啮齿动物心肌细胞心脏收缩功能障碍和^Ca2+ 瞬变分析

心脏泵功能分析通常需要一系列方法来获得足够的洞察力，特别是对于心力衰竭（HF）的动物模型。超声心动图或血流动力学测量可深入了解体内心功能不全¹，而体外方法通常用于确定功能障碍是否由肌丝和/或负责将激发或动作电位与收缩功能偶联的 Ca²⁺ 瞬变（例如，激发-收缩 [E-C] 耦合）引起的。体外方法还提供了在寻求昂贵和/或费力的体内治疗^{策略之前筛选}对神经激素、载体诱导的遗传改变以及潜在治疗剂的功能反应的机会2。

有几种方法可用于研究体外收缩功能，包括完整小梁³ 或透化肌细胞⁴ 中的力测量，以及在存在和不存在 HF^5，6 的情况下完整肌细胞中的卸载缩短和 Ca²⁺ 瞬变。这些方法中的每一种都侧重于心肌细胞收缩功能，它直接负责心脏泵功能^2，7。然而，收缩和E-C偶联的分析最常通过测量分离的Ca 2+耐受成年肌细胞中的肌肉长度缩短和Ca²⁺瞬变来进行。实验室利用详细的已发布方案从大鼠心脏中分离出肌细胞进行此步骤⁸。

Ca²⁺ 瞬时和肌丝都有助于完整肌细胞的缩短和再延长，并可能导致收缩功能障碍^2，7。因此，当体外功能分析需要含有Ca²⁺循环机制和肌丝的完整肌细胞时，建议使用这种方法。例如，完整的分离肌细胞对于通过^{基因转移修饰}肌丝或Ca²⁺循环功能后研究收缩功能是理想的9。此外，在研究下游第二信使信号通路的影响和/或对^{治疗剂的反应}时，建议使用完整的肌细胞方法来分析神经激素的功能影响2。单个肌细胞中负荷依赖性力的替代测量最常在低温（≤15°C）膜透化（或蒙皮）后进行，以去除Ca²⁺瞬时贡献并关注肌丝功能¹⁰。完整肌细胞中负载依赖性力加上Ca²⁺瞬变的测量很少见，这主要是由于该方法¹¹的复杂性和技术挑战，特别是当需要更高的通量时，例如测量对神经激素信号的反应或作为治疗剂的筛选。心脏小梁的分析克服了这些技术挑战，但也可能受到非肌细胞、纤维化和/或细胞外基^{质重塑的影响}2。上述每种方法都需要含有成人肌细胞的制剂，因为新生儿肌细胞和来源于诱导多能干细胞（iPSC）的肌细胞尚未表达成人肌丝蛋白的全部补^体，并且通常缺乏成人杆状肌细胞中存在的肌丝组织水平2。迄今为止，iPSCs的证据表明，在培养物中，向成体亚型的完全过渡超过134天¹²。

鉴于本系列的重点是HF，这些协议包括区分衰竭与非衰竭完整肌细胞收缩功能的方法和分析。代表性的例子来自在肾上缩窄后18-20周研究的大鼠肌细胞^，如前所述5^，13。然后与假处理的大鼠的肌细胞进行比较。

此处描述的协议和成像平台用于分析和监测HF发展过程中杆状心肌细胞中缩短和Ca²⁺ 瞬变的变化。对于该分析，将2 x 10⁴ Ca 2+耐受的杆状肌细胞接种在^{22mm 2} 层粘连蛋白涂层玻璃盖玻片（CSs）上并培养过夜，^如前所述8。材料 表中提供了为该成像平台组装的组件，以及用于最佳成像的培养基和缓冲液。此处还提供了使用软件进行数据分析的指南和代表性结果。整个方案分为单独的子部分，前三个部分侧重于分离的大鼠肌细胞和数据分析，然后是细胞^{Ca 2 +} 瞬时实验和肌细胞数据分析。

对啮齿动物进行的研究遵循公共卫生服务关于人道护理和使用实验动物的政策，并获得了密歇根大学机构动物护理和使用委员会的批准。在这项研究中，从体重≥200g⁵的3-34个月大的Sprague-Dawley和F344BN大鼠中分离出肌细胞。使用男性和女性比率。

1. 肌细胞起搏用于收缩功能研究

1. 为每组分离的肌细胞制作新鲜的基于M199的培养基（材料表）。起搏前 1 天，在 22 mm 2 层粘连蛋白涂层玻璃盖玻片 （CS） 上板² x 10^{4 Ca 2+} 耐受的杆状肌细胞，如前所述⁸.
2. 为了准备腔室，将每个腔室浸泡在10%漂白剂中1小时。然后，用自来水冲洗腔室30-45分钟，然后每5分钟更换一次蒸馏水30分钟，然后每5分钟更换一次去离子水30分钟，最后用去离子水冲洗。
3. 在干净的表面上干燥腔室20-30分钟（补充图1A-C）。接下来，在生物安全柜中对每个方向的腔室进行5分钟的紫外线处理（总= 20分钟）。预灭菌室不需要此步骤。
   注意:离开该区域以尽量减少紫外线照射。
4. 从腔室中取下盖子，向每个孔中加入3mL基于M199的培养基（参见 材料表）（补充图1B），更换盖子，并在37°C培养箱中预热腔室，其中CO₂ 和20%O₂。
5. 在250°C的热珠灭菌器中灭菌镊子20-25秒。将预热的刺激室从培养箱转移到生物安全柜。
6. 使用无菌镊子将含有心肌细胞的每个盖玻片（CS）转移到刺激室中的单个孔中。一次转移四个CS，然后在转移剩余的四个CS之前加热10分钟以保持介质温度。
7. 将香蕉千斤顶连接到一端的刺激室（补充图1C）和另一端的刺激器（补充图1D）。
8. 将刺激器频率设置为0.2 Hz并设置电压（~12 V）以实现孔内所有杆状心肌细胞的~10%-20%的收缩。要确定收缩肌细胞的数量，请将腔室置于放大倍率为4倍至10倍的倒置显微镜下。
9. 将刺激室置于37°C的5%CO₂ 培养箱中（补充图1E）。使用在37°C，5%CO₂ 培养箱中预热的培养基每12小时更换培养基20-25分钟。继续电刺激长达3天，每12小时更换一次培养基。

2.成年大鼠心肌细胞收缩功能分析

1. 实验前在37°C培养箱中预热凝胶包和培养基30分钟。
2. 打开材料表中列出的收缩功能平台组件，并显示在补充图2中，特别注意关键组件，其中包括带有倒置显微镜的防振台（补充图2A-1），带有深红色（590 nm）滤光片的倒置显微镜（补充图2A-2，3）和连接到CCD控制器的CCD相机（补充图2A-4）（补充图2A-5和 补充图2C-5）并与PC计算机集成（补充图2B-14）。
3. 将管路组装到蠕动泵中（补充图2A-8;补充图2A-8），将预热的凝胶包转移到管支架中（补充图2A-9），并打开真空（补充图2A-11）和细胞刺激器的电源（补充图2B-13）。
4. 将装有培养基的 50 mL 管放入绝缘管支架中（补充图 2A-9），并以 ~0.5 mL/min 的速度通过蠕动泵管开始灌注（补充图 2E-8）。
5. 将少量预热培养基加入小称量舟（~2 mL）中。将一个含有肌细胞的CS从刺激室转移到称重船上。将刺激室返回到5%CO₂ 培养箱中的37°C。
6. 从秤船上取下 CS，轻轻擦拭底部。将CS转移到新润滑的CS室（补充图2A，F-10;黑色箭头）中，并在CS上轻轻添加一滴培养基（~200μL）。
7. 将铂电极支架放在CS上（补充图2F;灰色箭头），并使用镊子在顶部放置一个新的CS。在CS三明治上放置一个顶部安装座（补充图2F;白色箭头），然后安装两个或四个#0盘头螺钉以完成腔室的组装。
8. 一旦介质存在于整个泵管中，将管子连接到预热器，然后将预热器连接到步骤2.7中组装的CS室。以 0.5 mL/min 的速度开始灌注，并在腔室下方放置纸巾擦拭以确保没有泄漏。
9. 将CS室放入载物台适配器中。灌注介质收集在腔室的另一端，管道连接到真空系统。打开加热系统（补充图2A，D-7）并平衡腔室，物镜和预热器~5-10分钟，以实现37°C的恒定介质温度。 在此平衡时间内，在显微镜上使用40倍水浸物镜可视化肌细胞。
10. 通过将电压设置为80%杆状细胞收缩所需设置的1.5倍（通常为35-40 V）来激活起搏刺激器（补充图2B-13）。 将刺激频率设置为0.2 Hz以优化收缩功能和肌细胞存活。
11. 从连续灌注和起搏的肌细胞中收集收缩缩短和重新延长的痕迹。要收集缩短测量值，请使用连接到CCD控制器的CCD相机（补充图2A-4）（补充图2B-5，C）和带有I / O控制器板的专用计算机（补充图2B-14;参见 材料表）。该平台测量大鼠肌细胞中的肌节缩短，尽管从肌细胞纵向边缘收集的肌细胞测量获得了类似的结果（参见Ecklerle等人¹⁴）。
12. 若要收集肌节缩短痕迹，请在计算机上打开软件，选择" 确定"，然后选择" 新建>文件"。通过选择 "跟踪>编辑用户限制">肌节长度 ，然后设置最大值和最小值（通常介于 2.0 μm 和 1.5 μm 之间）来准备屏幕模板。在对肌细胞进行测量之前，用0.01 mm刻度网校准CCD相机（图1D）。
13. 要记录肌节长度轨迹，请选择 "文件>新建"。识别收缩的肌细胞并沿相机的纵轴定位肌细胞，使条纹模式垂直（图1B）。
14. 使用计算机鼠标将感兴趣区域（ROI）框（粉红色框）放在肌细胞上（图1C）。选择收集并开始记录收缩功能。在低刺激频率（≤0.5 Hz）下记录每个肌细胞缩短60秒。
15. 记录每个CS5-10个细胞的肌节缩短。 如果研究包括激动剂/拮抗剂治疗，则在1细胞/ CS下进行测量。准备单独的预热介质和装载在多通道蠕动泵中的不同专用灌注管，并按照步骤2.9.-2.14进行操作。测量药物或神经激素递送对肌细胞收缩功能的影响。
16. 为了测量一系列频率的缩短，在每个频率下起搏肌细胞，以便在记录⁵之前获得稳态缩短。对于这些研究，将灌注速率加倍，并在刺激后 15-20 秒以新的频率开始记录，以获得 0.2 Hz 和 2 Hz 范围内频率的一致稳态收缩响应。 通常，记录不超过 2 个肌细胞/CS，以便在给定的刺激频率范围内缩短。
17. 在分析记录时，记录至少7次收缩/细胞以获得可靠的信号平均数据（参见步骤3）。

3.分离肌细胞收缩功能的数据分析

1. 若要开始，请选择" 文件"，选择记录的跟踪，然后选择" 打开"。选择基本迹线的 选项卡 1 （左侧），然后将迹线顶部的黄色面板设置为 Sarc-Length。选择 "跟踪 "和在步骤 2.12 中准备的屏幕模板。
2. 要准备分析模板，请在 t0 的定义框中选择 操作、单调瞬态分析选项、TTL 事件标记 ，以及菜单中的以下选项:基线（静息肌节长度）， 相对于 t0 的偏离速度 （dep v）， 峰值（峰高和 %峰高/基线或 bl%峰 h）， 相对于 tPeak 的返回速度 （ret v）， 使用 t0 达到峰值的时间 50% （TTP 50_%），使用 tPeak 达到基线的时间 50% （TTR_50%）。通过选择模板>使用标识符 保存分析模板 来保存这些分析选项。在分析每个跟踪之前加载此分析模板。
3. 要开始数据分析，请选择 门>标记>添加瞬态>从事件标记>分析范围转换。现在将肌细胞以0.2 Hz的速度设置为-0.01 s至1.20 s的时间范围（图2A，原始迹线下部的红色标记）。为以较高频率刺激的肌细胞选择较短的时间范围。
4. 通过选择" 操作">"平均事件"来生成信号平均跟踪。信号平均记录显示在原始基迹线下方。
5. 选择信号平均迹线的选项卡 1（屏幕左侧），然后在上方菜单中选择"标记"，然后选择"添加瞬态"。从顶部菜单中选择操作和单调瞬态分析，以在信号平均显示面板中显示基线肌节长度、峰高、bl%峰h、dep v、ret v、TTP 50%和TTR_50%的信号平均值。
6. 通过选择导出 >单调瞬态分析>剪贴板电流，将每个肌节瞬态分析传输到电子表格，以便对多个肌细胞进行复合分析。将此数据粘贴到每个跟踪的电子表格中。
7. 要复制信号平均迹线，请选择" >剪贴板>选项导出当前迹线> 并将小数位数设置为 5，然后选择 制表符分隔符 ，然后单击确定和 确定"。将每个肌细胞记录的信号平均迹线粘贴到第二个电子表格中。

4. 记录大鼠成年心肌细胞中的 Ca²⁺ 瞬变

1. 在测量Ca 2+瞬变之前，打开步骤2.2.中描述的平台组件以及其他荧光成像组件（参见材料表中用于Ca²⁺成像分析的其他组件;补充图2A-5，6; 2B-12）。
2. 制备含有 1 mM 呋喃-2AM 加 0.5 M 丙磺舒的二甲基亚砜 （DMSO） 储备溶液。丙磺舒最大限度地减少了 Fura-2AM 泄漏¹⁵.
3. 将储备溶液稀释至 5 μM Fura-2AM 和 2.5 mM 丙磺舒在 2.5 mL 培养基中（参见 材料表）在 6 孔板的一个孔中。将 2.5 mL 培养基单独（无 Fura-2AM）加入板中的另外三个孔中，用铝箔覆盖板，并将培养基预热至 37 °C。
4. 将含有肌细胞的CS从起搏室转移到含有Fura-2AM的孔中，盖上盖子，并将板返回到具有5%CO₂ 的37°C培养箱中4分钟。在Fura-2AM加载期间将管道安装在灌注泵中并灌注介质，如步骤2.4中所述。
5. 关闭或最小化室内灯，以减少荧光光漂白并优化荧光信号。从培养箱中取出6孔板，然后在仅包含培养基的三个孔中的每一个中洗涤CS10秒。将CS转移到装有预热介质的小称重船上（未添加Fura-2AM）。
6. 轻轻擦拭CS的底部后，将CS安装到刚润滑的CS室中。 轻轻地向CS中加入一滴介质，然后将电极支架组装在CS上，然后是第二个CS和顶部安装座。使用 #0 盘头螺钉完成电池室的组装，如步骤 2.6.-2.7 中所述。
7. 将装满介质的泵管连接到预热器，将预热器连接到CS室，并放入载物台适配器中，如步骤2.8中所述。用真空管系统收集介质并打开加热系统（补充图2A，D-7）以将腔室平衡至37°C，如步骤2.8.-2.9中所述。
8. 激活设置为35-40 V和0.2 Hz的起搏刺激器（补充图2B-13），如步骤2.10中所述。
9. 在记录 Ca²⁺ 瞬态之前，请打开安装在计算机键盘附近的小手电筒或书灯以帮助查看键盘。此外，在没有心肌细胞的区域记录荧光背景。若要开始，请选择" 文件>启动">"新建"，如步骤 2.12 中所述。
10. 选择一个 ROI，并为原始分子设置一个选项卡（或跟踪栏，左侧），为每个选项卡的上中心定义一个选项卡，为原始分母设置第二个选项卡。记录背景10-20秒。右键单击鼠标并在一个跟踪栏面板上拖动以获取原始信号平均分子和分母值。通过选择 "操作">"常量"来输入这些值，然后输入原始值。
11. 准备一个新的屏幕模板以收集起酥油和 Ca²⁺ 瞬态。对于肌节长度，请选择选项卡 1 并使用与步骤 2.13 中所述相同的过程。对于 Ca²⁺ 映像，请选择选项卡 2 >比率（选项卡的上中心）>跟踪>编辑用户限制"以 设置比率的最小和最大级别，通常设置在 1 到 5 之间。使用相同的过程定义选项卡 3 和 4（左侧）的分子和分母范围。
12. 将ROI框放置在肌细胞图像上，如步骤2.14中所述。选择 "文件>新建>收集"。现在选择 "开始" 以收集缩短和比率Ca²⁺ 数据。记录≥7次收缩/细胞进行信号平均分析。
13. 重复步骤 4.10 中所述的后台跟踪记录。记录2-4个肌细胞后。通常，如果背景读数有显着变化，则记录 4-5 个肌细胞/CS 或更少的肌细胞。

5.分离肌细胞中Ca²⁺瞬变的数据分析。

1. 打开所需的文件进行分析，然后选择 模板>屏幕模板 进行缩短以及Ca²⁺ 瞬变。接下来，选择选项卡 1 和 2（左）以分别显示肌节长度和 Ca²⁺ 比率。选择 "操作"> "常量"，然后输入 Ca²⁺ 背景迹线中的分子和分母值。
2. 准备用于缩短和Ca²⁺ 瞬态数据的分析模板。选择选项卡 1（左侧）并使用步骤 3.2 中所述的相同过程。以设置肌节长度分析模板。
3. 选择选项卡 2（左侧），然后在 t0 的定义框中选择 操作、单调瞬态分析选项、TTL 事件标记 以及菜单中的以下选项:基线（基础比）， 相对于 t0 的偏离速度 （dep v）， 峰值（峰高和峰高百分比/基线或 bl%峰 h）， 相对于 tPeak 的衰减速度 （ret v）， 使用 t0 达到峰值的时间 50% （TTP 50_%），使用 tPeak 达到基线的时间 50% （TTR_50%）。通过选择模板和使用新标识符名称保存分析 模板 来保存这些 分析 选项。在分析每个跟踪之前加载此分析模板。
4. 使用步骤 3.3.-3.6 中所述的相同过程。平均信号，然后分析肌节长度，然后对Ca²⁺ 瞬变执行相同的步骤。为肌节长度和 Ca²⁺ 瞬态比迹线设置单独的标记。

从分离后的第二天（第2天）开始至隔离后4天对大鼠肌细胞进行收缩功能研究。虽然可以在分离后的第二天（即第2天）记录肌细胞，但在基因转移或处理后通常需要更长的培养时间以改变收缩功能8。对于分离后培养超过18小时的肌细胞，第1节中描述的起搏方案有助于维持T小管和一致的缩短和重新延长结果。

图 1A显示了含有用于缩短研究的肌细胞的CS的代表性部分，以及在设置ROI之前适当定位的肌细胞（图1B）。一旦确定了ROI（图1C;粉色框），肌细胞下方显示的算法信息也有助于在记录前优化肌细胞定位。具体来说，线性光密度（LOD;黑线）是肌节数量和间距的指标，快速傅里叶变换迹线（FFT，红线）中的尖锐功率谱有助于实现记录缩短和重新延长的最佳对齐。用于校准肌节长度（和边缘检测）的经纬网模式如图 1D所示。图 2A （上图）显示了肌节长度缩短的典型对齐记录，以及第3节（下图）中描述的信号平均分析。

当动物模型中存在体内功能障碍时，通常在肌细胞中检测到功能障碍。例如，在肌细胞缩短研究中也检测到超声心动图对压力超负荷 （PO）13 的反应而观察到的收缩功能障碍5。为了说明数据迹线，显示了在0.2Hz下获得的具有代表性的原始（图2;下图）和信号平均（图2;下图）迹线，用于假（图2A）和PO处理（图2B）大鼠的肌细胞。为了测试PO后是否可以挽救肌细胞功能，还使用病毒介导的肌细胞分离时的基因转移来替换内源性心肌肌钙蛋白I（cTnI）与肌节16中的磷酸模拟cTnI T144D取代（T144D）。初步分析显示，在cTnIT144D基因转移4天后，PO诱导的收缩功能降低（表1，上图）恢复到假水平（表1;下图）。

该平台还可用于测量Ca2+瞬变，以及分离的肌细胞中的缩短。PO后未记录起酥油和Ca 2+，因为PO降低了大鼠肌细胞对层粘连蛋白13的粘附，并且先前的可比模型显示Ca2+处理在相似的时间点17发生改变。取而代之的是，在从2-3个月大的大鼠分离的Fura-2AM负载肌细胞中进行代表性实验。代表性记录和信号平均迹线如图3所示，数据分析如表2所示。对于这组实验，在腺病毒介导的cTnIT144D或野生型cTnI的基因转移（感染多重性= 100）后4天研究从成年大鼠分离的肌细胞。用Fura-2AM加载肌细胞后测量肌节缩短和Ca2+瞬变。在这些初始研究中，与cTnI相比，cTnIT144D的基因转移增强了峰值缩短和舒张期Ca2+水平升高（表2）。虽然需要进行更广泛的分析，但初步结果表明，由于收缩功能和Ca2+处理随时间的变化，用cTnIT144D进行体内替代可能会产生复杂的心脏表型。

图1:用于功能研究的成年大鼠心肌细胞。 （A）来自成年大鼠的代表性分离心肌细胞（比例尺= 50μm）。箭头指向成像的代表性肌细胞，用于收缩功能分析。（B）具有ROI（粉红色）位于侧面的代表性肌细胞（比例尺= 20μm）。（C）具有ROI的代表性肌细胞（上图），该肌细胞的肌节模式（下图，蓝色;比例尺= 20μm）和功率谱的尖峰（下图，红色）。（D） 0.01 mm 刻度网的屏幕截图，以校准缩短测量值。 请点击此处查看此图的大图。

图2:来自大鼠肌细胞的代表性记录。 原始记录（上图）和信号平均（下图）迹线在（A）假和（B）压力超负荷（PO）处理的大鼠的肌细胞中以0.2Hz记录。术后18-20周分离肌细胞，由肾上缩窄产生PO13。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:来自 Fura-2AM 负载的成人心肌细胞的肌节长度 （SL） 和 Ca 2+ 瞬变的代表性记录和分析。 （A） SL、Ca 2+ 瞬态比（比率）的原始迹线，以及用于产生 Ca2+ 瞬态比的分子和分母迹线。（B） SL（上迹线）和Ca2+瞬态比（下迹线）的信号平均迹线示例。（C） 使用单调迹线算法分析肌节长度 （SL） 和 Ca2+ 瞬态比。请点击此处查看此图的大图。

表1:心肌细胞对压力超负荷（PO）和基因转移的反应收缩功能的比较。肌细胞缩短结果来自手术后18-20周的假和PO大鼠心脏（上图）5，13以及cTnIT144D基因转移后4天假和PO大鼠的肌细胞（下图）。在所有组中的肌细胞分离/基因转移后4天测量收缩功能。结果表示为平均± SEM（n =肌细胞数）。每组假数据和 PO 数据都通过学生 t 检验进行比较，*p < 0.05 被认为具有统计学意义。Ravichandran等人5早先报道了假肌细胞和PO肌细胞的峰振幅结果。

表2:cTnIT144D基因转移后4天成年大鼠肌细胞的收缩功能和Ca2+ 瞬变。 与野生型cTnI相比，cTnIT144D基因转移后的肌细胞中显示了收缩功能（上图）和Ca2+ 瞬变（下图）的分析。从2-3个月大的成年大鼠中分离肌细胞，并以平均±SEM（n =肌细胞数）表示数据。收缩函数（左）和Ca2+ 瞬态（右）的统计比较使用非配对学生t检验进行，其显著性设置为*p < 0.05。

补充图1:接种在层粘连蛋白包被的CS上的肌细胞起搏系统的组成部分。 （A） 定制起搏室，每个腔室中含有铂电极。（B）起搏室，前四个腔室充满介质。（C） 连接到香蕉插孔电缆的起搏室，香蕉插孔电缆连接到腔室和 （D） 刺激器。（E）刺激器（右）和37°C培养箱（左）之间的连接。 请点击此处下载此文件。

补充图2:肌细胞收缩功能和/或Ca2+瞬态测量所需的成分。（A）显示每个组件的收缩功能平台，并在材料表中更详细地解释编号项目。该平台中的组件包括防振台，倒置明场显微镜（#2，3），CCD相机，CCD控制器和氙气电源，双发射光源，温度控制器，蠕动泵，绝缘管支架，盖玻片安装灌注室（#10）和真空系统（#11）。（B）其他组件包括荧光接口（#12），腔室刺激器（#13）和PC计算机（#14），这些在材料表中有更详细的解释。面板 A 中编号项目的特写视图显示在 C-F 中。（C） 氙气电源（左）和CCD控制器（右）的视图。（D） 温度控制器。（五）蠕动泵。（F） CS 灌注室底座（黑色箭头）、铂电极支架（灰色箭头）和顶部安装座（白色箭头）的视图，带有 #0 盘头螺钉。请点击此处下载此文件。

作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。