户应根据自身具体需求独立确定最佳参数。

结果

成年N2线虫在染料填充后24小时进行成像，结果显示双侧头感器神经元（图1A，A'）和尾感器神经元（图1D，D'）中荧光信号清晰，且分布相对均匀。在这些动物中，头感器神经元的树突投射和细胞体可被清晰区分。树突投射中无染料聚集现象，染料填充的神经元各部分均未出现荧光信号中断。在尾感器神经元中，细胞体也可被清楚识别，尽管其树突投射的信号通常比头感器更弱。这可能是由于使用DiI染色时，被标记的尾感器神经元数量较少所致3,5。综合这些结果表明，染料能够成功进入暴露于外部环境的纤毛感觉神经元，并均匀扩散至细胞的所有结构中。

当对携带两个基因突变（bbs-5 和 nphp-4）导致纤毛功能障碍的 YH2125 品系成虫在染料填充后 24 小时进行成像时，可观察到多种结果。每种结果的出现频率已在先前的研究中确定10。在大多数动物中（约 60%），染料似乎仅进入部分 amphid 感觉器官（图 1B，B'）。该现象被称为部分染料填充，通常还表现为染料聚集（白色箭头，图 1B）、荧光信号不均，甚至 amphid 某些区域完全缺乏荧光信号。在少数动物中（约 10%），染料无法进入任何 amphid 神经元，导致完全无荧光信号，称为染料填充缺陷（图 1C，C'）。在评估 YH2125 成虫 phasmid 神经元的染料填充情况时，仅观察到两种结果之一。约一半的动物表现出正常的染料填充，类似于 N2 成虫。其余一半动物则显示荧光信号缺失，提示存在染料填充缺陷（图 1E，E'）。本实验室未观察到 phasmid 神经元的部分染料填充现象，因此该情况未包含在本图中。观察到的 phasmid 染料填充缺陷频率高于 amphid 染料填充缺陷频率，表明在同一动物中，可能在完全没有 phasmid 染料填充的情况下仍出现部分或完全的 amphid 染料填充10。这些结果代表了染料填充功能受损，可能提示纤毛感觉神经元结构或功能存在缺陷。此类结果通常会进一步通过实验来评估感觉神经元功能的变化（如趋化性实验）以及感觉神经元结构的变化（如荧光报告基因分析）。

在染料填充后连续数天对同步化的 N2 动物群体进行成像，有助于确定最佳分析时间点。染色后仅 30 分钟，动物体内的荧光信号即强且分布均匀（图 2A）。染料填充后 24 小时成像显示，与第一天的动物相比，荧光信号几乎没有减弱（图 2B）。只有在 48 小时后，才能检测到明显的荧光信号减弱（图 2C）。图 2 还表明，染料填充在多个年龄阶段均可见，包括 L3 期（图 2A，A'）、L4 期（L3 后 24 小时，图 2B，B'）和年轻成虫期（L3 后 48 小时，图 2C，C'）。另一组染料填充实验证实，较长恢复期中观察到的荧光信号减弱并非由 C. elegans 的发育变化所致。在这些实验中，分别对处于 L3、L4 和年轻成虫期（L3 后 48 小时）的年龄同步化动物进行染料填充，并在成像前恢复 30 分钟。结果在 L3（图 3A，A'）、L4（图 3B，B'）和成虫（图 3C，C'）动物中，恢复 30 分钟后的荧光信号水平相似。

建议在染料填充后24小时进行成像，以避免在较早时间点（尤其是在染色后30分钟）可能出现的不良结果。此时， amphid 和 phasmid 的荧光信号有时会被肠道中观察到的荧光信号遮蔽或掩盖（L3，图4A，A'；L4，图4B，B'）。该肠道荧光信号源于染色过程中对染料的摄取，而在染色后静置24小时，由于染料已被排出，该信号更有可能消失。

N2和YH2125突变体的荧光显微镜观察，显示感杆体和尾感器，并与明场图像对比。
图1染料填充 秀丽隐杆线虫 根据遗传背景的不同而产生不同的结果。 (A-E染料填充后24小时成像（A,A'N2 感觉神经元，（B,B',C,C') YH2125 双侧头感神经元，(D,D') N2 噬菌体神经元，以及 (E,E') YH2125 仿足虫神经元。白色箭头（B) 表示DiI染料在树突中的聚集。上方图显示DiI荧光信号，下方图为明场成像。所有图中动物的前端均朝左。本图所示所有动物均处于成虫阶段（L4后48小时）。比例尺代表 30 µm （双颈感器）和 45 µm （质粒） 请点击此处以查看此图的放大版本。

48小时内荧光与明场显微镜观察样本，显示渐进性变化。
图2：同步染料填充的动物中荧光信号随时间逐渐减弱。 L3期染料填充的N2动物在（A，A'）30分钟、（B，B'）24小时（L4期）和（C，C'）48小时（年轻成虫期）后的成像结果。上方图显示DiI荧光信号，下方图为明场成像。所有图中动物的前端均朝左。比例尺为30 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

线虫在L3、L4和成虫阶段的荧光与明场显微镜图像；发育研究。
图3：不同发育阶段中荧光信号强度保持一致。 N2动物经染料填充并恢复30分钟后，在（A，A'）L3阶段、（B，B'）L4阶段以及（C，C'）年轻成虫阶段的成像结果。上方图显示DiI荧光信号，下方图为明场成像。所有图中动物的前端均朝左。比例尺为30 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

线虫L3和L4阶段的荧光与明场图像；显微镜分析。
图4：染色后30分钟可在染料填充的线虫中观察到肠道荧光。在N2品系线虫染色后30分钟进行成像，分别为（A）L3阶段和（B）L4阶段。（A）左图显示DiI荧光信号，（A'）右图显示L3阶段的明场图像。（B）上图显示DiI荧光信号，（B'）下图显示L4阶段的明场图像。整个动物体在图A和A'中可见。在图B和B'中，动物体前端位于左侧。比例尺为30 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

成功的染色填充依赖于对动物发育阶段、遗传背景以及成像前经过时间的仔细考量。某些基因突变会破坏暴露在外的感觉纤毛神经元的结构和/或功能，导致动物无法正常进行染色填充。因此，对新的 C. elegans 突变体进行染色填充可作为初步筛选感觉神经元结构或功能缺陷的简便方法。然而，该技术的一个局限性在于，它无法用于确定感觉神经元中存在何种类型的缺陷。因此，对于新发现的染色填充缺陷，应结合行为分析实验以评估感觉神经元功能，并利用转基因报告基因系统来鉴定可能存在的结构缺陷。

在为动物进行染料填充做准备时，正确的同步化是实验方案中的关键步骤，以确保在相似发育阶段的动物之间进行比较。通过漂白法进行年龄同步化是秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域常用的方法。该方法可从产卵期成虫中分离出受精胚胎，且在短时间暴露条件下，胚胎的卵壳能够保护其免受漂白剂的有害影响14。然而，在漂白阶段（步骤2.5）必须密切观察动物，因为仍有可能发生过度漂白，导致胚胎以及产卵期成虫的降解。若所使用的品系存在产卵缺陷（某些纤毛功能异常的动物会表现出此类缺陷），则首选漂白法进行同步化10。对于无产卵缺陷的品系，若需采用另一种方法获得大致同步的群体，可将10只产卵期年轻成虫置于含大肠杆菌（E. coli）的NGM平板上数小时，待产下足够数量的卵后移除成虫。

染料填充后最早可在30分钟时进行成像，具体操作如染料填充阶段末尾所述（步骤3.11）。然而，动物在含有DiI染料的溶液中游动时可能摄入部分染料，导致染料除在神经元中定位外，还在肠道内聚集。这可能导致在染料填充后至少30分钟至数小时内，肠道中出现不希望的荧光信号（图4）。由于早期成像存在这一缺点，我们发现经过24小时恢复后，神经元的成像最为清晰，且无任何不良背景信号。在染料填充后的24小时内，染料的荧光信号仍保持明亮且相对均匀（图2）。

在恢复48小时后进行染料填充成像可能会产生不理想的结果。首先，DiI的荧光信号会随着时间逐渐减弱，使得染料标记的树突难以观察（图2）。该现象似乎并非由动物发育过程中的变化引起（图3），而可能是染料扩散、染料降解和荧光淬灭等因素共同作用的结果。其次，已知C. elegans在衰老过程中会逐渐产生肠道自发荧光15。这种自发荧光可通过与DiI相同的滤光片组（TRITC）检测到，从而干扰对染料填充神经元的识别。因此，建议在晚期幼虫阶段（L3或L4）或成虫早期的线虫中完成染料填充，因为这一发育阶段的个体体型适中，易于成像，且因衰老导致自发荧光的可能性最低。针对特定实验和教学应用选择合适的恢复时间是本实验方案中的另一个关键步骤，应由每位使用者根据具体情况独立确定。

现有的和替代的染料填充方法包括使用其他疏水性染料，例如异硫氰酸荧光素（FITC）和3,3́-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐（DiO）6,7。也可以通过采用不同的染色条件来改进染料填充方法，以标记较难标记的目标，例如六种IL2神经元8，或用于可视化其他类型的组织，例如角质层结构9。可根据可用设备选择不同类型的显微镜来观察染料填充效果。本文采用荧光复合显微镜，这是一种易于实现且成本较低的方法，仍可相对高分辨率地呈现染料填充模式。荧光体视显微镜适用于对大量活体动物进行快速、高通量的筛选，并可用于量化染料填充缺陷的发生频率。更高分辨率的成像技术，如共聚焦显微镜，可提供关于染料填充模式的更精确信息11。

总之，染料填充是一种成本低廉且易于实施的技术，因此特别适合在本科生物学课程中使用。此外，该技术对于由本科受训学生主导或刚进入C. elegans研究领域的研究人员来说，也具有很高的可操作性。无论是作为独立的实验课程，还是作为以C. elegans为基础的综合性研究项目中的一个步骤，染料填充都是理解纤毛感觉神经元中基本生理过程受扰机制的优良方法。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢南俄勒冈大学的 Nancy Shough 和 Cameron Brisbine。本工作得到了南俄勒冈大学为 M. LaBonty 提供的启动资金支持。部分 C. elegans 品系由线虫遗传学中心（CGC）提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室资助（P40 OD010440）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DiIBiotium60010不溶于水，用DMF配制成2 mg/mL溶液。溶液对光敏感，需用铝箔包裹。于-20 °C保存。溶液可长期保存多年。
盐酸左旋咪唑Fisher AC187870100用M9缓冲液配制成10 mM溶液。于-20 °C保存。溶液可长期保存多年。
M9缓冲液IPM Scientific11006-517可直接购买，也可根据方案中的配方自行配制。
N2 (C. elegans品系)CGCN2秀丽隐杆线虫野生型分离株
YH2125 (C. elegans品系)n/an/a由Yoder实验室构建（Bentley-Ford等，2021）

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