需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

用于基因治疗应用的造血干细胞和祖细胞CRISPR/Cas9基因编辑

3.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64064

⸱

2022年8月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Stem Cell Research (CSCR), A unit of InStem Bengaluru, Christian Medical College campus, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种优化的造血干细胞和祖细胞（HSPC）培养程序，用于高效移植基因编辑细胞 体内.

摘要

CRISPR/Cas9 是一种高度通用且高效的基因编辑工具，已被广泛用于纠正多种遗传突变。体外对造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行基因操作的可行性，使其成为基因治疗的理想靶细胞。然而，HSPCs 在体外培养过程中会适度丧失其植入能力及多谱系重constitution潜能。本研究描述了理想的培养条件，可改善 HSPC 的植入效果，并在体内产生更多基因修饰细胞。本报告展示了优化的体外培养条件，包括培养基类型、独特的小分子混合物添加、细胞因子浓度、细胞培养板类型以及培养密度。此外，还提供了一套优化的 HSPC 基因编辑流程以及基因编辑事件的验证方法。为进行体内验证，展示了将基因编辑后的 HSPCs 输注至小鼠受体及其植入后的分析过程。结果表明，该培养体系在体外提高了功能性造血干细胞的频率，从而实现了基因编辑细胞在体内的高效植入。

引言

在异基因移植环境中，人类白细胞抗原（HLA）匹配的供体难以获得，同时高效、多功能且安全的基因工程技术迅速发展，使得自体造血干细胞移植（HSCT）成为治疗遗传性血液疾病的一种根治性治疗策略1,2。自体造血干细胞和祖细胞（HSPC）基因治疗包括采集患者的HSPC，进行遗传学操作，纠正致病突变，并将基因修复后的HSPC回输至患者体内3,4。然而，基因治疗的成功依赖于可移植的基因修饰移植物的质量。基因操作步骤以及HSPC的体外培养会降低长期造血干细胞（LT-HSCs）的比例，从而影响移植物质量，因此需要回输大剂量的基因修饰HSPC2,5,6。

目前，多种小分子（包括 SR1 和 UM171）正被用于有效扩增脐带血造血干细胞和祖细胞（HSPCs）7,8对于成体HSPCs，由于动员后获得的细胞产量较高，因此不需要进行大规模扩增。然而，在分离的HSPCs中维持其干性仍至关重要。 离体 培养对于其基因治疗应用至关重要。因此，开发了一种利用小分子组合——白藜芦醇、UM729 和 SR1（RUS）——富集造血干细胞（HSCs）的培养方法。7优化的HSPC培养条件可促进HSC的富集，从而提高基因修饰HSC的频率 体内，并减少对大量HSPC进行基因操作的需求，从而促进具有成本效益的基因治疗策略的实现8.

本文详细描述了一种造血干细胞和祖细胞（HSPCs）培养的综合方案，以及基因编辑细胞的输注与分析方法 体内.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

在印度韦洛尔基督教医学院机构动物伦理委员会（IAEC）的批准并遵循其指南的情况下，开展了针对免疫缺陷小鼠的体内实验。在获得机构审查委员会（IRB）批准后，通过知情同意从健康人类供体采集粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员的外周血样本。

1. 外周血单个核细胞（PBMNCs）的分离与CD34+细胞的纯化

  1. 按照以下步骤进行外周血单个核细胞（PBMNC）的分离。
    注意：进行体外（in vitro）造血干细胞/祖细胞（HSPC）培养和基因编辑时，每组起始细胞数至少为 1 × 106 个 HSPC 较为理想。若进行体内（in vivo）移植分析，每组包含八只小鼠，且每只小鼠至少输注 6 × 105 个细胞，则每组起始细胞数至少为 5 × 106 个 HSPC 较为理想。为获得足够数量的 PBMNC（约 1 × 109），建议起始使用 20 mL 动员后的外周血（mPB）。
    1. 采集动员后外周血（mPB）后，将 20 mL mPB 与无菌的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:1 比例稀释。
      注意：不同个体间粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员效率可能存在差异9，因此从 20 mL 动员血中获得的 HSPC 数量在不同供体间也会有所不同。
    2. 向 50 mL 离心管中加入 10 mL 密度梯度介质（Lymphoprep，参见材料表），然后沿管壁以 1:2 比例将稀释后的血液缓慢铺加在密度梯度介质上层。
      注意：在加入稀释血液时，将 50 mL 离心管倾斜约 20° 角，可防止血液与 Lymphoprep 混合，从而在离心后实现血液成分的清晰分层。
    3. 在室温（RT）下以 600 × g 离心 30 分钟，加速度为 1 m/s²，减速度为 1 m/s²。使用移液管弃去上层液体（血浆），收集位于密度梯度介质层上方界面处的白膜层（即 PBMNCs）。
      注意：使用移液管吸取白膜层时，应轻轻旋转管壁以收集细胞。吸取过程中应避免吸取过多界面层液体，以防粒细胞和红细胞污染。
    4. 将 PBMNCs 转移至新的 50 mL 锥形离心管中，并用 1× PBS 按 1:2 比例稀释细胞悬液。
      注意：若在吸取白膜层时收集了过多界面层物质，则应使用 1× PBS 按 1:4 比例稀释细胞悬液。
    5. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，加速度为 9 m/s²，减速度为 7 m/s²，使用移液管弃去上清液。向沉淀中加入 30 mL 冰冷的红细胞裂解缓冲液（参见表 7），冰上孵育 10 分钟。每 2 分钟轻轻颠倒混匀一次。
    6. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，加速度为 9 m/s²，减速度为 7 m/s²，弃去上清液。重复步骤 1.1.5–1.1.6，直至沉淀不再呈红色。用基础培养基（IMDM，参见材料表）重悬细胞沉淀，并使用台盼蓝染色在血细胞计数板（Neubauer chamber）中进行细胞计数10。
      注意：分离得到的 PBMNCs 可立即用于 CD34+ HSPC 的纯化。或者，也可将 PBMNCs 冻存，在需要时复苏并进行 CD34+ 富集。冻存时，取 5 × 108 个细胞在 200 × g 条件下离心 5 分钟，加入 4 mL 冻存液（含 IMDM: FBS: DMSO，比例为 7:2:1，参见材料表）。
    7. 将冻存管转移至 −1 °C 程序降温仪中，于 −80 °C 保存最多 12 小时。随后转移至液氮罐中进行长期保存。
  2. 复苏冻存的 PBMNCs。
    1. 在 37 °C 水浴中轻轻旋转，使冻存管半融化，时间小于<1 分钟。将冻存管中的细胞悬液转移至含有 IMDM 的 50 mL 离心管中，比例为 1:10。
    2. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，加速度为 9 m/s²，减速度为 7 m/s²，使用移液管弃去上清液。
  3. 按照以下步骤从 PBMNCs 中纯化 CD34+ 细胞。
    1. 使用含 2% 过滤胎牛血清（FBS）的无菌 1× PBS 配制纯化缓冲液。根据表 1，用该缓冲液重悬 PBMNC 细胞沉淀。
      注意：该缓冲液必须不含 Ca++ 和 Mg++。
    2. 将含有 1 × 108–5 × 108 个新鲜或冻存 PBMNCs 的细胞悬液转移至 5 mL 聚苯乙烯圆底管中（参见 材料表）。
      注意：向细胞悬液中加入脱氧核糖核酸酶（DNase，参见材料表），终浓度为 100 µg/mL，以防止细胞聚集。本实验使用市售的 CD34 纯化试剂盒，包含人 CD34 阳性选择混合液和葡聚糖快速磁珠（参见材料表）。
    3. 按每毫升细胞悬液加入 100 µL 的比例，加入市售的人 CD34 阳性选择混合液（参见材料表），并轻轻重悬。
    4. 室温孵育 30 分钟，每 5 分钟轻轻重悬一次细胞悬液。然后按每毫升细胞悬液加入 50 µL 的比例，加入市售的葡聚糖快速磁珠（参见材料表），并轻轻重悬。
      注意：使用涡旋振荡器高速振荡磁珠 5 秒，确保颗粒均匀分散后再加入细胞中。
    5. 室温孵育 15 分钟，每 5 分钟轻轻重悬一次细胞悬液。用纯化缓冲液将细胞悬液总体积调至 2.5 mL，并轻轻重悬。
    6. 将离心管放入市售的无柱免疫磁力架中（参见材料表），室温孵育 5 分钟。孵育结束后，翻转磁力架，一次性连续弃去上清液。
      注意：被葡聚糖快速磁珠标记的 CD34+ 细胞在磁场作用下会吸附在管壁两侧。翻转后应保持倒置状态 2–3 秒。避免抖动或擦拭管口悬挂的液滴。
    7. 将离心管从磁力架上取下，加入 2.5 mL 纯化缓冲液。重复步骤 1.3.6–1.3.7 共五次。
      注意：加入纯化缓冲液时，应将离心管倾斜一定角度，并通过旋转混匀，因为在翻转磁力架过程中细胞可能已黏附于管壁。
    8. 完成五次洗涤后，将离心管从磁力架上取下，加入 4 mL 无菌 1× PBS，重悬细胞。将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，并用 1× PBS 补充至 10 mL。使用台盼蓝染色在血细胞计数板（Neubauer chamber）中进行细胞计数10。
    9. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟（加速度约 9 m/s²，减速度约 7 m/s²），用移液器弃去上清液。为进行 HSPC 培养，将细胞重悬于 HSPC 培养基中，具体如步骤 2.1 所述。
      注意：纯化后的多余 HSPCs 在 HSPC 培养基中培养 12 小时后，以 9 × 106 个细胞/mL 的密度冻存于市售的冻存液中（参见材料表）。
  4. 复苏冻存的 HSPCs。
    1. 在 37 °C 水浴中轻轻旋转，使冻存管融化时间小于<1 分钟。将冻存管中的细胞悬液转移至 50 mL 离心管中。
    2. 在持续搅拌下逐滴加入用 1× PBS 重悬的 1% BSA 溶液，总体积补至 20 mL。在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，加速度为 9 m/s²，减速度为 7 m/s²，使用移液管弃去上清液。
    3. 重复步骤 1.4.2 一次。将细胞重悬于 HSPC 培养基中，并按步骤 2.1 所述进行培养。

2. 体外 纯化HSPC的培养

  1. 使用 SFEM-II 培养基，添加 SCF（240 ng/mL）、FLT3（240 ng/mL）、TPO（80 ng/mL）、IL6（40 ng/mL）和 1x 抗生素-抗真菌剂（参见材料表）配制培养液。
    注意：强烈建议使用新鲜配制的培养液。然而，培养液在配制后可在 4 °C 保存最多 24 小时。
  2. 用培养液重悬 CD34+ 沉淀，每毫升培养液中加入 3 µL RUS 混合液（白藜芦醇 10 µM；UM729 500 nM；StemReginin-1 750 nM；参见材料表），并将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
    注意：UM171（10 nM）可替代 UM729（500 nM），两者在维持 HSPC 干性方面具有相似效果7。试剂管冻融次数不得超过两次。
  3. 初始接种时，将纯化的细胞以 5 × 105/mL 的密度接种于市售的表面经 delta 处理的 6 孔板中（参见材料表），以去除贴壁细胞。
  4. 在纯化后 6 小时，将细胞重新接种至新的 6 孔板中，密度为 2 × 105 个细胞/mL，保持悬浮状态。
  5. 在基因编辑前，通过流式细胞术对 HSPC 的干性进行表征。
    1. 进行流式细胞术分析时，取 1 × 105 个细胞置于 100 µL 1x PBS 中，加入 3 µL（75 ng）CD34 PE 抗体、4 µL（100 ng）CD133 FITC 抗体和 4 µL（100 ng）CD90 APC 抗体（参见材料表）。
    2. 将离心管在室温避光孵育 20 分钟。用 2 mL 1x PBS 洗涤细胞两次，每次以 200 × g 离心 5 分钟，室温操作。用移液器弃去上清液，将细胞沉淀用 150 µL 1x PBS 重悬，并上机进行流式细胞术检测。
      注意：若 CD34+ 细胞比例<90%，可在步骤 1.3.7 中将洗涤次数增加至最多六次 。将纯化的 HSPC 接种于培养液中，6 小时后仅收集悬浮细胞。大多数 CD34- 细胞会贴附于培养板表面。

3. HSPC 的基因编辑

  1. 进行向导RNA的重悬。
    注意：靶向CCR5位点并带有硫代磷酸酯修饰的合成sgRNA购自商业来源（见材料表）。
    1. 重悬时，将恒温混匀仪设为37 °C，并将1x TE缓冲液（见材料表）在37 °C预热10分钟。将合成的化学修饰sgRNA管在4 °C、11,000 x g条件下离心1分钟。
    2. 向含有1.5 nM冻干sgRNA的管中加入15 µL 1x TE缓冲液，得到终浓度为100 pM/µL。轻柔吹打最多5次，使枪头在管壁角落处旋转混匀。
    3. 在恒温混匀仪中37 °C孵育30–40秒，轻微振荡。短暂离心后，收集15 µL sgRNA，并分装为每份1 µL（100 pM/µL），于−80 °C保存，可使用长达1年。
      注意：避免反复冻融。建议分装后的gRNA最多仅进行一次冻融循环。
  2. 按照以下步骤进行核转染。
    1. 培养第3天，使用改进型Neubauer细胞计数板对细胞进行计数10。
    2. 进行RNP复合物制备（用于转染2 x 105个细胞）：取1 µL靶向CCR5基因的sgRNA（100 pM）加入0.5 mL离心管中，再加入2.65 µL Cas9蛋白（50 pM），通过轻柔涡旋混匀管底液体。室温孵育10分钟。
      注意：gRNA序列：(CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG。
    3. 缓冲液制备：取16.4 µL P3原代细胞溶液和3.6 µL补充剂（随商业核转染试剂盒提供，见材料表），室温孵育10分钟。同时准备培养基（步骤2.1），并在核转染前将其在培养板中37 °C预温。
    4. 将2 x 105个细胞在室温下以200 x g离心5分钟，用移液器小心弃去上清液，避免扰动沉淀。用步骤3.2.3中配制的20 µL缓冲液重悬细胞沉淀，并轻柔混匀。
    5. 将细胞悬液与已制备的RNP复合物（步骤3.2.2）轻柔混合，避免产生气泡。将混合液转移至商业核转染条（见材料表），选择脉冲代码DZ100，使用4D核转染仪（见材料表）进行电穿孔。
      注意：包括缓冲液和RNP组分在内的细胞悬液最终体积不得超过27 µL/次电穿孔。
    6. 作为实验对照，将2 x 105个未经编辑的HSPCs在室温下以200 x g离心5分钟，弃去上清，用步骤3.2.3中配制的20 µL缓冲液重悬细胞沉淀，不加入RNP复合物。
    7. 向电穿孔后的细胞中加入100 µL预温的培养基（步骤3.2.3），在核转染条中室温静置10分钟。孵育10分钟后，根据实验需求将细胞转移至培养板。
      注意：本方案可用于通过非同源末端连接（NHEJ）介导的基因组特定位点的靶向破坏，只需使用位点特异性的gRNA。若在步骤3.2.2中加入双gRNA，也可用于引入大片段缺失11。此外，在RNP孵育10分钟后，若提供供体模板，本方案也可用于同源定向修复（HDR）介导的基因编辑12。该方案已成功验证可用于AAVS1、伪β-珠蛋白、β-珠蛋白以及CCR5位点的靶向破坏7,8。

4. 在造血干细胞和祖细胞中验证基因编辑事件

  1. 进行DNA提取。
    1. 转染后72小时，使用台盼蓝染色并在血细胞计数板中进行细胞计数。收集1 × 10⁶细胞5 用于DNA提取的基因编辑HSPCs。
    2. 以 11,000 x g 离心细胞 g 在室温下孵育5分钟，用移液器弃去上清液。加入1 mL 1×PBS重悬沉淀，重复离心并弃去上清液。向沉淀中加入20 µL快速提取液（参见 材料表) 对于 1 × 105 细胞并重悬沉淀。
    3. 在68 °C条件下，将混合物于PCR仪中孵育30分钟。短暂离心后，将混合物在98 °C条件下于PCR仪中孵育10分钟。使用分光光度计测定粗裂解液中DNA的浓度。13.
  2. 通过PCR扩增基因编辑位点。
    1. 使用 Primer3（参见 材料表），设计跨越双链断裂（DSB）位点的位点特异性引物，扩增子大小范围为400-700 bp（表 2).
      注意：Primer3 是一种基于网络的开源工具，用于设计 PCR 引物。
    2. 按照所提供的方案配制反应混合物 表3 并按照文中所述的循环条件运行热循环仪 表4. 为确认目标位点的扩增，取5 µL PCR产物与6x上样缓冲液混合，加载至使用TAE缓冲液制备的2%琼脂糖凝胶进行电泳。
      注意：TAE 缓冲液组分已提供 表7.
    3. 运行30-40分钟，电压为100 V，并使用凝胶成像系统检测扩增产物（参见 材料表）。根据PCR纯化试剂盒生产商的说明书（参见 材料表），纯化扩增的PCR产物。
    4. 测量 使用纳米滴定仪测定纯化后PCR产物的浓度（参见 材料表).
  3. 按照以下步骤进行Sanger测序及游离染料终止子的去除。
    1. 按照下表准备反应混合物 表5. 使用所述的循环条件运行热循环仪 表6.
    2. 加入10 µL HighPrep DTR试剂（参见 材料表向1.5 mL离心管中的10 µL PCR样品中加入40 µL 85%乙醇，通过剧烈吹吸8–10次混匀。
    3. 室温孵育混合物5分钟，将1.5 mL离心管置于磁力分离架上静置5分钟。用移液器吸除上清液，加入100 µL 85%乙醇。
    4. 弃去上清液，重复步骤 4.3.3 一次。将 1.5 mL 离心管从磁力架上取出，置于恒温混匀仪中在 37 °C 下孵育 10 分钟，以挥发乙醇。
    5. 用力将珠粒重悬于40 µL无核酸酶水中，室温孵育5 min。将离心管置于磁力分离架上静置5 min，随后按照已发表文献进行Sanger测序。14,15.
  4. 通过 ICE 分析进行插入缺失频率评估16.
    1. 使用 Synthego（参见 材料表用于ICE分析。
    2. 上传编辑和未编辑样本的 ab1 文件以及 gRNA 序列，点击分析以获得插入缺失（Indels）的频率。

5. 基因编辑造血干细胞的移植

  1. 对市售的 NOD scid gamma 小鼠（NSG）17 和 NOD.CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ（NBSGW）18 小鼠（参见材料表）进行骨髓移植前的预处理。
    1. 对于 NSG 小鼠的预处理，选择 6–8 周龄的雌性小鼠，并通过盲法随机化将其分为对照组和基因编辑组。
    2. 将 NSG 小鼠放入派式笼中，在造血干细胞移植前 6–8 小时，使用市售辐照仪（参见材料表）以 3.5 Gy 剂量进行辐照。
      注：建议在辐照前称量小鼠体重，仅对体重 >20 g 的小鼠进行辐照。
    3. 对于 6–8 周龄的雄性和雌性 NBSGW 小鼠的预处理，在造血干细胞移植前 48 小时，通过腹腔（IP）注射给予白消安（参见材料表），剂量为每公斤体重 12.5 mg。
      注：白消安预处理可提高人源造血干细胞在小鼠骨髓中的植入率，并减少对高剂量基因编辑造血干细胞输注的需求19。白消安预处理的理想剂量范围为每公斤体重 10–15 mg。剂量过高将导致严重死亡率。
  2. 制备用于骨髓移植的细胞悬液。
    1. 将基因编辑后的造血干细胞在核转染条中孵育 10 分钟后（见步骤 3.2.7），将细胞悬液转移至 10 mL 的 1× PBS 中，使用改进型 Neubauer 细胞计数板10进行细胞计数。
    2. 每只为小鼠输注时，取 6 × 105 个细胞于 1.5 mL 离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟形成细胞沉淀，用移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀。用 100 µL 的 1× PBS 重悬细胞沉淀。
  3. 通过尾静脉注射输注造血干细胞，操作步骤如下。
    1. 将已完成预处理的 NSG 或 NBSGW 小鼠放入小鼠固定器中（参见材料表）。
    2. 握住小鼠尾巴，轻轻推动固定器插销以固定小鼠。用 70% 乙醇轻轻擦拭小鼠尾巴。用 31 G 胰岛素注射器吸取 100 µL 细胞悬液。
      注：应通过轻弹注射器或缓慢移动活塞，严格避免输注液中产生气泡。
    3. 将红外灯的光线照射在尾巴上 30–40 秒，同时用纸巾折叠覆盖小鼠身体部分。以约 20° 角度，将针头斜面轻轻插入左侧或右侧尾静脉。
    4. 用左手食指托起尾巴，使其与注射器保持在同一平面轴线上。推动活塞，将细胞悬液注入静脉。用纸巾在穿刺部位施加轻柔压力，随后拔出针头。
    5. 持续轻压 30 秒后，将小鼠从小鼠固定器中取出，并放回其笼中。

6. 短期植入潜能的评估

  1. 在人源HSPC移植4周后，使用巴斯德吸管经眶静脉窦采集血液至肝素化试管中，以评估短期植入情况。
    1. 在采样前，通过腹腔（IP）注射给予动物氯胺酮（90-120 mg/kg）和赛拉嗪（8-12 mg/kg）进行麻醉。
      注意：轻轻按压麻醉小鼠的后肢，以确认感觉丧失。
    2. 麻醉后，将动物置于俯卧位，并轻轻抓住小鼠颈背部皮肤以打开眼睛，使眼球轻微突出。
    3. 将巴斯德吸管以30°-45°角轻轻插入眼内眦处瞬膜下方。当巴斯德吸管到达适当位置后，对吸管施加轻微压力并开始轻柔旋转。
      注意：一旦刺破眶后静脉丛，血液将通过毛细作用进入吸管。
  2. 采集50-80 µL外周血后，从眼内眦处轻轻撤出吸管。
    1. 为停止眼部周围的出血，闭合眼睑并用一块纱布轻轻按压。
  3. 使用相应的抗体（表8）对细胞进行染色，并在室温下避光孵育25-30分钟。
  4. 对于红细胞裂解，向细胞悬液中加入3 mL 1x红细胞裂解缓冲液（表7），并在冰上孵育10分钟。
    1. 在室温下以200 x g 离心5分钟，用移液器弃去上清液。重复步骤6.4，直至沉淀中的红色消失。
    2. 加入2 mL 1x PBS，于室温下以200 x g 离心5分钟，以去除与红细胞裂解相关的细胞碎片。
    3. 向沉淀中加入150 µL 1x PBS，随后进行免疫表型分析，通过流式细胞术评估植入的人源细胞百分比7。

7. 长期植入潜能的评估

  1. 处死小鼠。
    1. 在移植后第16周，通过在小鼠笼内通入100% CO2窒息法处死移植小鼠，持续1-2分钟20。
    2. 通过确认心脏和呼吸停止以及后肢轻度夹捏无肌肉运动来确认小鼠死亡 。若上述两项条件均满足，则将小鼠从笼中移出。
    3. 为评估人源细胞嵌合率，从小鼠骨髓中收集细胞。
  2. 按照以下步骤从骨髓中分离细胞。
    1. 处死后，在尿道上方1 cm处做垂直切口，延伸至横膈膜下方1 cm处。在切口四角做横向剪切，充分暴露腹腔区域。
    2. 分离股骨和胫骨，使用剪刀去除附着在股骨和胫骨上的软组织。用纸巾轻轻擦拭，并用手术刀在0.5 mL微量离心管底部打一个直径不超过0.2 cm的小孔。
    3. 用手术刀切除骨的近端，将骨骼切割面朝下放入0.5 mL微量离心管的小孔中。将装有骨骼的0.5 mL管置于含有100 µL无菌1×PBS的1.5 mL管中。
    4. 盖紧管盖，在室温下以1000 × g离心3分钟（无菌条件下），弃去含有骨骼且骨髓腔已空的0.5 mL管。向含有骨髓的1.5 mL反应管中加入1 mL 1×PBS，使用1 mL移液器轻轻重悬细胞，吹打不少于10次。
    5. 将1 mL细胞悬液转移至含有9 mL红细胞裂解缓冲液的15 mL管中。将细胞置于冰上孵育7分钟，每隔2分钟轻轻颠倒混匀一次。
    6. 7分钟后，在室温下以200 × g离心5分钟，加速度设为9 m/s²，减速度设为7 m/s²。重复步骤7.2.5，直至观察到清晰的淡白色沉淀。
    7. 用10 mL无菌1×DPBS重悬细胞，并通过置于15 mL管上的40 µm细胞筛网过滤骨髓细胞悬液。用2 mL 1×PBS冲洗细胞筛网2次，每次2 mL，以避免细胞损失。
    8. 在室温下以200 × g离心5分钟，用移液器弃去上清液。用10 mL含DNase-I（工作浓度为100 µg/mL）的IMDM重悬细胞。
    9. 取1 × 106个单个核细胞置于FACS管中，用于流式细胞术分析植入情况。为评估植入骨髓单个核细胞中的基因编辑频率，将1 × 106个单个核细胞在室温下以11,000 × g离心5分钟，用移液器弃去上清液。

8. 免疫表型分析

  1. 在使用抗体染色前，将骨髓细胞与1.5 µL纯化的重组人Fc蛋白（见材料表）在4 °C孵育15分钟。
    注意：此处使用的人Fc蛋白可阻断由IgG受体介导的非特异性抗体染色，从而提高抗体标记的特异性7,21,22。在对靶细胞进行抗体染色前，应先进行抗体滴定。进行多色流式细胞术分析时，强烈建议设置FMO对照和同型对照。
  2. 为通过流式细胞仪测定人细胞植入百分比，取1 × 106个单个核细胞置于FACS管中，并按照表8所述进行细胞染色。
  3. 将细胞在室温避光孵育25–30分钟，于室温以200 × g离心5分钟，用移液器弃去上清液。
  4. 使用流式细胞仪检测细胞，利用单个核细胞的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）对细胞群（P1）设门，并根据细胞群调整电压。在P1细胞群中采集50,000个细胞事件。
  5. 为分析小鼠骨髓中的人白细胞群体，使用流式细胞数据分析软件（见材料表），从P1细胞群中设门获取人CD45+细胞和小鼠CD45.1细胞。
  6. 使用以下公式计算人细胞的植入率8：
    % 植入率 = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100。
    注意：人细胞植入的阈值定义为CD45阳性率≥0.1%。
  7. 进一步分析人CD45+细胞中hCD34+细胞的比例，以评估长期重建造血细胞。为评估植入人细胞的多谱系重建能力，按照表9对100 µL细胞悬液进行染色。
    注意：实验前需对抗体进行滴定。
  8. 使用流式细胞分析软件，从P1细胞群中设门获取hCD45细胞，并在hCD45细胞中定量分析hCD19、hCD3和hCD13（淋巴系和髓系 亚群）的比例。

9. 植入骨髓单个核细胞中基因编辑频率的评估

  1. 向骨髓单个核细胞沉淀中加入 50 µL 快速提取液（参见材料表），用于 5 x 105 个细胞，并重悬沉淀。
  2. 将混合物在PCR仪中于 68 °C 孵育 30 分钟。短暂离心后，再将混合物在PCR仪中于 98 °C 孵育 10 分钟。
  3. 使用分光光度计测定粗裂解液中DNA的浓度。按照步骤 4.2–4.4 进行操作，通过ICE分析验证基因编辑频率8,15。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本研究确定了有利于维持CD34表达的理想HSPC培养条件+CD133+CD90+ 造血干细胞在 离体 培养。为了展示造血干细胞（HSCs）在培养过程中的富集效果以及基因修饰HSCs的高效生成，本文优化了外周血单个核细胞（PBMNC）分离、CD34+ 细胞纯化、培养、基因编辑、移植、植入特性鉴定及基因修饰细胞 体内 提供的（图1）。纯化后，通过流式细胞术检测HSPC标志物，并将HSPCs培养72小时。培养72小时后，使用Cas9核糖核蛋白（RNP）对HSPCs进行核转染，并继续培养额外2天。含有RUS cocktail的优化培养条件显示出更高的细胞活力和更高比例的CD34+CD133+CD90+ 造血干细胞和提高的基因编辑频率（图2）以进一步证明优化后的培养条件可提高基因修饰细胞的频率 体内 第3天靶向HSPCs的 ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

HSPC基因治疗的成功结果主要依赖于移植物中可植入HSC的质量和数量。然而，HSC的功能特性在基因治疗产品的制备阶段会受到显著影响，包括 体外 与基因操作过程相关的培养和毒性问题。为了克服这些限制，我们已确定了理想的HSPC培养条件，能够维持CD34+CD133+CD90+ 造血干细胞在 ex 体内 培养。许多研究团队已使用 SR1 或 UM171 或其他分子作为单一分子来扩增脐带血（UCB）造血干细胞和祖细胞（HSPCs） 体外23,24之前的一项研究联合使用了SR1和UM17125培养基中的小分子和细胞因子经过专门优化，适用于动员后的成人造血干细胞和祖细胞（HSPCs）及其在自体基因治疗中的应用。筛选实验表明，联合使用三种小分子——白藜芦醇（Resveratrol）、UM729 和 SR1，对于获得高数量的 CD34⁺ 细胞至关重要。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

作者希望感谢CSCR流式细胞术平台和动物实验平台工作人员的支持。A. C. 获得了印度医学研究理事会（ICMR）高级研究员奖学金的资助，K. V. K. 获得了印度科学技术部（DST）-INSPIRE奖学金的资助，P. B. 获得了印度科学与工业研究理事会（CSIR）-JRF奖学金的资助。本研究工作由印度政府生物技术部资助（项目编号：BT/PR26901/MED/31/377/2017 和 BT/PR31616/MED/31/408/2019）

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4D-Nucleofector® X射线单位龙沙生物科学AAF-1003X
4D-Nucleofector™ X试剂盒（16孔Nucleocuvette）™ 条带龙沙生物科学V4XP-3032
抗生素-抗真菌素（100X）赛默飞世尔科技15240096
抗人 CD45 APCBD BIOSCIENCE 555485 
抗人 CD13 PEBD 生物科学555394
抗人CD19 PerCPBD BIOSCIENCE340421
抗人 CD3 PE-Cy7BD BIOSCIENCE557749
抗人CD90 APCBD BIOSCIENCE561971
抗人CD133/1 Miltenyi Biotec130-113-673
抗人 CD34 PEBD BIOSCIENCE348057
抗小鼠 CD45.1 PerCP-Cy5BD BIOSCIENCE560580
Blood Irradiator-2000 印度生物技术部（BRIT）BI 2000 
细胞培养皿（经delta表面处理的6孔板）NUNC（THERMO SCIENTIFIC）140675
CrysoStor CS10BioLife Solutions#07952
白消安CELON 实验室（60毫克/10毫升）- 
Guide-it 重组 Cas9TAKARA BIO632640
Cas9-eGFPSIGMAC120040 
 15 ml离心管CORNING430790
 50 ml 离心管NUNC（THERMO SCIENTIFIC）339652
DMSOMPBIO219605590
DNA酶STEMCELL TECHNOLOGIES6469
杜尔贝科′磷酸盐缓冲液 - 1XHYCLONESH30028.02
EasySep™ 人CD34阳性选择试剂盒IISTEMCELL TECHNOLOGIES17856
EasySep 磁铁STEMCELL TECHNOLOGIES18000
电泳仪橙色印度HDS0036
FBS赛默飞世尔科技10270106
流式细胞仪 – ARIA IIIBD BIOSCIENCE- 
FlowJo BD BIOSCIENCE -
Flt3-LPEPROTECH300-19-1000
凝胶成像系统细胞生物科学11630453
HighPrep DTR 试剂MAGBIOGENOMICSDT-70005
人BD Fc阻断剂BD BIOSCIENCE553141
IL6PEPROTECH200-06-50
IMDM 培养基赛默飞世尔科技12440053
红外灯MURPHY-
胰岛素注射器 6mm 31GBD BIOSCIENCE324903
氯胺酮KETMIN 50-
6X 上样缓冲液TAKARA BIO9156
LymphoprepSTEMCELL TECHNOLOGIES7851
小鼠固定器AVANTORTV-150
纳米滴分光光度计赛默飞世尔科技ND-2000C
血细胞计数板ROHEM INSTRUMENTSCC-3073
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）杰克逊实验室RRID:IMSR_JAX:005557
NOD，B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41（NBSGW）杰克逊实验室RRID:IMSR_JAX:026622
Nunc delta 6孔板THERMO SCIENTIFIC140675
聚苯乙烯圆底管BD352008
P3 原代细胞核转染溶液龙沙生物科学PBP3-02250
巴斯德吸管FISHER SCIENTIFIC13-678-20A
PCR 纯化试剂盒TAKARA BIO740609.25
小鼠Pie笼FISCHER SCIENTIFIC50-195-5140
聚苯乙烯圆底试管（12 x 75 mm）STEMCELL TECHNOLOGIES38007
Primer3白头生物医学研究所https://primer3.ut.ee/
QuickExtract™ DNA提取液LucigenQE09050
白藜芦醇STEMCELL TECHNOLOGIES72862
SCFPEPROTECH300-07-1000
SFEM-IISTEMCELL TECHNOLOGIES9655
sgRNASYNTHEGO- 
SPINWINTARSON1020
StemRegenin 1STEMCELL TECHNOLOGIES72342
ICE分析工具SYNTHEGOhttps://ice.synthego.com/
Tris-EDTA缓冲液（TE）1XSYNTHEGO提供 gRNA 
PCR仪应用生物系统公司4375305
TPOPEPROTECH300-18-1000
台盼蓝HIMEDIA 实验室TCL046
UM171STEMCELL TECHNOLOGIES72914
UM729STEMCELL TECHNOLOGIES72332
赛拉嗪赛拉克辛 - 印度免疫有限公司-

参考文献

  1. Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).
  2. Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958(2019).
  3. Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
  4. Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253(2020).
  5. Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
  6. Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
  7. Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
  8. Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684(2022).
  9. Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
  10. Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).
  11. Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
  12. Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500(2021).
  13. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  14. Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
  15. Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421(2020).
  16. Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
  17. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  18. McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
  19. Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
  20. Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
  21. Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
  22. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
  23. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  24. Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
  25. Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).
  26. Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  27. Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
  28. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

造血干细胞体外培养核转染流式细胞术骨髓分析CD34阳性细胞
用于基因治疗应用的造血干细胞和祖细胞CRISPR/Cas9基因编辑
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。