啮齿类动物心肌细胞收缩功能障碍与Ca2+瞬变的分析

摘要

本文介绍了一组通过检测分离大鼠心肌细胞的肌节长度并结合钙离子（Ca²⁺）瞬变测量来评估收缩功能的实验方案。同时包含了该方法在心力衰竭动物模型研究中的应用。

摘要

收缩功能障碍和 Ca²⁺ 瞬时反应常在细胞水平进行分析，作为评估心脏损伤和/或重构的综合指标的一部分。一种评估这些功能改变的方法是利用去负荷缩短和Ca²⁺ 成年大鼠心肌细胞的原代培养及瞬时分析。该方法通过胶原酶消化法分离成年心肌细胞，并使其达到钙²⁺ 耐受后，贴附于层粘连蛋白包被的盖玻片上，随后在无血清培养基中进行电刺激起搏。该通用方案采用成年大鼠心肌细胞，但可轻松调整用于其他物种的原代心肌细胞。可将损伤心脏来源心肌细胞的功能改变与假手术组心肌细胞和/或 体外 治疗性处理。该方法包含心肌细胞起搏所需的关键要素，以及细胞培养室和平台组件。此方法的详细操作流程包括通过肌节长度检测来测量无负荷缩短，以及细胞内钙离子²⁺ 使用比例荧光探针Fura-2 AM测量的瞬时信号，以及原始数据分析。

引言

分析心脏泵功能通常需要采用多种方法才能获得充分的认识，尤其是在心力衰竭（HF）的动物模型中。超声心动图或血流动力学测量可提供有关体内心脏功能障碍的见解¹，而体外方法则常用于判断功能障碍是否源于肌丝结构和/或负责将电兴奋（或动作电位）与收缩功能耦联的Ca²⁺瞬变（如兴奋-收缩[EC]耦联）的变化。此外，体外方法还可在开展成本高昂和/或耗时费力的体内治疗策略之前，用于筛选神经激素、载体诱导的基因改变以及潜在治疗药物的功能反应²。

有多种方法可用于研究 体外 收缩功能，包括完整小梁的心肌力测定³ 或透化的肌细胞⁴，以及无负荷缩短和 Ca²⁺ 完整心肌细胞中在有无心力衰竭情况下的瞬时变化^5,6每种方法均聚焦于心肌细胞的收缩功能，而心肌细胞的收缩功能直接决定了心脏的泵血功能。^2,7然而，对收缩和兴奋-收缩耦联的联合分析，通常通过测量肌....

方案

在大鼠上进行的研究遵循《公共卫生服务实验动物人道照护与使用政策》，并经密歇根大学机构动物照护与使用委员会批准。本研究中，心肌细胞取自3至34月龄、体重≥200 g的Sprague-Dawley和F344BN大鼠⁵。实验同时使用了雄性和雌性大鼠。

1. 心肌细胞起搏用于收缩功能研究

1. 每次分离心肌细胞时，均需配制新鲜的基于M199的培养基（材料表。起搏前1天，接种 2 x 10⁴ Ca²⁺耐受的杆状心肌细胞，置于22 mm² 如前所述，使用层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片（CSs）⁸.
2. 准备小室时，将每个小室浸泡于10%次氯酸钠溶液中1小时。随后用流动的自来水冲洗小室30至45分钟，再用蒸馏水每5分钟更换一次，持续30分钟，接着用去离子水每5分钟更换一次，持续30分钟，最后用去离子水彻底冲洗。
3. 将腔室置于洁净表面干燥 20–30 分钟（补充图 1A-C接下来，在生物安全柜中对培养室进行紫外照射处理，每个方向照射5分钟（总计20分钟）。此步骤不适用于预灭菌的培养室。
   注意：离开该区域以尽量减少紫外线暴露。
4. 移除培养室盖子，加入 3 ....

结果

从分离后的第二天（第2天）开始，直至分离后第4天，对大鼠心肌细胞进行收缩功能研究。尽管在细胞分离后的第一天（即第2天）即可进行记录，但在进行基因转导或处理以改变收缩功能时，通常需要更长的培养时间⁸。对于分离后培养超过18小时的心肌细胞，第1节中所述的起搏方案有助于维持横管结构以及稳定缩短和再伸长的结果。

用于缩短研究的心肌细胞CS样本的代表性部分如图1A所示，图中还显示了在设定感兴趣区域（ROI）之前位置适当的单个心肌细胞（图1B）。一旦确定ROI（图1C；粉色框），位于心肌细胞下方的算法信息也有助于在记录前优化心肌细胞的定位。具体而言，线性光密度（LOD；黑线）可反映肌节的数量和间距，而快速傅里叶变换曲线（FFT，红线）中清晰的功率谱有助于实现最佳对齐，以准确记录细胞的缩短与再伸长过程。用于肌节长度校准（及边缘检测）的标线图案如

讨论

步骤1中所述的慢性起搏方案延长了研究分离心肌细胞以及评估较长时间处理影响的有效时间。在本实验室中，使用慢性起搏心肌细胞通过肌节长度测量收缩功能时，分离后长达4天仍可获得稳定的结果。然而，若使用存放超过1周的培养基对心肌细胞进行起搏，其收缩功能会迅速下降。

在进行收缩功能研究时，数据采集在 37 °C 下进行，该温度接近大鼠的体温。为了优化心肌细胞的存活率，并获得每种心肌细胞一致的收缩曲线，这些实验的起搏频率需低于大鼠生理心率（约 5 Hz）。这些设置可产生一致的收缩功能数据，但如果在同一处理组心肌细胞的多个收缩系统（CS）中缩短轨迹保持一致，则可调整腔室温度和/或起搏频率。此外，选择无出芽样突起、完全贴附于收缩系统（CS）表面、且在杆状细胞两端均能收缩的心肌细胞可获得最佳结果。仅在一端贴附、具有多个出芽样突起和/或仅在一端收缩的心肌细胞不理想，通常由于背景运动而难以记录。在这些研究中，ROI 内应包含 ≥20 个肌节，以获得尖锐的功率谱峰、可重复的静息肌节长度，以及缩短轨迹的最优信噪比。如果功率谱峰仍保持尖锐，ROI 中可使用少至七个肌节。分离的大鼠心肌细胞的静息肌节长度通常在 2.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
媒体
牛血清白蛋白	Sigma（Roche）	3117057001	终浓度 = 0.2%（w/v）
谷胱甘肽	Sigma	G-6529	终浓度 = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	终浓度 = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 瓶配制 1 L；pH 7.45
NaHCO₃3	Sigma	S-8875	终浓度 = 4 mM
青霉素/链霉素	Fisher	15140122	终浓度 = 100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素
专用于 Ca 的试剂2+ 成像
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650
Fura-2AM	英吉特（Molecular Probes）	F1221	50 μg/瓶；  配制1 mM Fura-2AM和0.5 M丙磺舒的DMSO储备液；  培养基中Fura2-AM的最终浓度为  5 μM
丙磺舒	Invitrogen（Fisher）	P36400	将 7.2 mg 丙磺舒（0.5 M）加入 1 mM Fura-2AM 储存液中；培养基中的终浓度为 2.5 mM
大鼠心肌细胞起搏材料
#1 22  毫米2 玻璃盖玻片	康宁	2845-22
3根36英寸带香蕉插头的电缆	Pomona Electronics	B-36-2	补充图1，C面板
37oC 型培养箱  含95% O₂25% CO₂2	形态	3110	补充图1，E面板。  多种模型均适用
II 级 A/B3 型生物安全柜（带紫外灯）	形态	1286	多种模型均适用
镊子 - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
热珠灭菌器	Fine Science Tools	1800-45
低倍倒置显微镜	Leica	DM-IL	将显微镜放置在培养箱旁，以便在开始起搏及更换培养基后观察起搏心肌细胞的收缩情况；  推荐使用 4X 和 10X 物镜
起搏室	自定义		补充图1，图A。Ionoptix C-pace系统是一种可商业获得的替代方案，或参见 22
刺激器	Ionoptix	Myopacer	补充图1，D面板。
用于收缩功能和/或钙信号检测的材料2+ 成像分析			补充图2中的编号 &以及替代方案/推荐选项
钙的其他组分2+ 成像分析	Ionoptix	核心系统组件：-- 光子计数系统            --  具有双激发光源的氙灯电源            --  荧光界面	- 光子计数系统包含一个光电倍增管（PMT）和一个二向色镜，安装在CCD相机旁边  （图 A #4）                                                                      - 氙灯光源的电源（见图A #5和图C左侧）集成了双激发接口（340/380 nm）  激发和510 nm发射）如A部分#6所示。                                                                                                                                 - 计算机与荧光界面之间的连接  光源如图B中#12所示。
配备图像采集功能的CCD相机  硬件和软件（240 帧/秒）	Ionoptix	Myocam 配 CCD 控制器	补充图2，A部分#4展示了Myocam和CCD控制器  和  图A第5组 &以及面板 C #5（右侧），分别。  控制器与一台PC计算机系统集成（面板B #14）。
腔室刺激器	Ionoptix	Myopacer	图B，#13；替代方案：  草类模型 S48
盖玻片安装式灌流室	22 mm 专用培养室2 盖玻片、硅胶适配器及2-4枚2-4号菲利普斯圆头#0螺钉  （箭头，F 面板）		图A #10 &和图F；   培养箱温度校准至37oC 使用 TH-10Km 探针和 TC2BIP 温度控制器（参见温度控制器）。  商业替代方案：  Ionoptix FHD 或 C-stim 细胞  腔室；Cell MicroControls 细胞培养刺激系统
专用计算机 &用于功能/钙瞬变数据采集与分析的硬件和软件	Ionoptix	配备 Ionwizard 电路板及软件的 PC	图B，#14；使用IonWizard软件的SarcLen（肌节长度）或SoftEdge（心肌细胞长度）采集模块测量收缩功能。IonWizard软件还包含用于比率测量的PMT采集软件  Ca2+ Fura-2AM 负载心肌细胞的成像。 建议使用四柱式电子机架安装机柜及搁板来放置计算机和细胞刺激器。  钙荧光界面2+ 成像设备也放置在此柜中（见下文）。
镊子 - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	图 F
用于培养基的绝缘管架	定制		图A #9；该支架可使用泡沫塑料轻松组装 &以及一个预热的凝胶加热包以保持培养基温暖
倒置明场显微镜	尼康	TE-2000S	安装用于Ca2+成像的落射荧光旋转转盘（图A #2）。   建议使用深红色（590 nm）聚光镜滤光片，以尽量减少Ca成像过程中的荧光漂白2+ 成像
隔离台	TMC 振动控制	30 x 36 英寸	图A，#1；理想情况：  高架货架，法拉第屏蔽
显微镜目镜 &和目的	尼康	10倍CFI目镜，40倍水镜CFI Plan Fluor物镜	图A #3；40倍物镜：  n.a. 0.08；工作距离 2 mm。  在物镜周围安装了 Cell MicroControls HLS-1 物镜加热器（参见下方温度控制器）。          注意：  水浸物镜分配器现在也可用于水基物镜。
蠕动泵	Gilson	Minipuls 3	图A第8组和图E
小型称量舟	Fisher	08-732-112
温度控制器	细胞微控系统	TC2BIP	图A #7；图D。该温度控制器将盖玻片培养室加热至37oC.    建议为此平台配备预加热器和物镜加热器。  A Cell MicroControls HPRE2 预加热器和  HLS-1物镜加热器由以下方式控制  由TC2BIP 温度控制器用于我们的研究。
带运动传感器的橱柜下LED灯	锡尔瓦尼亚	#72423 LED 光源	建议用于 Ca 期间的数据采集2+ 在微弱室内光线下进行瞬态成像。  替代方案：  带有柔性颈部的夹式手电筒/书灯——多家供应商可提供。
带在线锥形瓶的真空管线 &和防护滤光片	Fisher	Tygon 管 - E363；  聚丙烯锥形瓶 - 10-182-50B；真空滤器 - 09-703-90	图A #11