一种稳定建立的溶血磷脂酸胆碱诱导小鼠局灶性脱髓鞘两点注射模型

摘要

本方案描述了一种溶血磷脂酰胆碱的两点注射法 通过 使用立体定位仪在小鼠中建立稳定且可重复的脱髓鞘模型。

摘要

受体介导的溶血磷脂信号通路参与多种神经系统疾病的病理生理过程，尤其是多发性硬化症（multiple sclerosis, MS）。溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LPC）是一种内源性溶血磷脂，与炎症反应相关，可快速损伤髓鞘脂质并产生毒性作用，导致局灶性脱髓鞘。本文详细介绍了一种立体定位双点LPC注射技术，通过手术方式直接在小鼠脑内诱导严重脱髓鞘，快速且稳定地建立实验性脱髓鞘损伤模型。因此，该模型与脱髓鞘疾病（特别是多发性硬化症）高度相关，有助于推动具有临床相关性的科学研究进展。此外，采用免疫荧光染色和Luxol快蓝染色方法，描绘了LPC注射后小鼠胼胝体脱髓鞘的时间进程变化。同时，利用行为学方法评估了造模后小鼠的认知功能。总体而言，溶血磷脂酰胆碱双点注射 通过 立体定位仪是一种稳定且可重复的方法，用于在小鼠中建立脱髓鞘模型，以供进一步研究。

引言

受体介导的溶血磷脂信号通路几乎参与了所有器官系统的多种生理过程¹。在中枢神经系统（CNS）中，该信号通路在多发性硬化症（MS）等自身免疫性神经系统疾病的发病机制中发挥着关键作用。多发性硬化症是一种慢性免疫介导性疾病，其特征为病理性脱髓鞘和炎症反应，导致神经功能障碍和认知损害^2,3。在疾病早期经历反复发作与缓解后，大多数患者最终会进展至继发进展型阶段，可能导致大脑不可逆损伤并引发残疾⁴。目前认为，继发进展型病程的病理学特征是由炎性病灶引起的脱髓鞘斑块⁵。现有的多发性硬化症治疗方法可显著降低复发风险，但对于进展型多发性硬化所导致的长期脱髓鞘损伤，仍缺乏有效的治疗手段⁶。因此，需要建立一种稳定且易于重复的模型，用于研究针对白质变性的临床前治疗策略。

脱髓鞘和髓鞘再生是多发性硬化症发展过程中的两个主要病理过程。脱髓鞘是指小胶质细胞在促炎表型作用下诱导轴突周围髓鞘丢失的过程⁷，其导致神经冲动传导减慢，并引发神经元丢失及神经系统功能障碍。髓鞘再生是一种由少突胶质细胞介导的内源性修复反应，该过程若发生障碍，可能导致神经退行性变和认知功能损害⁸。炎症反应在整个过程中至关重要，影响着髓鞘损伤与修复的程度。

因此，构建稳定的持续性炎症性脱髓鞘动物模型对于进一步探索多发性硬化症（MS）的治疗策略具有重要意义。由于MS的复杂性，目前已建立多种动物模型以模拟脱髓鞘病变 体内，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）、中毒性脱髓鞘模型、环己酮（CPZ）和溶血磷脂酰胆碱（LPC）⁹. LPC 是一种内源性溶血磷脂，与炎症相关，可对髓鞘脂质产生快速毒性损伤，导致局灶性脱髓鞘。根据以往的报道和研究^10,11，提供了一种两点注射的详细方案并做了一些修改。通常，经典的单点LPC注射模型仅在注射部位产生局部脱髓鞘，且常伴随自发性再髓鞘化^12,13然而，两点注射LPC模型可以证明LPC能够直接诱导小鼠胼胝体脱髓鞘，并导致更持久的脱髓鞘，且髓鞘再生极少。

方案

所有动物实验程序均经中国华中科技大学同济医学院动物护理委员会批准。本研究使用成年C57BL/6雄性和雌性小鼠（野生型，WT；20–25 g；8–10周龄），小鼠购自商业来源（见 材料表）。小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）动物实验设施中，提供水和食物 随意摄取在22 °C温度和55%-60%相对湿度的标准条件下，保持12小时光照与12小时黑暗交替的循环。

1. 溶血磷脂酰胆碱（LPC）溶液的配制

1. 取25 mg LPC粉末（见材料表），加入250 µL氯仿与甲醇混合溶液（1:1），溶解配制成10%的LPC溶液，并转移至500 µL离心管中。
   注意：若LPC未完全溶解，可将离心管置于超声清洗仪中，在40 kHz条件下超声处理约1小时，以获得均匀溶液。
2. 将溶液分装为每管3 µL，并于−80 °C保存。
   注意：该溶液可保存约2年。
3. 手术前，将溶液（步骤1.2）用27 µL 0.9% NaCl溶液稀释，并置于37 °C恒温水浴中保温。
   ​注意：应在开始注射前立即配制该溶液。

2. 手术准备

1. 使用32 G、2英寸针头连接5 µL注射器（参见材料表）。确保微量注射器无堵塞。抽取5 µL LPC溶液以备注射。
2. 将小鼠置于与异氟烷挥发罐相连的诱导室中进行麻醉，使用3%异氟烷与100%氧气混合，流速约为0.3 L/min。
3. 通过夹捏脚趾无反射且呼吸平稳来确认麻醉深度。
4. 使用 电动剃毛器剃除小鼠两耳之间的头部毛发。术中滴加润滑性眼药水，以防角膜干燥。
5. 随后将小鼠背侧朝上固定于立体定位仪（参见材料表）中，用鼻模和门齿夹固定头部，并通过鼻部持续给予1.2%–1.6%异氟烷以维持麻醉。
   ​注意：可根据小鼠的呼吸状态调整异氟烷浓度。

3. 手术步骤

注意：所有操作过程中，动物均置于加热垫上。

1. 将小鼠用双侧耳杆固定于立体定位仪上。确保耳杆处于水平位置，头部保持水平且稳定。
2. 对头部皮肤进行消毒 用碘伏以环形方式多次擦拭，随后用酒精擦拭。然后使用手术刀 沿头皮中线切开一个约1.5 cm的小切口，以暴露颅骨。
3. 用浸有1%过氧化氢的棉签擦拭颅骨，直至前囟、后囟和枕囟暴露清晰。将注射器置于立体定位仪上。
   注意：使用过氧化氢时需谨慎，避免接触周围组织。
4. 确保动物头部处于水平位置（前后及左右方向）。
   1. 调节立体定位仪的Z轴旋钮，使针尖与颅骨刚好接触而不发生弯曲，然后测量Z轴坐标。记录前囟和后囟的Z坐标。
   2. 调整耳杆，使前囟和后囟的Z坐标差异不超过0.02 mm。然后采用相同方法测量中线左右两侧对应位置的Z坐标，调节耳杆以确保左右两侧处于同一水平。
5. 定位胼胝体。将XYZ坐标原点设在前囟。
   注意：第一个注射位点位于前囟外侧1.0 mm、深度2.4 mm、前囟前方1.1 mm处。第二个注射位点位于前囟外侧1.0 mm、深度2.1 mm、前囟前方0.6 mm处。例如，前囟的坐标为(0,0,0)。测量相应标记位置的Z坐标，记为(-1, 1.1, X)和(-1, 0.6, Y)。由此可确定胼胝体的第一个注射位点坐标为(-1, 1.1, −[X + 2.4])，第二个注射位点坐标为(-1, 0.6, −[Y + 2.1])。
6. 确定注射位点后，使用无菌标记笔在颅骨上做标记，并记录坐标。
7. 用颅骨钻轻轻钻开标记的部位（参见 材料表）。注意避免任何出血。
8. 缓慢将针头移动至指定坐标，开始注射。为诱导胼胝体脱髓鞘，以0.4 µL/min的速度在每个注射位点（步骤3.5）注入2 µL LPC溶液（步骤1）。
9. 注射后，将针头在每个注射部位保留额外10分钟。
   ​注意：确保两次注射的间隔不超过 20 分钟。
10. 用4-0缝线缝合皮肤，并在10分钟内等待动物苏醒。给予镇痛药物 根据机构的动物护理规定在术后进行。
    注意：安乐死的推荐时间可根据实验目的确定。 

4. 局灶性脱髓鞘样本提取

注意：有关此步骤的详细信息，请参见先前发表的报告¹⁴。

1. 将中性红染料（参见材料表）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成1%溶液。
2. 在处死小鼠前数小时（具体细节参见先前文献¹⁰），通过腹腔注射方式，每只小鼠注射500 µL 1%的中性红染料PBS溶液。
3. 用预冷至4 °C的0.1% PBS溶液进行心脏灌注¹²，灌注量为30 mL。
4. 使用脑组织切片模具（参见材料表）将脑组织切成1 mm厚的切片。
5. 在显微镜下观察经中性红染色的病灶区域，并分离病灶组织。
   ​注意：尽可能去除周围正常组织，以提高后续分析的准确性。病灶组织可用于RT-PCR、电子显微镜和蛋白质印迹分析。

5. 组织学染色与免疫荧光

1. 进行组织学染色和免疫荧光检测¹²时，在心脏灌注（步骤4.3）后取出脑组织¹⁰，用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C下固定过夜，并在30%蔗糖溶液中完全脱水。
2. 使用恒温冷冻切片机¹⁰（−20 °C）将脑组织切成20 mm冠状切片。
3. 将切片用于Luxol快蓝（LFB）染色、免疫荧光染色以及蛋白质印迹（western blot）¹⁰。

结果

两次注射LPC可导致更持久的脱髓鞘
LPC主要引起髓鞘的快速损伤，并对轴突完整性产生毒性作用并导致其断裂¹⁵。注射当天记为第0天。小鼠饲养时间为10至28天（10 dpi和28 dpi）。采用Luxol快蓝（LFB）染色法¹⁰评估在这些时间点小鼠的脱髓鞘面积。在两次注射模型中，与假手术组相比，10 dpi时出现显著的脱髓鞘，表明LPC的局部注射可成功诱导胼胝体脱髓鞘。在28 dpi时仍存在较高程度的脱髓鞘，提示两次注射LPC可导致持续且稳定的脱髓鞘（图1D-E）。

为了进一步评估髓鞘的丢失情况，选择10天作为关键时间点，此时脱髓鞘现象相对明显。通过降解的髓鞘碱性蛋白（dMBP）免疫荧光染色，在注射LPC后第10天（10 dpi）的实验组中观察到dMBP显著增加（图1F

讨论

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统的慢性脱髓鞘疾病，是导致青壮年神经功能障碍最常见的病因之一²⁰。临床上，约60%–80%的MS患者在发展为继发进展型MS之前，会经历反复发作与缓解的病程^21,22，并随着时间推移最终导致运动功能障碍和认知缺陷的累积²³。目前尚无单一的实验模型能够涵盖该疾病在临床表现、病理特征或免疫学特性上的全部多样性²⁴。为了模拟MS在不同阶段的病理过程和发病机制，现有三种常用的脱髓鞘动物模型，各有其优势与局限性，分别为实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型、喂饲环己亚硝脲（CPZ）动物模型以及LPC诱导的脱髓鞘模型。

在小鼠中，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）由注射髓鞘抗原后引发的免疫反应所诱导，导致小胶质细胞活化以及血管周围T和B淋巴细胞浸润，伴随的髓鞘损伤常与疾病复发相关

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-α-卵黄来源的溶血磷脂酰胆碱	Sigma-Aldrich	L4129-25MG
32号针头	HAMILTON	7762-05
10 μl 注射器	HAMILTON	80014
高速颅骨钻	中国台湾，韩国	strong204
钻孔	Hager & Meisinger，德国	REF 500 104 001 001 005
Matrx 动物麻醉呼吸机	MIDMARK	VMR
用于小鼠的便携式立体定位仪	奖励	68507
微量注射器	奖励	KDS LEGATO 130
异氟烷	VETEASY
多聚甲醛	Servicebio	G1101
磷酸盐缓冲液	BOSTER	PYG0021
LuxoL 快速蓝	Servicebio	G1030-100ML
缝合	FUSUNPHARMA	20152021225
脑模具	奖励	68707
电子显微镜固定液	Servicebio	G1102-100ML
中性红（C.I. 50040），用于显微镜检查，Certistain	Sigma-Aldrich	1.01376
抗髓鞘碱性蛋白抗体	Millipore	#AB5864
抗GST-P多克隆抗体	MBL	#311
Ki-67 单克隆抗体（SolA15）	赛默飞世尔科技 科学的	14-5698-95
β-肌动蛋白单克隆抗体	Proteintech	66009-1-Ig
髓鞘碱性蛋白多克隆抗体	Proteintech	10458-1-AP
OLIG2 多克隆抗体	Proteintech	13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure 驴抗兔 IgG（H+L）	YEASEN	34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗大鼠 IgG（H+L）	YEASEN	34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗兔IgG（H+L）	YEASEN	34212ES60
HRP 标记的山羊抗兔 IgG（H+L）	abclonal	AS014
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）	abclonal	AS003
成年C57BL/6雄性和雌性小鼠	湖南赛诺杰生物科技有限公司