本方案描述了一种溶血磷脂酰胆碱的两点注射法 通过 使用立体定位仪在小鼠中建立稳定且可重复的脱髓鞘模型。
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本文内容
摘要
摘要
受体介导的溶血磷脂信号通路参与多种神经系统疾病的病理生理过程，尤其是多发性硬化症（multiple sclerosis, MS）。溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LPC）是一种内源性溶血磷脂，与炎症反应相关，可快速损伤髓鞘脂质并产生毒性作用，导致局灶性脱髓鞘。本文详细介绍了一种立体定位双点LPC注射技术，通过手术方式直接在小鼠脑内诱导严重脱髓鞘，快速且稳定地建立实验性脱髓鞘损伤模型。因此，该模型与脱髓鞘疾病（特别是多发性硬化症）高度相关，有助于推动具有临床相关性的科学研究进展。此外，采用免疫荧光染色和Luxol快蓝染色方法，描绘了LPC注射后小鼠胼胝体脱髓鞘的时间进程变化。同时，利用行为学方法评估了造模后小鼠的认知功能。总体而言，溶血磷脂酰胆碱双点注射 通过 立体定位仪是一种稳定且可重复的方法，用于在小鼠中建立脱髓鞘模型，以供进一步研究。
引言
受体介导的溶血磷脂信号通路几乎参与了所有器官系统的多种生理过程1。在中枢神经系统（CNS）中，该信号通路在多发性硬化症（MS）等自身免疫性神经系统疾病的发病机制中发挥着关键作用。多发性硬化症是一种慢性免疫介导性疾病，其特征为病理性脱髓鞘和炎症反应，导致神经功能障碍和认知损害2,3。在疾病早期经历反复发作与缓解后，大多数患者最终会进展至继发进展型阶段，可能导致大脑不可逆损伤并引发残疾4。目前认为，继发进展型病程的病理学特征是由炎性病灶引起的脱髓鞘斑块5。现有的多发性硬化症治疗方法可显著降低复发风险，但对于进展型多发性硬化所导致的长期脱髓鞘损伤，仍缺乏有效的治疗手段6。因此，需要建立一种稳定且易于重复的模型，用于研究针对白质变性的临床前治疗策略。
脱髓鞘和髓鞘再生是多发性硬化症发展过程中的两个主要病理过程。脱髓鞘是指小胶质细胞在促炎表型作用下诱导轴突周围髓鞘丢失的过程7，其导致神经冲动传导减慢，并引发神经元丢失及神经系统功能障碍。髓鞘再生是一种由少突胶质细胞介导的内源性修复反应，该过程若发生障碍，可能导致神经退行性变和认知功能损....
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方案
所有动物实验程序均经中国华中科技大学同济医学院动物护理委员会批准。本研究使用成年C57BL/6雄性和雌性小鼠（野生型，WT；20–25 g；8–10周龄），小鼠购自商业来源（见 材料表）。小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）动物实验设施中，提供水和食物 随意摄取在22 °C温度和55%-60%相对湿度的标准条件下，保持12小时光照与12小时黑暗交替的循环。
1. 溶血磷脂酰胆碱（LPC）溶液的配制
- 取25 mg LPC粉末（见材料表），加入250 µL氯仿与甲醇混合溶液（1:1），溶解配制成10%的LPC溶液，并转移至500 µL离心管中。
注意：若LPC未完全溶解，可将离心管置于超声清洗仪中，在40 kHz条件下超声处理约1小时，以获得均匀溶液。 - 将溶液分装为每管3 µL，并于−80 °C保存。
注意：该溶液可保存约2年。 - 手术前，将溶液（步骤1.2）用27 µL 0.9% NaCl溶液稀释，并置于37 °C恒温水浴中保温。
注意：应在开始注射前立即配制该溶液。
2. 手术准备
- 使用32 G、2英寸针头连接5 µL....
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结果
两次注射LPC可导致更持久的脱髓鞘
LPC主要引起髓鞘的快速损伤，并对轴突完整性产生毒性作用并导致其断裂15。注射当天记为第0天。小鼠饲养时间为10至28天（10 dpi和28 dpi）。采用Luxol快蓝（LFB）染色法10评估在这些时间点小鼠的脱髓鞘面积。在两次注射模型中，与假手术组相比，10 dpi时出现显著的脱髓鞘，表明LPC的局部注射可成功诱导胼胝体脱髓鞘。至28 dpi时仍存在较高程度的脱髓鞘，提示两次注射LPC可导致持续且稳定的脱髓鞘状态（图1D-E）。
为了进一步评估髓鞘的丢失情况，选择10天作为关键时间点，此时脱髓鞘现象相对明显。通过免疫荧光染色检测降解的髓鞘碱性蛋白（dMBP），在注射LPC后第10天，dMBP在注射组中显著增加（图1F），表.......
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讨论
多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统的慢性脱髓鞘疾病，是导致青壮年神经功能障碍最常见的病因之一20。临床上，约60%–80%的MS患者在发展为继发进展型MS之前，会经历反复发作与缓解的病程21,22，并随着时间推移最终导致运动功能障碍和认知缺陷的累积23。目前尚无单一的实验模型能够涵盖该疾病在临床表现、病理特征或免疫学特性上的全部多样性24。为了模拟MS在不同阶段的病理过程和发病机制，现有三种常用的脱髓鞘动物模型，各有其优势与局限性，分别为实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型、喂饲环己亚硝脲（CPZ）动物模型以及LPC诱导的脱髓鞘模型。
在小鼠中，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）由注射髓鞘抗原后引发的免疫反应所诱导，导致小胶质细胞活化以及血管周围T和B淋巴细胞浸润，伴随的髓鞘损伤常与疾病复发相关
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82071380，81873743）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| L-α-卵黄来源的溶血磷脂酰胆碱 | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32号针头 | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl 注射器 | HAMILTON | 80014 | |
| 高速颅骨钻 | 中国台湾，韩国 | strong204 | |
| 钻孔 | Hager & Meisinger，德国 | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx 动物麻醉呼吸机 | MIDMARK | VMR | |
| 用于小鼠的便携式立体定位仪 | 奖励 | 68507 | |
| 微量注射器 | 奖励 | KDS LEGATO 130 | |
| 异氟烷 | VETEASY | ||
| 多聚甲醛 | Servicebio | G1101 | |
| 磷酸盐缓冲液 | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL 快速蓝 | Servicebio | G1030-100ML | |
| 缝合 | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| 脑模具 | 奖励 | 68707 | |
| 电子显微镜固定液 | Servicebio | G1102-100ML | |
| 中性红（C.I. 50040），用于显微镜检查，Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| 抗髓鞘碱性蛋白抗体 | Millipore | #AB5864 | |
| 抗GST-P多克隆抗体 | MBL | #311 | |
| Ki-67 单克隆抗体（SolA15） | 赛默飞世尔科技 科学的 | 14-5698-95 | |
| β-肌动蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 髓鞘碱性蛋白多克隆抗体 | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 多克隆抗体 | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure 驴抗兔 IgG（H+L） | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗大鼠 IgG（H+L） | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗兔IgG（H+L） | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP 标记的山羊抗兔 IgG（H+L） | abclonal | AS014 | |
| HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L） | abclonal | AS003 | |
| 成年C57BL/6雄性和雌性小鼠 | 湖南赛诺杰生物科技有限公司 |
参考文献
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet
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重印与许可
