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测量 秀丽隐杆线虫 对乙酰胆碱受体激动剂左旋咪唑的敏感性

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DOI：

10.3791/64056

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2022年6月7日

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

本文内容

摘要

本实验方案描述了一种用于测定对左旋咪唑（levamisole）反应的方法，左旋咪唑是秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）一类乙酰胆碱受体的药理学激动剂。在此液体左旋咪唑游泳实验中，研究人员通过肉眼观察并定量分析在24孔板中培养的线虫随时间推移发生的麻痹现象。

摘要

在神经肌肉接头（NMJ）处，兴奋性神经递质乙酰胆碱（ACh）与突触后受体结合，引发肌肉收缩。与脊椎动物骨骼肌类似，模式生物Caenorhabditis elegans体壁肌肉中的胆碱能信号传导对其运动至关重要。暴露于左旋咪唑（levamisole）——一种作用于体壁肌肉上特定类型ACh受体的药理学激动剂——会导致野生型动物出现时间依赖性的麻痹。对左旋咪唑敏感性的改变提示可能存在NMJ信号传导或肌肉功能的缺陷。本文介绍一种在24孔板中培养的C. elegans上进行的液体左旋咪唑检测方案。动物在液体中剧烈游动的行为使得在长达一小时的时间内，无需物理操作即可对数百条线虫的左旋咪唑诱导麻痹进行评估和定量。该方法可用于野生型及对左旋咪唑敏感性改变的突变体，以揭示NMJ信号传导功能异常所导致的生理后果。

引言

骨骼肌上突触后乙酰胆碱受体（AChR）的激活会产生电信号，从而引起肌肉收缩。神经肌肉功能的障碍会导致人类出现肌无力综合征和肌营养不良症1,2,3,4。线虫Caenorhabditis elegans已被广泛用于研究在进化上保守的基本生物学过程及疾病机制。脊椎动物的骨骼肌与C. elegans体壁肌在运动控制方面具有功能等价性5。本文介绍了一种简单的检测方法，可用于比较野生型C. elegans与神经肌肉信号传导或肌肉功能发生改变的突变体。

分别来自胆碱能和GABA能运动神经元的兴奋性和抑制性输入，导致秀丽隐杆线虫（C. elegans）身体一侧的肌肉收缩，而另一侧肌肉舒张，从而实现协调的运动6。左旋咪唑（levamisole）是一种用于治疗寄生性线虫感染的驱虫剂，可结合并持续激活体壁肌肉上的一类乙酰胆碱受体（AChR），导致时间依赖性的麻痹7。因此，对左旋咪唑敏感性的改变可用于鉴定兴奋性和抑制性信号传导平衡存在缺陷的C. elegans7,8,9,10,11,12,13,14,15。例如，对左旋咪唑敏感的乙酰胆碱受体（L-AChR）亚基（如UNC-63）的突变，以及在突触处介导L-AChR聚集所必需的Cubilin蛋白的C. elegans同源物LEV-10的突变，均会影响兴奋性信号传导，导致对左旋咪唑产生抗性7,8。GABAA受体UNC-49的突变会减弱抑制性信号传导，引起对左旋咪唑的超敏反应12。

传统上，对左旋咪唑的超敏性或抗性是通过将线虫转移至含有左旋咪唑的琼脂平板上，随后定期触碰线虫以确定其发生麻痹的时间点来评估的13,14,15。我们开发了一种液体左旋咪唑游泳实验方法，该方法无需对线虫进行物理操作，可在1小时内完成对数百条线虫的筛选。本文描述了该方法在野生型、unc-63(x26)、lev-10(x17) 和 unc-49(e407) 线虫中的应用。然而，该实验方案也可用于经RNAi处理的 C. elegans，正如在全基因组RNAi筛选中用于验证影响左旋咪唑敏感性的基因敲降效果时所采用的方法 一样11。

在此药理学实验中，将线虫在24孔板中培养至成虫期，每孔加入含有0.4 mM 左旋咪唑的M9缓冲液，随后在1小时内每5分钟记录一次活动动物的数量。通过肉眼观察左旋咪唑诱导的麻痹现象随时间的变化，实验结束后对数据进行量化分析。通过同时检测突变体与野生型C. elegans，学生可首先对可能的表型效应做出预测，然后开展实验验证其假设。综上所述，这种简单、低成本的液体左旋咪唑实验是展示特定基因缺失对神经肌肉接头（NMJ）功能影响的理想方法。

方案

1. 左旋咪唑检测用平板的制备

  1. 在带有搅拌子的烧瓶中，将 3 g NaCl、2.5 g 胰蛋白胨和 17 g 琼脂加入 1 L 去离子水（DI 水）中，配制线虫生长培养基（NGM）。
  2. 高压灭菌后，将培养基置于设定为 70 °C 的加热板上，以中等速度搅拌 1 小时。
  3. 逐滴加入 1 mL 浓度为 5 mg/mL 的胆固醇溶液以防止沉淀，并加入 1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4 以及 25 mL 1 M pH 6.0 磷酸钾缓冲液 至培养基中。
  4. 使用无菌移液管将 2 mL NGM 培养基转移至 24 孔板的每个孔中（图 1）。
  5. 将平板在室温下放置 2 天使其干燥，然后再接种细菌。如需长期保存，可将其置于 4 °C 环境中。
  6. 在 LB（Lysogeny 肉汤）平板上划线接种 OP50 E. coli，并在 37 °C 下过夜培养。
  7. 挑取单个 OP50 菌落接种至 B 肉汤（每 1 L 去离子 H2O 中含 10 g 胰蛋白胨和 5 g NaCl）中，于 37 °C 摇床过夜培养。
  8. 使用无菌移液器，在每个孔的琼脂中央滴加 30 µL OP50 菌液（图 1）。
    注意：务必避免损伤琼脂表面，否则会导致线虫钻入琼脂。
  9. 接种后，将平板在室温下静置至少 2 天，以形成均匀的细菌菌膜。
    注意：若 2 天后中心孔中的细菌仍未干燥，可将平板在生物安全柜中打开通风 20 分钟（图 1）。平板应在实验前 1–2 周完成倾注并接种细菌。

2. 线虫（C. elegans）的同步化处理（第1天）

  1. 在6 cm培养皿中将野生型、 unc-63(x26)、 lev-10(x17) 和 unc-49(e407) C. elegans 培养至成虫期，每种菌株至少准备八个培养皿。确认培养皿中有大量未饥饿的产卵成虫。
    注意：所需培养皿数量为实际用量的两倍；然而，为防止在漂白过程中第一批卵被破坏，准备备用培养皿非常重要。
  2. 通过将59.6 g Na2HPO4 （二碱）、 29.9 g KH2PO4 （单碱）、12.8 g NaCl 和 2.5 g MgSO4 溶解于750 mL去离子水中（搅拌下）配制10x M9缓冲液。完全溶解后定容至1 L，并过滤除菌。使用时按1:10稀释并高压灭菌，得到1x M9缓冲液。
    注意：1x M9缓冲液可提前数周或数月配制。
  3. 在同步化当天于通风橱内配制漂白液。在50 mL锥形管中混合10 mL次氯酸钠溶液（材料表）、2.5 mL 10 N NaOH 和 37.5 mL去离子水。操作漂白液时需佩戴护目镜、手套和实验服。
  4. 使用塑料移液管，用1x M9缓冲液从至少四个培养皿中冲洗产卵成虫，并将其转移至15 mL锥形管中。
  5. 在室温下以716 × g 离心1分钟，然后用移液管移除上清液。
  6. 加入10 mL漂白液，倒置或轻轻摇动管子约4分钟，直至大部分但并非全部虫体组织溶解（图1）。
    注意：注意避免过度漂白，否则会破坏卵。某些突变可能增加卵分离的难度。
  7. 以716 × g 离心1分钟。
  8. 一次性倾倒漂白液；只要此时不晃动管子，卵将附着在管壁上。
  9. 加入15 mL 1x M9缓冲液并倒置混匀。以716 × g 离心1分钟，然后一次性平滑地倾去M9缓冲液。
  10. 按照步骤2.9所述，总共用1x M9缓冲液洗涤三次。
  11. 最后一次洗涤后，加入10 mL新鲜1x M9缓冲液，并于15 °C旋转器上过夜培养，以获得同步化的饥饿状态的一龄幼虫（L1期）群体。
    注意：放置于旋转器前，应检查M9缓冲液中是否存在卵。若无卵存在，则需使用备用培养皿重新制备，并缩短漂白时间。

3. 接种同步化的 C. elegans（第2天）

  1. 打印一份24孔板布局图，并将菌株分配至随机位置。每种菌株在24孔板中至少应重复六次。
  2. 漂白处理约24小时后，离心收集孵化并处于饥饿状态的L1期线虫 M9 缓冲液，716 × g 室温下持续1分钟。
  3. 用塑料移液管移除约 9 mL M9 缓冲液，然后轻轻混匀剩余 M9 缓冲液中的饥饿处理的一龄幼虫（L1s）。
  4. 立即将3 µL含线虫的M9缓冲液移液至显微镜载玻片上，计数L1期幼虫数量；理想数量为3 µL中含20–30条L1幼虫。若线虫浓度过低，离心后去除部分M9缓冲液；若浓度过高，则添加M9缓冲液进行调整。
    注意：每次反转试管后，至少重复2次检查每3 µL中的线虫数量。
  5. 根据预先制作的板图（步骤 3.1），用移液器将 3 µL L1s（总计 20-30 条蠕虫）加入每孔中 图1).
    注意：将含有L1幼虫的M9培养基管定期倒置，以保持线虫均匀分布，防止其沉降至管底。若不进行此操作，部分孔中线虫数量会过少，而其他孔中则过多。此外，移液枪头切勿刺穿琼脂，以免导致线虫钻入琼脂中。
  6. 将线虫在20 °C下培养3天至成虫期。
    ​注意：不同的培养温度和某些突变可能影响成熟速度，因此务必加以考虑 秀丽隐杆线虫 生命周期

4. 进行左旋咪唑测定（第5天）

  1. 打印一份空白数据表，用于记录每小时内在每个孔中每5分钟移动的线虫数量。
    注意：学生每5分钟最多可计数12个孔中的线虫。在第一个小时内检测前12个孔，随后一小时检测后12个孔。
  2. 检查24孔板中的线虫。使用记号笔，在孔板上标记 "X" 在培养板盖子上标记任何被污染、已饥饿或虫体过多的孔>40），这将使计数变得困难。
  3. 将200 µL 100 mM 左旋咪唑储备液加入50 mL 1× M9溶液中，配制0.4 mM 左旋咪唑溶液。通过将240.76 mg 盐酸左旋咪唑溶解于10 mL H₂O中，制备100 mM 左旋咪唑储备液。2O，并在 −20 °C 下保存。
    注意：左旋咪唑必须用M9稀释；不可用H稀释2O会加速瘫痪。学生应佩戴手套。摄入高浓度的左旋咪唑具有毒性。
  4. 启动计时器，然后使用移液管向前三口孔中各加入1 mL 0.4 mM 左旋咪唑，使线虫处于自由游动状态。随后依次向相邻孔中加入左旋咪唑，根据待检测孔的数量依次错开加药时间。
    注意：例如，若检测10个孔，则左旋咪唑的添加方式如下：0分钟时加入第1和第2孔，1分钟后加入第3和第4孔，2分钟后加入第5和第6孔，3分钟后加入第7和第8孔，4分钟后加入第9和第10孔。
  5. 5 分钟时，开始手动计数每个孔中移动的线虫数量，从第一个孔开始，并将该数量记录在数据表上（图1可以使用计数器，但并非必须，以准确确定移动线虫的数量。
    注意：在早期时间点，由于尚未有大量线虫出现麻痹，学生有时会落后，因此需要密切关注计时器。如有必要，可调整时间点的数量，或在每个时间点检测较少的孔。
  6. 每5分钟继续记录每个孔中移动的线虫数量，持续1小时。
    注意：在本1小时实验过程中，将线虫浸入M9溶液会诱导其持续游泳运动，从而无需戳刺线虫即可评估其麻痹状态。图2A）。暴露于0.4 mM 左旋咪唑溶液可诱导时间依赖性麻痹，表现为游泳活动停止；麻痹的线虫无法恢复。
  7. 重复步骤 4.4–4.6，完成板上其余各孔的操作。
  8. 在实验结束时，或在时间允许的情况下，记录每个孔中线虫的总数。

5. 数据分析

  1. 获取平板图谱（步骤 3.1），并记录每个孔对应的菌株。
    注意：由于采集的数据量较大，后续的数据分析与讨论至少需要数小时。
  2. 将数据输入电子表格，首先记录每个孔中线虫的总数，并按基因型进行分类整理。
  3. 整合各孔的数据，确定每种菌株在各个时间点的运动线虫数量。
  4. 利用这些数据，在统计分析软件（材料表）中绘制"生存曲线"，以直观展示群体随时间变化的麻痹情况（图 2B）。
  5. 建立一个数据表，左侧第一列为时间，后续各列分别对应不同菌株的数据。对于在前 5 分钟内发生麻痹的每只动物，新增一行，并在 5 分钟列输入"1"。对每个时间点重复此操作。对于在实验结束时仍未麻痹的所有动物，在 60 分钟列输入"0"。
  6. 使用统计分析软件（材料表）中的对数秩检验（Mantel-Cox 检验）进行两两比较，以确定两种不同菌株之间是否存在统计学上的显著差异。
  7. 作为额外或替代性分析，可不执行步骤 5.3 和步骤 5.4，而是计算每个时间点每个孔中运动动物的百分比。使用电子表格软件或统计分析软件，绘制所有被测菌株在各时间点的平均值及标准误图表（图 2C）。

结果

通过乙酰胆碱受体（AChRs）和γ-氨基丁酸（GABA）受体的信号传导，使得 C. elegans 身体一侧的肌肉收缩，而另一侧肌肉舒张，从而实现协调的运动6,16。左旋咪唑与离子型L型乙酰胆碱受体（L-AChRs）结合可引起肌肉收缩，导致野生型线虫随时间推移发生麻痹。本研究中，我们评估了野生型、unc-63 L-AChR突变体、lev-10 L-AChR聚集突变体以及unc-49 GABAA受体突变体 C. elegans 对左旋咪唑的敏感性。L-AChR亚基的突变，以及参与L-AChR向肌细胞膜转运、突触后L-AChR聚集和下游Ca2+信号传导相关基因的突变，均会导致对左旋咪唑诱导的麻痹产生抗性7,8,9,10,11,16,17，这在unc-63和lev-10突变体中已观察到（图2B,C）。GABA门控离子通道UNC-49的缺失则导致对左旋咪唑的超敏感性（图2B,C），这是由于胆碱能和GABA能信号通路之间的正常平衡被破坏所致12。最近，在一项高级遗传学实验课程中，本科生重复该实验时，100%的学生观察到unc-63和lev-10突变体表现出左旋咪唑抗性，而88%的学生观察到unc-49突变体表现出左旋咪唑超敏感性。通过液体左旋咪唑游泳实验获得的这些数据，与传统基于平板的左旋咪唑实验中观察到的表型一致7,8,11,12,13。

C. elegans 检测工作流程；24孔板，E. coli 接种，左旋咪唑检测，运动能力测量图表。
图 1：左旋咪唑检测的制备与实施示意图。 制备24孔NGM平板；两天后，在孔中接种OP50 Escherichia coli。通过次氯酸钠处理同步化C. elegans，并于次日根据预设的板图，将待检测各品系的第一幼虫期（L1）个体（野生型，黑色；unc-63(x26)，品红色；lev-10(x17)，绿色；unc-49(e407)，蓝色）移入各孔中。在20 ºC培养3天后，或当线虫发育至成虫阶段时，向每孔加入含0.4 mM左旋咪唑的M9缓冲液，并在1小时内每5分钟记录一次活动个体的数量。请点击此处查看该图的放大版本。

生存分析图；不同基因型对左旋咪唑的反应随时间变化；定量数据。
图 2：野生型及代表性突变型 C. elegans 在左旋咪唑诱导下的麻痹现象。（A）暴露于 0.4 mM 左旋咪唑会导致时间依赖性麻痹；而在 1x M9 缓冲液中游泳 1 小时的线虫未观察到该现象。（B）在左旋咪唑游泳实验中，野生型（黑色）、unc-63(x26)（洋红色）、lev-10(x17)（绿色）和 unc-49(e407)（蓝色）线虫的时间依赖性麻痹情况。L-AChR 亚基 UNC-63 或 L-AChR 聚集蛋白 LEV-10 的缺失导致对左旋咪唑产生抗性，而 GABAA 受体 UNC-49 的缺失则引起左旋咪唑超敏感性。每种基因型 n ≥ 50，在本代表性实验中，所有突变体与野生型相比，p < 0.0001。（C）使用与图（B）相同的数据，计算每种品系在每个时间点的运动线虫百分比（每孔百分比的平均值 ± 标准误差）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

对左旋咪唑反应的改变可用于鉴定突触后胆碱能信号传导和肌肉功能所必需的基因。本文所述方案介绍了一种液体左旋咪唑检测方法，用于在1小时时间内定量测定随时间依赖性的麻痹现象。学生可对特定基因突变的影响作出预测，开展大样本量的实验，并对结果进行量化分析。该检测方法无需挑取或触碰线虫，即可简便高效地定量左旋咪唑诱导的麻痹，适用于本科生实验教学以及神经肌肉传递相关研究。本文还讨论了该实验中最常见的问题、检测方法的局限性，以及一种适用于RNA干扰（RNAi）基因敲降动物的方案变体；同时探讨了如何将该检测整合到基于课程的本科生科研实践教学中。

正确制备24孔板至关重要。首先，在将L1期线虫点样到孔中之前，必须确保细菌菌苔完全干燥。如果干燥不充分，细菌会与左旋咪唑溶液混合，导致液体变浑浊，从而无法准确计数线虫个体。其次，在通过次氯酸钠处理同步化线虫时，线虫暴露于次氯酸钠溶液的时间不能过长，否则会导致卵的保护层解体。第三，每孔仅需点样20至30条L1期线虫，因为孔中线虫数量过多会极大增加在规定时间内准确计数运动个体的难度。最后，在制备平板过程中必须保持无菌操作，因为被污染的孔无法用于实验分析。

进行本实验时，必须考虑一些局限性。首先，每5分钟对每个孔中移动的线虫数量进行计数，对于缺乏前期实验经验的操作者而言可能负担较重，可能导致数据收集不够精确。与其他用于测定药物敏感性的实验方法18,19类似，本实验也可减少时间点的数量以简化操作。其次，将经漂白处理后分离得到的饥饿L1幼虫接种到培养板中，是获得同步化群体的简便方法；然而，若被检测菌株之间的发育时间存在差异，则必须进行相应调整。虽然也可直接挑选晚期四龄幼虫（L4）放入24孔板中进行本实验，但在制备大量样品板时，该方法过于耗时费力。另一种替代方案是，确定各菌株发育至L4阶段所需的时间，然后在不同时间点将L1幼虫接种至各孔中，以校正发育速度的差异。最后，尽管本实验可用于鉴定对突触后肌肉功能重要的新基因11，但突触前基因的突变或RNA干扰介导的基因敲低也可能导致左旋咪唑反应的改变12。若观察到左旋咪唑敏感性发生改变，还需开展进一步实验以明确该表型产生的原因。

通过对24孔板进行一些改进，所描述的左旋咪唑游泳实验也可用于RNAi敲降动物11。通过喂食表达与目标基因相对应的双链RNA的细菌，可实现秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因敲降20。制备RNAi平板时，需在培养基从高压灭菌器取出后，每升培养基中加入1 mL的1 M IPTG和1 mL的25 mg/mL羧苄青霉素。细菌培养时，挑取单菌落接种至3 mL LB液体培养基（含3 µL 25 mg/mL羧苄青霉素）中，37 °C振荡过夜培养；当不同细菌点种到各孔时，制作平板图谱。C. elegans通过漂白法进行同步化处理；但应使用对RNAi高度敏感的eri-1(mg366)品系代替野生型，以增强基因敲降效果。RNAi介导的基因敲降可产生与功能缺失突变体中观察到的相同的左旋咪唑表型11。

本文介绍的实验方案可用于实验室研究，可作为本科生实验课程中的独立实验，或在高级本科课程的前几周作为介绍基础 C. elegans 技术和神经肌肉功能的教学内容。在更高级的以探索为导向的课程中，学生可利用该检测方法来确定与重症肌无力综合征、肌营养不良或肌病患者中突变基因同源的 C. elegans 基因缺失后是否会影响左旋咪唑的敏感性。总之，这一简单且成本低廉的左旋咪唑敏感性检测为学习神经肌肉接头（NMJ）信号传导以及掌握 C. elegans 模式生物的操作提供了实践机会。

致谢

我们感谢Riya Dattani和Lauren Hogstrom，她们在特拉华大学BISC413高级遗传学实验室课程（2022年春季）中以对基因型设盲的方式收集了图2B、C的数据。有关BISC413课程整合的本科研究实践（CURE）的更多信息，以及J. Tanis设计的实验手册，可应要求提供。线虫品系由Caenorhabditis遗传学中心提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（NIH-ORIP，编号P40 OD010440）资助。本研究得到了特拉华州INBRE指导型CURE奖（P20 GM103446，授予J.E.T.）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
60 mm 无通风口、锐边培养皿TriTech ResearchCat #: T3308
BD Difco Bacto 琼脂赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: DF0140-01-0
BioLite 24 孔多孔培养板赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#:12-556-006
二水合氯化钙赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: BP510-500
胆固醇MP BiomedicalsCat#: 02101382-CF
eri-1(mg366)秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）GR1373
Gibco Bacto 胰蛋白胨赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: DF0118-17-0
Gibco Bacto 胰蛋白胨（Tryptone）赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: DF0123-17-3
GraphPad Prism（统计分析软件）GraphPad Software, Inc.
lev-10(x17)秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）ZZ17
盐酸左旋咪唑赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: AC187870100
低飞溅常规漂白剂 - 121盎司 - up & upTarget访问 target.com 搜索
七水合硫酸镁赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: BP213-1
Microsoft Excel微软公司（Microsoft, Inc）
N2 野生型秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）Bristol N2
OP50 E. coli秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）OP50
磷酸氢二钾赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: BP363-1
磷酸二氢钾赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: BP362-500
氯化钠（NaCl）赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: BP358-1
10N 氢氧化钠赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: SS255-1
磷酸氢二钠赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）Cat#: BP332-1
unc-49(e407)秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）CB407
unc-63(x26)秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）ZZ26

参考文献

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24 RNAi GABA

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