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方法文章

大规模重力趋向性检测 秀丽隐杆线虫 休眠幼虫

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DOI：

10.3791/64062

⸱

2022年5月31日

 ,  ,  , 
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

本文内容

摘要

本方案概述了对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis）dauer幼虫进行大规模重力趋向性检测的方法。与基于培养皿的检测方法相比，该方案可更有效地检测重力趋向行为。

摘要

重力感知是一个重要但研究相对不足的过程。感知重力使动物能够导航周围环境并促进运动。此外，发生在哺乳动物内耳中的重力感知与听觉密切相关——因此，理解这一过程对听觉和前庭研究具有重要意义。目前已有一些模式生物的向地性检测方法，包括Drosophila。以往曾对单个线虫在溶液中沉降时的定向偏好进行过检测。然而，尚未有可靠且稳健的Caenorhabditis向地性检测方法被报道。本实验方案描述了一种可用于同时检测数百个Caenorhabditis滞育幼虫向地性的实验流程。这种大规模、长距离的检测方法可实现详细的数据采集，揭示在标准平板检测中可能被忽略的表型。通过将滞育幼虫在垂直方向上的运动与水平对照进行比较，以确保其方向性偏倚确实由重力引起。随后可在不同品系或实验条件下比较其向地性偏好。该方法可用于确定线虫向地性所需的分子、细胞及环境因素。

引言

感知地球的引力对许多生物的方向定位、运动、协调和平衡至关重要。然而，与其他感觉相比，引力感知的分子机制和神经环路仍知之甚少。在动物中，引力感知会与其他刺激相互作用，并可能被其他刺激所压制，从而影响行为。视觉线索、本体感受反馈以及前庭信息可以整合，以形成动物相对于周围环境的身体意识1,2。相反，其他刺激的存在可以改变趋重性偏好3,4,5。因此，趋重性行为是研究引力感知以及理解神经系统复杂感觉整合与决策过程的理想模型。

秀丽隐杆线虫 是一种研究向重力性的特别有用模式生物，因其具有多型性的生活史周期。在发育过程中若暴露于热、拥挤或食物缺乏等胁迫因素下， 秀丽隐杆线虫 幼虫发育为耐久型幼虫（dauers），具有极强的抗逆性6。作为滞育幼虫，线虫会表现出特征性行为，例如摇摆（nictation），即线虫 "站立" 在尾部摆动头部，这可能有助于向更适宜的栖息地扩散7. 重力定向性测定 秀丽隐杆线虫 和 C. japonica 表明滞育幼虫具有负向趋地性，且这种行为在滞育幼虫中比在成虫中更易观察到8,9. 测试其他生物的向地性 秀丽隐杆线虫 菌株可能揭示向重性行为的自然变异。

利用向地性实验，已在Euglena、Drosophila、Ciona以及多种其他物种中表征了重力感知的机制3,10,11。与此同时，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis）的向地性研究最初结果不一。一项关于C. elegans定向偏好的研究发现，线虫在溶液中倾向于头部朝下，提示其具有正向向地性偏好12。然而，尽管早期已发现C. japonica的dauer幼虫具有负向向地性8，但这种行为直到最近才在C. elegans中被描述9。在线虫中建立具有代表性的向地性实验面临若干挑战。Caenorhabditis菌株通常在琼脂平板上培养，因此行为学实验通常将琼脂平板纳入实验设计13,14,15。最早报道的Caenorhabditis向地性实验是将一个琼脂平板垂直竖立，与水平放置的对照平板呈90°角8。然而，在这些条件下，向地性行为并不总是稳定可靠。虽然成年线虫可在溶液中检测其定向偏好12，但这种方向偏好可能依赖于具体情境，当线虫处于爬行而非游动状态时，行为表现可能不同。此外，C. elegans对其他刺激（包括光和电磁场）也十分敏感16,17，这些因素会干扰其对重力的响应9。因此，开发一种能够屏蔽其他环境变量干扰的更新版向地性实验方法，对于解析该感觉过程的机制至关重要。

本实验方案描述了一种用于观察Caenorhabditis趋地性的检测方法。该实验装置部分基于一种用于研究神经肌肉完整性的方法18,19。使用标准方法培养并分离dauer幼虫20，随后将其注入由两个盛有琼脂的5 mL血清移液管制成的腔室中。这些腔室可垂直或水平放置，并置于黑暗的法拉第笼内12–24小时，以屏蔽光照和电磁场。记录每条线虫在腔室中的位置，并与参考品系（如C. elegans N2）的垂直趋性进行比较。

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方案

本研究使用的菌株为C. elegans (N2) 和 C. briggsae (AF16)（见材料表）。每次检测均使用混合性别的滞育幼虫群体。

1. 反应室准备

  1. 在通风橱中操作。使用本生灯、1-2 把剃刀刀片、钳子、镊子和塑料切割台布置工作区（见材料表）。
  2. 为每个腔室准备两支 5 mL 刻度移液管。用镊子移除其中一支移液管的棉塞。用钳子夹住剃刀刀片，在本生灯火焰上加热至发烫。使用加热后的刀片将第二支移液管的锥形末端切去，使整支移液管具有均匀的直径（图 1A）。
  3. 迅速操作，将两支经改造的移液管末端靠近火焰，使其轻微熔化。通过用力压合将两末端连接，确保两支移液管的管壁连续。若连接后可见缝隙，则应将其分开并重复此步骤（图 1A，B）。

2. 用琼脂填充小室

  1. 根据标准线虫实验流程制备含4%琼脂的NGM21。在琼脂仍处于熔融状态时，将培养室连接至移液管，缓慢吸取溶液以填充每个腔室。在将培养室从移液管上取下前，用石蜡膜密封管口。将培养室平放（与实验台平行）冷却。
    ​注意：高压灭菌后用保鲜膜（见材料表）覆盖烧瓶有助于防止溶液中产生气泡18。
    1. 为尽量减少因冷却不均导致的琼脂质地差异，在吸取琼脂时应将移液管（见材料表）保持与实验台平行。将培养室平放在实验台上，待琼脂完全凝固后再移动。
      注意：琼脂浓度和培养基成分可根据实验需求进行调整。4%琼脂比常规用于倒板的约2%浓度更坚硬，在本实验条件下可防止线虫钻入培养基内部。然而，其他研究者曾观察到成年线虫在高达9%琼脂中仍能钻入的行为18,19。
  2. 冷却后，将一个3 mm六角扳手（或尺寸相同的其他金属工具，见材料表）在本生灯上加热。将其用力压入每个腔室壁中，位置距中线约5 mm偏一侧，从而在塑料上形成一个小孔（图1C）。使用加热的刀片切去腔室的棉塞端和锥形端，并用石蜡膜密封这些开口。
    ​注意：制备完成后，每个腔室必须在1天内使用，或在4 °C下保存数天。所有暴露的开口均需用石蜡膜覆盖，以防止琼脂干燥。

3. 分离滞育幼虫

  1. 实验前 10-15 天，将每种菌株接种至 2-3 个含 OP50 细菌的大 NGM 平板上，并用石蜡膜封口。10-15 天后，每个平板应完全耗尽营养，且在琼脂表面、平板壁和盖子上存在数千条滞育幼虫。
    注意：应提前制备平板，使用浓稠的 OP50 培养基配方以实现最大程度的拥挤生长（见材料表）。滞育幼虫的形成也可通过其他方法诱导，包括添加信息素或在较高温度下培养22。
  2. 用 M9 缓冲液冲洗平板和盖子以收集线虫，并将液体转移至 15 mL 离心管中。在室温下以 1,600 × g 离心 30-60 秒，然后用移液器或真空抽吸装置吸除大部分 M9 缓冲液。
  3. 通过 1% SDS 处理结合 30% 蔗糖漂浮梯度法分离滞育幼虫，具体步骤参照先前发表的报告20。
    1. 向每个线虫沉淀中加入 7 mL 1% SDS 溶液。将线虫在 SDS 中孵育 30 分钟，期间持续旋转离心管以保证通气。用 M9 缓冲液冲洗 3-5 次以去除去垢剂。
    2. 随后，加入 5 mL M9 缓冲液，再加入 5 mL 冷却的过滤 60% 蔗糖溶液。充分混匀后，在室温下以 1,600 × g 离心 5 分钟，形成分离梯度。
  4. 取新的 15 mL 离心管，每管加入 2 mL M9 缓冲液。将玻璃巴斯德移液管的尖端敲碎以扩大孔径，用此移液管将蔗糖梯度中上层液体（含分离的滞育幼虫）转移至新管中。用 M9 缓冲液冲洗滞育幼虫 3-5 次。
    ​注意：此时溶液中已有数千条分离的滞育幼虫。可立即使用，或在 5-7 mL M9 缓冲液中持续旋转通气过夜保存。

4. 将滞育幼虫加入小室

  1. 在室温下以 1,600 x g 离心 dauers 5 分钟，并用移液器或真空抽吸装置吸除大部分 M9 溶液。为估算线虫密度，使用解剖显微镜手动计数三个独立的 1 µL 液滴中的线虫数量。取这些计数的平均值，以估算每 µL 中的线虫数量。
    注意：某些小体积移液器可能无法触及 15 mL 离心管底部；此时可先将浓缩的线虫液滴转移至一片石蜡膜上。
  2. 剪切 10、20 或 200 µL 移液器吸头的末端以扩大孔径。将微量移液器设定为略大于目标吸取体积的容量。吸取约 1–2 µL 浓缩线虫溶液（理想情况下含 100–300 条线虫），并让少量空气进入吸头。
    注意：单个腔室内线虫数量过多（1,000 条以上）可能因过度拥挤而增加移动距离的变异范围9。
  3. 在按压微量移液器的同时，轻柔地将移液器吸头插入琼脂中。此举可在琼脂中形成注射位点，同时避免吸头堵塞。将线虫释放至琼脂中，并使用石蜡膜密封开口。

5. 实验的运行与结果分析

注意：可在可能影响行为的各种条件下测试重力定向性9。

  1. 为了尽可能消除变量，将实验腔室置于室温下的黑暗法拉第笼内（见材料表）。
  2. 标记每个腔室，并使用标签胶带将其垂直悬挂在法拉第笼内。通过将部分腔室在同一环境条件下水平放置，同步进行水平对照实验。以垂直方向的N2线虫作为阳性对照，检测实验品系；以含有N2滞育幼虫（dauer）的水平腔室作为额外的阴性对照。
    注意：水平与垂直实验必须在实验室的相同环境中进行，以最大限度减少两种条件之间的环境差异。可使用大型培养箱同时容纳多个法拉第笼。
  3. 滞育幼虫在数小时后开始从起始点扩散，并需数小时才能到达腔室的任一端。在此期间请勿扰动腔室，并在注射后12–24小时内完成评分。
    注意：不要使用麻痹剂（如叠氮化钠）来固定已到达腔室末端的线虫。由于本实验测量的是线虫的整体分布情况，而非偏好指数（如双选实验中的指标），因此无需使用叠氮化钠，且其可能干扰实验结果。
  4. 逐一取出并评分重力趋向性腔室。在解剖显微镜下观察存活的滞育幼虫，并用墨水标记其位置（图1C、D）。请勿对位于注射点两侧2.5 cm范围内的线虫进行评分，因为这些线虫很可能尚未表现出方向性偏好。
    1. 同时，避免对死亡或被困在液体中的线虫进行评分。若某个腔室中死亡或游动的线虫超过>50%，则弃用该腔室。
      注意：一旦腔室被移出测试区域，应立即完成评分以确保准确性。滞育幼虫应仅出现在琼脂表面与移液管壁之间。若观察到钻孔行为，建议在后续实验中提高琼脂浓度。
  5. 为量化实验结果，使用记号笔从距离注射点2.5 cm处开始，将腔室每半侧划分为七个3.5 cm长的区段（在某些移液管上，3.5 cm对应1 mL体积）。使用手动计数器（见材料表）统计每个区段中观察到的线虫数量。
    注意：原点两侧应各有七个区段，可分别编号为-7（底部）至+7（顶部）。这些编号必须与腔室构建方式中的相对位置一致；在步骤2中，琼脂是从-7端向+7端吸入的。

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结果

比较不同物种间的重力趋向性
按照上述实验步骤，可将C. briggsae 休眠幼虫的重力趋向性与C. elegans的重力趋向性及水平对照组进行比较。C. briggsae 休眠幼虫的垂直分布（深红色）偏向于腔室顶部，大量线虫到达+7位置（图2A）。与水平对照组（青色）相比，后者中休眠幼虫在腔室中心周围呈近似钟形曲线分布，这一趋势表明其表现出负向重力趋向行为。这些数据可与在相同实验日期进行的C. elegans重力趋向性实验结果进行比较（图2B）。

采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn检验并使用Bonferroni校正进行多重比较，以确定各检测之间的显著性差异9,23。在本实验中，来自两个独立实验日的三个垂直装置中共计...

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讨论

与先前方法的比较
与趋化性不同，使用传统的琼脂平板实验设计无法可靠地观察到Caenorhabditis中的趋地性。标准培养皿的直径为150 mm，导致幼虫在任一方向上仅有75 mm的空间来表现趋地性偏好。尽管可以在溶液中检测C. elegans的方向偏好12，但该方法通量较低，因为线虫必须逐个进行分析。此外，悬浮在培养基中的线虫与在表面爬行的线虫，其趋地性偏好和行为可能存在差异。基于这些原因，我们开发了一种高通量、灵敏度更高的检测方法，可用于分析爬行或攀爬线虫的趋地性行为。由于C. elegans对光和电磁场敏感，而这两者均会干扰趋地性偏好9，因此这些实验必须在无光和无电磁刺激的条件下进行。如果使用自制的法拉第笼，建议检测其屏蔽效果并进行必要的加固。

本方案中描述的检测室长度约为 54 cm，置于法拉第笼内以屏蔽光线和电磁场。研究发现，采用"arena"来观察线虫的向地性行...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院向 JHR 提供的研究资助（#R01 5R01HD081266 和 #R01GM141493）。部分菌株由得到 NIH 研究基础设施项目办公室资助的 CGC（P40 OD010440）提供。我们感谢加州大学圣塔芭芭拉分校的 Pradeep Joshi 对本文编辑工作提供的建议。统计学咨询由加州大学圣塔芭芭拉分校 DATALAB 提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 十二烷基硫酸钠溶液从去离子水中配制的10% (w/v) SDS 储存液
15 mL 离心管Falcon14-959-53A
3 mm 六角扳手其他尺寸相似的金属工具也可使用
4% 琼脂在正常生长培养基（NGM）中 - 1 L高压灭菌前：3 g NaCl，40 g 琼脂，2.5 g 蛋白胨，2 g 葡萄糖，10 mL 尿嘧啶（2 mg/mL），500 μL-胆固醇（10 mg/mL），1 mL CaCl₂，962 mL 去离子水；高压灭菌后：24.5 mL 磷酸盐缓冲液，1 mL 1 MgSO₄（1 M），1 mL 链霉素（200 mg/mL）
5 mL 血清学移液管FisherbrandS68228C聚苯乙烯，而非硼硅酸盐玻璃
60% 冷蔗糖溶液60% 蔗糖（w/v）溶于去离子水中；通过过滤（0.45 μm）除菌 μm 滤膜）。置于 4℃ 保存 °C
AF16 C. briggsae 或其他实验品系可从线虫遗传学中心（CGC）获取
本生灯
保鲜膜Fisherbrand22-305654
临床离心机
一次性剃须刀片Fisherbrand12-640
法拉第笼可使用纸板和铝箔制作；30" L × 6" W × 26" H 或更大
记号笔Sharpie 或其他可在塑料上标记的品牌
标签胶带卡罗来纳215620
M9 缓冲液22 mM KH2PO4，42 mM Na2HPO4，86 mM NaCl
N2 秀丽隐杆线虫 菌株可从线虫遗传学中心（CGC）获取
含 OP50 的 NGM 平板1.7% (w/v) 琼脂（NGM 中，参见描述：NGM 中 4% 琼脂）。接种 OP50
石蜡膜贝米斯13-374-10
塑料砧板
钳子
旋转式垂直混合器BTLab 系统BT913配备 22 x 15 mL 管架
血清移液器康宁357469
体视显微镜LaxcoS2103LS100
计数器ULINEH-7350
厚NGM/琼脂平板培养基 - 1 L参见NGM配方中的4%琼脂；将40 g琼脂替换为20 g琼脂
镊子

参考文献

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